不明原因慢性肝炎患者TT病毒的检测及部分核苷酸序列分析
作者：魏来 潘修成 陶其敏 张言超 吴文漪 吕兴侠
单位：221002 徐州医学院附属医院传染科(魏来、潘修成、张言超、吴文漪、吕兴侠) ；北京医科大学肝脏病研究所(陶其敏)
关键词：
中华医学杂志/990410 1997年，国际上报道了一个新发现的与人类肝炎相关的DNA病毒——TT病毒[1]。为进一步探讨TT病毒在中国的流行情况，我们测定了慢性非甲～戊，非庚型肝炎患者中TT病毒的核酸及其部分核苷酸序列。结果报道如下。
一、对象与方法
1.病例及血清标本：(1)血清甲、乙、丙、戊及庚型肝炎病毒标志均为阴性的 慢性肝炎TT病毒的检测，共32例，排除药物性肝损伤及酒精性肝炎；(2)TT病毒部分核苷酸序列的分析，共7例，其中在11例甲、乙、丙、戊及庚型肝炎病毒标志均为阴性而TT病毒检 测阳性的慢性肝炎患者随机选择4例(TX1，TX5，TX6，TX7)，TT病毒检测阳性的献血员(TX2) ，慢性乙型肝炎(TX3)与慢性丙型肝炎(TX4)各1例。所有标本均来自徐州医学院附属医院肝炎门诊及传染科病房。
, 百拇医药
2.酶与试剂：蛋白酶K为Merk产品，十二烷基硫酸钠(SDS)为Serva产品。脱氧核苷三磷酸dT TP,dATP,dGTP,dCTP及TaqDNA聚合酶(Taq-P)等购自Promega公司。
3.PCR引物设计：参照报道序列。外引物：RD037正义链，5′-GCAGCAGCATATGGATATGT3′和 TD038反义链，5′-TGACTGTGCTAAAGCCTCTA-3′；内引物：RD051正义链，5′-ATACACATG AATGCCAGGC3′和TD052反义链，5′-GTACTTC TTGCTGGTGAAAT-3′。
4.核酸提取：50 μl血清加200 μl裂解液(50 mmol/L Tris.Hcl、pH 8.0、200 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2%SDS、1 g/L蛋白酶K)60℃水浴 1小时，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉 淀，溶于20 μl 0.1XTE备用。
, 百拇医药
5.TT病毒核酸套式PCR：核酸提取液加入第1次PCR反应体系，50 μl反应体系 中镁离子终浓 度为1.5 mmol/L,dNTP终浓度各为200 μmol/L,Taq-P为2 U，外引物各为50 pmol/L,35个循 环；取第1次PCR产物5 μl加入第2次PCR反应体系，50 μl反应体系中内引物各为50 pmol/L ，25个循环。
6.PCR产物的检测：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳。第1次PCR产物为270 bp，第2次PCR产物为196 bp。
7.cDNA序列测定：按我们已建立的成熟的PCR直接序列分析法[2]。
8.统计学处理：均数比较采用t检验，组间频率比较采用χ2检验。
二、结果
32例甲、乙、丙、戊及庚型肝炎病毒标志均为阴性的慢性肝炎患者，排除药物性肝损伤 及酒精性肝炎，阳性者11例，阳性率34%。其中仅1例具有明确的输血史。7株TT病毒开放读码框架1部分核苷酸序列与日本株同源性的比较(表1)，结果显示，该7株与日本株N22的同源性为(95.41～98.47)%，平均为(97.3±1.1)%；与日本株Case2, Case4 及Case5相比 ，同源性分别为95.41%～98.47%，95.41%～98.47%及88.26%～90.82%；平均分别为(9 7.2±1.1)%，(97.2±1.1)%及(89.7±1.1)%。7株间同源性为93.37%～97.96 %，平均为(95.8±1.5)%。
, 百拇医药
表1 不同感染者血清中TT病毒部分核苷 酸序列及与日本株同源性的比较(%)
N22
Case2
Case4
Case5
TX1
TX2
TX3
TX4
TX5
TX6
Case2
, 百拇医药
100
Case4
98.98
98.98
Case5
90.31
90.31
90.31
TX1
95.41
95.41
95.41
88.26
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TX2
98.47
98.47
98.47
90.82
94.90
TX3
97.45
97.45
97.45
90.82
94.90
97.96
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TX4
97.96
97.96
97.45
89.80
93.37
96.43
95.41
TX5
96.43
96.43
96.43
88.26
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93.37
95.92
94.90
94 .39
TX6
97.96
97.96
97.96
90.31
94.39
97.45
96.94
97 .45
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96.43
TX7
96.94
96.94
96.94
89.80
93.37
97.45
96.94
94 .90
97.45
96.94
注：N22，Case2，Case4与Case5均为日本株，TX1，TX5，TX6，TX7均来自非 甲-戊，非庚型肝炎患者，TX2来自献血员，TX3与TX4分别为慢性乙型肝炎与慢性丙型肝炎
, 百拇医药
根据测定的7株TT病毒开放读码框架，部分核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列并与日本株N22，Case2，Case4及Case5氨基酸序列比较，结果，在所测定的65个氨基酸长的区域内，本组7株 与N22，Caes2及Case5的同源性均在90%～96%间，与Case4的同源性为89%～96%。7株间的同 源性为86%～96%。
三、讨论
研究表明[1，3]，TT病毒为单股DNA病毒，在日本慢性非甲-戊，非庚型肝炎，非甲-戊，非庚型暴发性肝炎，献血员，血液透析者及静脉药瘾者中均有不同程度的感染率。本组结果证实，在我国慢性非甲-戊，非庚型肝炎患者中存在TT病毒感染者。在所选择的32例患者中，感染 率为34%。提示，TT病毒可能是甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒以外另一个与人类 肝炎相关的病毒。同时还发现，以聚合酶链反应检测TT病毒核酸，其感染率占慢性非甲-戊 ，非庚型肝炎患者的30%以上，仍有相当一部分患者病原学不明。因对TT病毒感染的研究 尚少，所以有必要采用更多敏感试剂联合检测，以明确在该部分患者中是否有漏检者，最终 明确TT病毒感染状况及临床意义。
, http://www.100md.com
关于TT病毒研究报道观察了3例患者均有明确的输血史，且输血量较大。为此，认为TT病毒 经输血传播引起肝炎[1]。本研究所发现的11例TT病毒核酸检测阳性者中，仅有1 例具有明确输血史，提示输血可能仅仅是TT病毒传播的途径之一，至少不是唯一途径。TT病 毒感染的发生还可经其它传播途径而构成。
本组资料显示，从本地区不同感染者血清中所分离的TT病毒在开放读码框架1的部分区域，变异于88%～98%间，表明TT病毒可能与其它致人类肝炎病毒一样，其基因变异可能具有地理 分布特征。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39770684)
参考文献
[1] Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA vi rus(TTV) associated witl elevated transminase levels in posttransfusion hepatiti s of unrnown etilolgy. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241:92-97.
, 百拇医药
[2] 魏来，王宇，陈红松，等.丙型肝炎病毒PCR直接序列分析方法 的建立及应用.中华肝脏病杂志，1996，4： 103-105.
[3] Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecucar clonig and Characterization of a novel DNA virus(TTV) associated with posttrawfusion he patitis of unrnown etiology. Hepatology Res, 1998,10: 1-16.
(收稿：1998-06-26 修回：1998-12-28), 百拇医药
单位：221002 徐州医学院附属医院传染科(魏来、潘修成、张言超、吴文漪、吕兴侠) ；北京医科大学肝脏病研究所(陶其敏)
关键词：
中华医学杂志/990410 1997年，国际上报道了一个新发现的与人类肝炎相关的DNA病毒——TT病毒[1]。为进一步探讨TT病毒在中国的流行情况，我们测定了慢性非甲～戊，非庚型肝炎患者中TT病毒的核酸及其部分核苷酸序列。结果报道如下。
一、对象与方法
1.病例及血清标本：(1)血清甲、乙、丙、戊及庚型肝炎病毒标志均为阴性的 慢性肝炎TT病毒的检测，共32例，排除药物性肝损伤及酒精性肝炎；(2)TT病毒部分核苷酸序列的分析，共7例，其中在11例甲、乙、丙、戊及庚型肝炎病毒标志均为阴性而TT病毒检 测阳性的慢性肝炎患者随机选择4例(TX1，TX5，TX6，TX7)，TT病毒检测阳性的献血员(TX2) ，慢性乙型肝炎(TX3)与慢性丙型肝炎(TX4)各1例。所有标本均来自徐州医学院附属医院肝炎门诊及传染科病房。
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2.酶与试剂：蛋白酶K为Merk产品，十二烷基硫酸钠(SDS)为Serva产品。脱氧核苷三磷酸dT TP,dATP,dGTP,dCTP及TaqDNA聚合酶(Taq-P)等购自Promega公司。
3.PCR引物设计：参照报道序列。外引物：RD037正义链，5′-GCAGCAGCATATGGATATGT3′和 TD038反义链，5′-TGACTGTGCTAAAGCCTCTA-3′；内引物：RD051正义链，5′-ATACACATG AATGCCAGGC3′和TD052反义链，5′-GTACTTC TTGCTGGTGAAAT-3′。
4.核酸提取：50 μl血清加200 μl裂解液(50 mmol/L Tris.Hcl、pH 8.0、200 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2%SDS、1 g/L蛋白酶K)60℃水浴 1小时，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉 淀，溶于20 μl 0.1XTE备用。
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5.TT病毒核酸套式PCR：核酸提取液加入第1次PCR反应体系，50 μl反应体系 中镁离子终浓 度为1.5 mmol/L,dNTP终浓度各为200 μmol/L,Taq-P为2 U，外引物各为50 pmol/L,35个循 环；取第1次PCR产物5 μl加入第2次PCR反应体系，50 μl反应体系中内引物各为50 pmol/L ，25个循环。
6.PCR产物的检测：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳。第1次PCR产物为270 bp，第2次PCR产物为196 bp。
7.cDNA序列测定：按我们已建立的成熟的PCR直接序列分析法[2]。
8.统计学处理：均数比较采用t检验，组间频率比较采用χ2检验。
二、结果
32例甲、乙、丙、戊及庚型肝炎病毒标志均为阴性的慢性肝炎患者，排除药物性肝损伤 及酒精性肝炎，阳性者11例，阳性率34%。其中仅1例具有明确的输血史。7株TT病毒开放读码框架1部分核苷酸序列与日本株同源性的比较(表1)，结果显示，该7株与日本株N22的同源性为(95.41～98.47)%，平均为(97.3±1.1)%；与日本株Case2, Case4 及Case5相比 ，同源性分别为95.41%～98.47%，95.41%～98.47%及88.26%～90.82%；平均分别为(9 7.2±1.1)%，(97.2±1.1)%及(89.7±1.1)%。7株间同源性为93.37%～97.96 %，平均为(95.8±1.5)%。
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表1 不同感染者血清中TT病毒部分核苷 酸序列及与日本株同源性的比较(%)
N22
Case2
Case4
Case5
TX1
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TX3
TX4
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Case2
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Case4
98.98
98.98
Case5
90.31
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TX1
95.41
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TX2
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注：N22，Case2，Case4与Case5均为日本株，TX1，TX5，TX6，TX7均来自非 甲-戊，非庚型肝炎患者，TX2来自献血员，TX3与TX4分别为慢性乙型肝炎与慢性丙型肝炎
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根据测定的7株TT病毒开放读码框架，部分核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列并与日本株N22，Case2，Case4及Case5氨基酸序列比较，结果，在所测定的65个氨基酸长的区域内，本组7株 与N22，Caes2及Case5的同源性均在90%～96%间，与Case4的同源性为89%～96%。7株间的同 源性为86%～96%。
三、讨论
研究表明[1，3]，TT病毒为单股DNA病毒，在日本慢性非甲-戊，非庚型肝炎，非甲-戊，非庚型暴发性肝炎，献血员，血液透析者及静脉药瘾者中均有不同程度的感染率。本组结果证实，在我国慢性非甲-戊，非庚型肝炎患者中存在TT病毒感染者。在所选择的32例患者中，感染 率为34%。提示，TT病毒可能是甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒以外另一个与人类 肝炎相关的病毒。同时还发现，以聚合酶链反应检测TT病毒核酸，其感染率占慢性非甲-戊 ，非庚型肝炎患者的30%以上，仍有相当一部分患者病原学不明。因对TT病毒感染的研究 尚少，所以有必要采用更多敏感试剂联合检测，以明确在该部分患者中是否有漏检者，最终 明确TT病毒感染状况及临床意义。
, http://www.100md.com
关于TT病毒研究报道观察了3例患者均有明确的输血史，且输血量较大。为此，认为TT病毒 经输血传播引起肝炎[1]。本研究所发现的11例TT病毒核酸检测阳性者中，仅有1 例具有明确输血史，提示输血可能仅仅是TT病毒传播的途径之一，至少不是唯一途径。TT病 毒感染的发生还可经其它传播途径而构成。
本组资料显示，从本地区不同感染者血清中所分离的TT病毒在开放读码框架1的部分区域，变异于88%～98%间，表明TT病毒可能与其它致人类肝炎病毒一样，其基因变异可能具有地理 分布特征。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39770684)
参考文献
[1] Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA vi rus(TTV) associated witl elevated transminase levels in posttransfusion hepatiti s of unrnown etilolgy. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241:92-97.
, 百拇医药
[2] 魏来，王宇，陈红松，等.丙型肝炎病毒PCR直接序列分析方法 的建立及应用.中华肝脏病杂志，1996，4： 103-105.
[3] Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecucar clonig and Characterization of a novel DNA virus(TTV) associated with posttrawfusion he patitis of unrnown etiology. Hepatology Res, 1998,10: 1-16.
(收稿：1998-06-26 修回：1998-12-28), 百拇医药