GM-CSF对牙周膜和牙髓成纤维细胞的生物学作用
作者：孙叶芳 刘晗 吉兰 史俊南 李强 张郁
单位：孙叶芳(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；刘晗(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；吉兰(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；史俊南(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；李强(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；张郁(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)
关键词：GM-CSF； 牙周膜成纤维细胞； 牙髓成纤维细胞； MTT ； ALP
牙体牙髓牙周病学杂志000205 【摘 要】 目的：观察GM-CSF对牙周膜成纤 维 细胞、牙髓成纤维细胞的生物学作用。方法：原代培养牙髓成纤维 细胞、牙周膜成纤维细胞，用MTT法测定细胞增殖，酶动力学方法测定ALP活性。 结果：在观察期(3～7d)GM-CSF可使两种细胞出现明显的增殖，而不能诱导ALP 的表达。结论：GM-CSF的浓度在0.001～1mg/L之间对 牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞有明显的增殖效应，大于1mg/L时对增殖有明显的抑制 作用。
, 百拇医药
【中图号】R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)02-0069-02
Bio-effects of GM-CSF on periodontal ligament and pulpal fibroblast
SUN Ye-fang, LIU Han, JI Lan, et al
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
【Abstract】 AIM: Investigation of bio-effects of GM- CSF on periodontal ligament and pupal fibroblasts. METHODS: Detection of the cell proliferation by MTT method and ALP expression by enzyme dynamics method.RESUTLS: Significant proliferation of the two types of cel ls could be observed and no ALP expression was induced by GM-CSF within 7 days of culture time. CONCLUSION: GM-CSF had dual effects on the cell growth,it could inhibit the fibroblasts proliferation at concentration abov e 1mg/L while stimulate the cell growth at concentration between 1mg/L and 0 .001mg/L.
, 百拇医药
【Key words】 GM-CSF; pulpal fibroblasts; periodontal ligamen t fibroblasts； MTT； ALP
牙髓成纤维细胞是牙髓组织的主要细胞成分，它在维 持牙髓组织的生物学功能中发挥非常重 要的作用。牙周膜成纤维细胞为牙周膜组织的重要成分，对牙周组织损伤修复起到重要的作 用 [1]，GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)作为一种细胞因子可促进骨髓干细胞 的分化增殖，其应用范围越来越广，且受到临床的重视。本文就其对牙周膜成纤维细胞、牙 髓成纤维细胞的增殖和成骨样趋势进行了探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
rhGM-CSF：由本实验室构建GM-CSF质粒，转化E.coli。经表达，包涵体制备，变性，复 性纯化，获得高纯度(98.7 %)、高比活性(2.30×107/mg蛋白)rhGM-CSF(本产品已获国家生物制品Ⅱ类新药证书)。
, http://www.100md.com
DMEM、胎牛血清(FCS)(GIBCO公司产品)。Triton X-100、MTT、胰酶(Sigma公司产品)。 培养瓶、培养板(Nunc公司产品)，ALP试剂盒(BGH，Taiwan)。
1.2 方法
1.2.1 细胞制备
取10～20岁因正畸或阻生需要拔除的健康人牙，刮取牙周膜组织和取牙髓组织剪碎 ，以含15 0ml/L FCS的DMEM，50ml/L CO2，饱和湿度，37℃培养。将第5代牙髓成纤维细胞、牙周膜 成纤维细胞，以2.5g/L胰酶消化，加入含150ml/L FCS的DME M培养 液充分吹打调整细胞浓度至2×107/L。接种于96孔板，每孔100μl。观 察细胞贴壁后，吸去培养基，改用含20ml/L FCS的DMEM，继续培养24h后备用。
1.2.2 GM-CSF制备
, 百拇医药
以含20ml/L FCS的DMEM培养基配制10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001mg/L的工作浓度。
1.2.3 细胞增殖测定
将制备的牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞上清弃去，加入不同浓度的GM-CSF 10 0μl，每组4孔，对照孔加含20ml/L FCS的DMEM 100μl。50ml/L CO2，饱 合湿度, 37℃ 培养，分别在24、48、72、96h取牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞各1板，加入20μl M TT溶 液(5g/L)。继续培养4h终止，弃上清，加入150μl DMSO振荡20min，490nm波长测A值。
1.2.4 ALP活性检测
对加入不同浓度的GM-CSF的牙髓成纤维细胞，分别在3、5、7d取板1块加入3g/L Triton X-100 20μl，置4℃过夜，观察无完整细胞后混匀，加入2×检测底物液50μl，混 匀，37℃、30min终止。410nm波长测A值。
, 百拇医药
2 结果
细胞增殖：10、1mg/L浓度的GM-CSF对牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞生长有抑制作用 。0.1、0.01、0.001mg/L浓度有促进作用(P<0.05)。0.0001mg/L浓度则无作用 (P>0.05)(图1、2)。
ALP活性：测定孔与对照孔无变化(P>0.05)。
图1 GM-CSF对牙髓细胞生长增殖的影响
图2 GM-CSF对牙周膜细胞生长增殖的影响
3 讨论
, http://www.100md.com GM-CSF作为骨髓造血干细胞促生长因子，目前被广泛用于肿瘤患者的放疗、化疗所致的白细 胞降低、再生障碍性贫血等，在慢性肝炎、口腔溃疡、重症感染和HIV感染也被广泛应 用。
牙髓成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞为牙髓组织、牙周组织的主要细胞，它们在维持牙髓组 织、牙周膜正常 新陈代谢和生物学功能中发挥非常重要的作用。在某些条件下，分别具有分化为成牙本质 细胞或成骨样细胞的能力[3，4]。
本组通过MTT法检测牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞DNA的合成，从而观察其分 化增殖情况，当GM-CSF 的浓度大于1mg/L时，其对细胞增殖有明显的抑制作用，浓度在0.001～1mg/L之间时则有明 显的增殖效应。可看出牙周膜成纤维细胞或牙髓成纤维细胞对GM-CSF具有明显的浓度依赖性 。
通过对ALP的检测可以看到，GM-CSF不能使细胞总的ALP升高，没有明显的诱骨形成效应， 由此可见牙髓成纤维细胞的分化多样性。
, 百拇医药
【参考文献】
[1] Nakashima M. The effects of growth factorson DNA synthesis, Prot eoglyean synt hesis and alkaline phosphatase activity in bovine dental pulp cells. Arch Oral B iol, 1992, 37:231
[2] Molloy PJ, Friedlander L, Van Thiel DH, et al. Combined inter feron, facic lovir and GM-CSF treatment of HBV infection in an individual with periarteritis nodosa. Hepatogastroenterology, 1999,46(28):2529
, 百拇医药 [3] Shirakawa M, Sbiba H, Nakanishi K, et al. Transforming growth fac tor-beta-1 reduces alkaline phosphatase mRNA and activity and stimulates cell pr oliferation in cultures of human pulp cells. Dent Res, 1994,73:1509
[4] Clark RA， McCOy GA, Folkvord JM, et al. TGF-β1 stimulates cultu reed human ifbroblasts to proliferate and produce tissue-like fibroplasia: a fib ronectin matrix-dependent event. J Cell Physiol, 1997,170:69
收稿日期：1999-10-20, http://www.100md.com
单位：孙叶芳(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；刘晗(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；吉兰(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；史俊南(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；李强(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)；张郁(第四军医大学口腔医学院口腔内科实验室，陕西 西安 710032)
关键词：GM-CSF； 牙周膜成纤维细胞； 牙髓成纤维细胞； MTT ； ALP
牙体牙髓牙周病学杂志000205 【摘 要】 目的：观察GM-CSF对牙周膜成纤 维 细胞、牙髓成纤维细胞的生物学作用。方法：原代培养牙髓成纤维 细胞、牙周膜成纤维细胞，用MTT法测定细胞增殖，酶动力学方法测定ALP活性。 结果：在观察期(3～7d)GM-CSF可使两种细胞出现明显的增殖，而不能诱导ALP 的表达。结论：GM-CSF的浓度在0.001～1mg/L之间对 牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞有明显的增殖效应，大于1mg/L时对增殖有明显的抑制 作用。
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【中图号】R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)02-0069-02
Bio-effects of GM-CSF on periodontal ligament and pulpal fibroblast
SUN Ye-fang, LIU Han, JI Lan, et al
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
【Abstract】 AIM: Investigation of bio-effects of GM- CSF on periodontal ligament and pupal fibroblasts. METHODS: Detection of the cell proliferation by MTT method and ALP expression by enzyme dynamics method.RESUTLS: Significant proliferation of the two types of cel ls could be observed and no ALP expression was induced by GM-CSF within 7 days of culture time. CONCLUSION: GM-CSF had dual effects on the cell growth,it could inhibit the fibroblasts proliferation at concentration abov e 1mg/L while stimulate the cell growth at concentration between 1mg/L and 0 .001mg/L.
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【Key words】 GM-CSF; pulpal fibroblasts; periodontal ligamen t fibroblasts； MTT； ALP
牙髓成纤维细胞是牙髓组织的主要细胞成分，它在维 持牙髓组织的生物学功能中发挥非常重 要的作用。牙周膜成纤维细胞为牙周膜组织的重要成分，对牙周组织损伤修复起到重要的作 用 [1]，GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)作为一种细胞因子可促进骨髓干细胞 的分化增殖，其应用范围越来越广，且受到临床的重视。本文就其对牙周膜成纤维细胞、牙 髓成纤维细胞的增殖和成骨样趋势进行了探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
rhGM-CSF：由本实验室构建GM-CSF质粒，转化E.coli。经表达，包涵体制备，变性，复 性纯化，获得高纯度(98.7 %)、高比活性(2.30×107/mg蛋白)rhGM-CSF(本产品已获国家生物制品Ⅱ类新药证书)。
, http://www.100md.com
DMEM、胎牛血清(FCS)(GIBCO公司产品)。Triton X-100、MTT、胰酶(Sigma公司产品)。 培养瓶、培养板(Nunc公司产品)，ALP试剂盒(BGH，Taiwan)。
1.2 方法
1.2.1 细胞制备
取10～20岁因正畸或阻生需要拔除的健康人牙，刮取牙周膜组织和取牙髓组织剪碎 ，以含15 0ml/L FCS的DMEM，50ml/L CO2，饱和湿度，37℃培养。将第5代牙髓成纤维细胞、牙周膜 成纤维细胞，以2.5g/L胰酶消化，加入含150ml/L FCS的DME M培养 液充分吹打调整细胞浓度至2×107/L。接种于96孔板，每孔100μl。观 察细胞贴壁后，吸去培养基，改用含20ml/L FCS的DMEM，继续培养24h后备用。
1.2.2 GM-CSF制备
, 百拇医药
以含20ml/L FCS的DMEM培养基配制10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001mg/L的工作浓度。
1.2.3 细胞增殖测定
将制备的牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞上清弃去，加入不同浓度的GM-CSF 10 0μl，每组4孔，对照孔加含20ml/L FCS的DMEM 100μl。50ml/L CO2，饱 合湿度, 37℃ 培养，分别在24、48、72、96h取牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞各1板，加入20μl M TT溶 液(5g/L)。继续培养4h终止，弃上清，加入150μl DMSO振荡20min，490nm波长测A值。
1.2.4 ALP活性检测
对加入不同浓度的GM-CSF的牙髓成纤维细胞，分别在3、5、7d取板1块加入3g/L Triton X-100 20μl，置4℃过夜，观察无完整细胞后混匀，加入2×检测底物液50μl，混 匀，37℃、30min终止。410nm波长测A值。
, 百拇医药
2 结果
细胞增殖：10、1mg/L浓度的GM-CSF对牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞生长有抑制作用 。0.1、0.01、0.001mg/L浓度有促进作用(P<0.05)。0.0001mg/L浓度则无作用 (P>0.05)(图1、2)。
ALP活性：测定孔与对照孔无变化(P>0.05)。
图1 GM-CSF对牙髓细胞生长增殖的影响
图2 GM-CSF对牙周膜细胞生长增殖的影响
3 讨论
, http://www.100md.com GM-CSF作为骨髓造血干细胞促生长因子，目前被广泛用于肿瘤患者的放疗、化疗所致的白细 胞降低、再生障碍性贫血等，在慢性肝炎、口腔溃疡、重症感染和HIV感染也被广泛应 用。
牙髓成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞为牙髓组织、牙周组织的主要细胞，它们在维持牙髓组 织、牙周膜正常 新陈代谢和生物学功能中发挥非常重要的作用。在某些条件下，分别具有分化为成牙本质 细胞或成骨样细胞的能力[3，4]。
本组通过MTT法检测牙周膜成纤维细胞、牙髓成纤维细胞DNA的合成，从而观察其分 化增殖情况，当GM-CSF 的浓度大于1mg/L时，其对细胞增殖有明显的抑制作用，浓度在0.001～1mg/L之间时则有明 显的增殖效应。可看出牙周膜成纤维细胞或牙髓成纤维细胞对GM-CSF具有明显的浓度依赖性 。
通过对ALP的检测可以看到，GM-CSF不能使细胞总的ALP升高，没有明显的诱骨形成效应， 由此可见牙髓成纤维细胞的分化多样性。
, 百拇医药
【参考文献】
[1] Nakashima M. The effects of growth factorson DNA synthesis, Prot eoglyean synt hesis and alkaline phosphatase activity in bovine dental pulp cells. Arch Oral B iol, 1992, 37:231
[2] Molloy PJ, Friedlander L, Van Thiel DH, et al. Combined inter feron, facic lovir and GM-CSF treatment of HBV infection in an individual with periarteritis nodosa. Hepatogastroenterology, 1999,46(28):2529
, 百拇医药 [3] Shirakawa M, Sbiba H, Nakanishi K, et al. Transforming growth fac tor-beta-1 reduces alkaline phosphatase mRNA and activity and stimulates cell pr oliferation in cultures of human pulp cells. Dent Res, 1994,73:1509
[4] Clark RA， McCOy GA, Folkvord JM, et al. TGF-β1 stimulates cultu reed human ifbroblasts to proliferate and produce tissue-like fibroplasia: a fib ronectin matrix-dependent event. J Cell Physiol, 1997,170:69
收稿日期：1999-10-20, http://www.100md.com