微生物比浊法与管碟法测定硫酸庆大霉素效价的评价
作者：霍启录 侯连兵 邵红霞
单位：邵红霞(第一军医大学中医系，广州市 510515)；霍启录 侯连兵(第一军医大学南方医院药学部，广州市 510515)
关键词：
中国药房000121
中图分类号：R927.1 文献标识码：B
文章编号：1001-0408(2000)01-0037-01▲
在国际上，抗生素效价测定以管碟法和比浊法并行，但《中国药典》只收载管碟法。实际上，比浊法在国内有相当的应用前景，它不仅耗时短，灵敏度高，操作简单，且人为影响因素少，对中间产品的检验更具有重要意义。在90年代初期，国内有人用比浊法测定了四环素等[1]部分抗生素药品，取得了良好效果。本文对比浊法和管碟法测定硫酸庆大霉素效价进行了评价，取得了较好效果，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与仪器
1.1 菌株：金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、庆大霉素标准品(批号3269112，效价631IU)，均由中国药品生物制品检定所提供；硫酸庆大霉素原料(批号88-11-222，效价613IU)，河南开封制药厂提供；硫酸庆大霉素注射液(市售)。
1.2 仪器：UV-265FW紫外分光光度计(日本岛津)；摇床恒温水浴箱、玻璃大试管(205×25mm)、秤量瓶、容量瓶、移液管、电子天平、秒表等。
1.3 培养基与试剂：培养基Ⅰ号：胨6g，酪蛋白胨4g，牛肉浸液(1∶3)500ml，酵母膏4g，D-葡萄糖1g，琼脂粉20g，加水至1 000ml，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6。培养基Ⅱ号：胨10g，氯化钠7g，牛肉膏5g，酵母粉3g，磷酸氢二钾4.82g，磷酸二氢钾1.32g，D-葡萄糖1g，加水至1 000ml，调节pH值使灭菌后为6.9～7.0。磷酸盐缓冲液(pH=7.0)：取0.2mol/L磷酸二氢钾缓冲液500ml，加0.2mol/L氢氧化钠液296.3ml，加水至2 000ml混匀，灭菌后备用。水：新鲜蒸镏水，灭菌后备用。12%甲醛溶液。
, 百拇医药
本实验所需培养基、水、缓冲液等溶液均须事先用4号垂熔玻璃漏斗滤过；大试管(须质均，重量、容量相等)、移液管等器具须经160℃干烤2小时灭菌。
2 实验方法
2.1 实验用溶液配制：培养基菌悬液：取580nm波长处透光率为5.07%的金黄色葡萄球菌悬液20ml，加入Ⅱ号培养基中，混匀备用。
标准品溶液：取庆大霉素标准品配制成249IU/ml的溶液，备用。
葡萄球菌悬液：取金黄色葡萄球菌斜面培养物接种于Ⅰ号培养基斜面，于(37±1)℃培养18小时，用灭菌生理盐水约11ml洗下菌苔，制成悬液，加12%甲醛溶液11ml用灭菌生理盐水约13ml稀释后，以灭菌生理盐水为空白，于紫外分光光度计580nm处测定，其透光率为5.07%，置冰箱中备用。
样品溶液配制：取硫酸庆大霉素原料制成约250IU/ml的溶液，备用。
, 百拇医药
2.2 仪器性能考查：取葡萄球菌悬液在紫外分光光度计420nm和600nm处测定，其A420/A600=0.184<0.213，表明该仪器适合用于细菌比浊法测定。
2.3 细菌比浊法二剂量法设计：取上述庆大霉素标准品溶液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml，分别置于100ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液分别稀释至刻度，取上述稀释液各1.0ml分别加入含有20mlⅡ号培养基菌悬液的大试管中，于(37±1)℃摇床水浴中保温4小时，取出，立即放入冰水浴中，加12%的甲醛溶液1ml，以含20ml培养基菌悬液、1.0ml甲醛(12%)溶液和1.0ml水同条件培养的溶液为空白，于紫外分光光度计530nm处测定，结果取庆大霉素标准品溶液5.0、6.0ml操作的结果其吸收度值在0.3～0.6之间，故设计剂距比为1∶1.2，培养基内标准品高剂量ds1=0.6 791IU，低剂量ds2=0.5 659IU。
3 实验结果
, 百拇医药
3.1 回收率试验：分别取庆大霉素标准品溶液5.0、6.0ml，硫酸庆大霉素原料样品溶液5.0、6.0ml，分别置100ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，再取稀释液1.0ml分别加入含20ml培养基菌悬液的大试管中，按正交拉丁方排列(每一剂量用4支管，共16支管)，于(37±1)℃摇床水浴保温4小时，取出，立即放入冰水浴中，并于每管中加入12%的甲醛溶液1ml，以同条件下培养的20ml培养基菌悬液加12%甲醛溶液1.0ml、水1.0ml为空白，于紫外分光光度计530nm处测定，结果见表1。按《中国药典》1995年版有关规定[2]计算，结论是回归显著(P>0.05)，S、T为平行直线，实验结果可靠。
表1 比浊法与管碟法回收率试验 比浊法
管碟法
效价(%)
平均可信限率(%)
, 百拇医药
均值±SD(%)
效价(%)
平均可信限率(%)
均值±SD(%)
99.73
2.43
99.25
4.81
99.82
2.05
99.36
5.27
100.36
, 百拇医药
3.18
100.03±0.27
99.85
5.91
99.77±0.56
99.99
1.97
99.80
4.73
100.24
2.09
100.67
, 百拇医药 5.36
两方法间经x2检验，无显著差异，P>0.05
3.2 样品测定：分别取硫酸庆大霉素注射液2.5、3.0ml，稀释，使成每1ml中分别含庆大霉素25、30IU的溶液，取此稀释液1.0ml按回收率项下操作，按生物检定统计方法计算，结果用微生物管蝶法对照，结果见表2。
表2 样品测定结果 比浊法
管碟法
效价(%)
平均可信限率(%)
效价(%)
平均可信限率(%)
, http://www.100md.com
99.85
3.63
99.23
5.38
100.25
2.45
99.36
5.79
103.72
4.26
100.04
4.90
96.33
, 百拇医药
2.11
97.01
5.87
97.32
5.27
98.00
5.38
99.46
3.21
100.00
2.79
4 讨论
4.1 比浊法测定所用培养基、缓冲液等液体，均须经4号垂熔玻璃漏斗滤过，所用玻璃试管等器具需用清洁液浸泡，比色杯用硝酸-硫酸(5∶95)浸泡并用过滤水冲洗干净，以除去纤维等杂质，保证比浊法的准确测定。
, http://www.100md.com
4.2 比浊法测定时应严格控制水浴温度为(37±1)℃之间，试管按正交拉丁方排列，以避免管间差异，保证较好的重现性。
4.3 实验用大试管应为质量一致，厚度、重量、直径相同的同一厂家、同一批号试管，以保证每只试管具有相同的导热性。
4.4 为避免因培养基菌悬液分装、抗生素加入和培养终结时甲醛溶液加入先后顺序的不同带来的实验误差，上述操作过程需在冰水浴中进行，且要求操作快速准确。
4.5 培养基菌悬液经4小时培养后在试管底部可见沉淀，在浊度测量前应振摇均匀，但振摇后会产生气泡，因此需放置一定时间使气泡消失后方可测定。本实验认为静置2分钟较理想。
5 结论
实验表明，本文所述方法较管蝶法有明显优点，其操作方便、快速，结果准确，重现性好，可信限率高，且可节约时间约1天，不需特殊设备，值得推广应用；尤其对医院或工厂检测半成品，能缩短检测时间，提高工作效率。■
参考文献：
[1]张治锬，刘秀珍，严德喜.微生物比浊法测定抗生素含量的探讨[J].药物分析杂志，1983，3(2)：65.
[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典(二部)[S].1995年版.北京：化学工业出版社、广东科技出版社，1995：附录70.
收稿日期：1999-06-01
修回日期：1999-08-03, 百拇医药
单位：邵红霞(第一军医大学中医系，广州市 510515)；霍启录 侯连兵(第一军医大学南方医院药学部，广州市 510515)
关键词：
中国药房000121
中图分类号：R927.1 文献标识码：B
文章编号：1001-0408(2000)01-0037-01▲
在国际上，抗生素效价测定以管碟法和比浊法并行，但《中国药典》只收载管碟法。实际上，比浊法在国内有相当的应用前景，它不仅耗时短，灵敏度高，操作简单，且人为影响因素少，对中间产品的检验更具有重要意义。在90年代初期，国内有人用比浊法测定了四环素等[1]部分抗生素药品，取得了良好效果。本文对比浊法和管碟法测定硫酸庆大霉素效价进行了评价，取得了较好效果，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与仪器
1.1 菌株：金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、庆大霉素标准品(批号3269112，效价631IU)，均由中国药品生物制品检定所提供；硫酸庆大霉素原料(批号88-11-222，效价613IU)，河南开封制药厂提供；硫酸庆大霉素注射液(市售)。
1.2 仪器：UV-265FW紫外分光光度计(日本岛津)；摇床恒温水浴箱、玻璃大试管(205×25mm)、秤量瓶、容量瓶、移液管、电子天平、秒表等。
1.3 培养基与试剂：培养基Ⅰ号：胨6g，酪蛋白胨4g，牛肉浸液(1∶3)500ml，酵母膏4g，D-葡萄糖1g，琼脂粉20g，加水至1 000ml，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6。培养基Ⅱ号：胨10g，氯化钠7g，牛肉膏5g，酵母粉3g，磷酸氢二钾4.82g，磷酸二氢钾1.32g，D-葡萄糖1g，加水至1 000ml，调节pH值使灭菌后为6.9～7.0。磷酸盐缓冲液(pH=7.0)：取0.2mol/L磷酸二氢钾缓冲液500ml，加0.2mol/L氢氧化钠液296.3ml，加水至2 000ml混匀，灭菌后备用。水：新鲜蒸镏水，灭菌后备用。12%甲醛溶液。
, 百拇医药
本实验所需培养基、水、缓冲液等溶液均须事先用4号垂熔玻璃漏斗滤过；大试管(须质均，重量、容量相等)、移液管等器具须经160℃干烤2小时灭菌。
2 实验方法
2.1 实验用溶液配制：培养基菌悬液：取580nm波长处透光率为5.07%的金黄色葡萄球菌悬液20ml，加入Ⅱ号培养基中，混匀备用。
标准品溶液：取庆大霉素标准品配制成249IU/ml的溶液，备用。
葡萄球菌悬液：取金黄色葡萄球菌斜面培养物接种于Ⅰ号培养基斜面，于(37±1)℃培养18小时，用灭菌生理盐水约11ml洗下菌苔，制成悬液，加12%甲醛溶液11ml用灭菌生理盐水约13ml稀释后，以灭菌生理盐水为空白，于紫外分光光度计580nm处测定，其透光率为5.07%，置冰箱中备用。
样品溶液配制：取硫酸庆大霉素原料制成约250IU/ml的溶液，备用。
, 百拇医药
2.2 仪器性能考查：取葡萄球菌悬液在紫外分光光度计420nm和600nm处测定，其A420/A600=0.184<0.213，表明该仪器适合用于细菌比浊法测定。
2.3 细菌比浊法二剂量法设计：取上述庆大霉素标准品溶液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml，分别置于100ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液分别稀释至刻度，取上述稀释液各1.0ml分别加入含有20mlⅡ号培养基菌悬液的大试管中，于(37±1)℃摇床水浴中保温4小时，取出，立即放入冰水浴中，加12%的甲醛溶液1ml，以含20ml培养基菌悬液、1.0ml甲醛(12%)溶液和1.0ml水同条件培养的溶液为空白，于紫外分光光度计530nm处测定，结果取庆大霉素标准品溶液5.0、6.0ml操作的结果其吸收度值在0.3～0.6之间，故设计剂距比为1∶1.2，培养基内标准品高剂量ds1=0.6 791IU，低剂量ds2=0.5 659IU。
3 实验结果
, 百拇医药
3.1 回收率试验：分别取庆大霉素标准品溶液5.0、6.0ml，硫酸庆大霉素原料样品溶液5.0、6.0ml，分别置100ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，再取稀释液1.0ml分别加入含20ml培养基菌悬液的大试管中，按正交拉丁方排列(每一剂量用4支管，共16支管)，于(37±1)℃摇床水浴保温4小时，取出，立即放入冰水浴中，并于每管中加入12%的甲醛溶液1ml，以同条件下培养的20ml培养基菌悬液加12%甲醛溶液1.0ml、水1.0ml为空白，于紫外分光光度计530nm处测定，结果见表1。按《中国药典》1995年版有关规定[2]计算，结论是回归显著(P>0.05)，S、T为平行直线，实验结果可靠。
表1 比浊法与管碟法回收率试验 比浊法
管碟法
效价(%)
平均可信限率(%)
, 百拇医药
均值±SD(%)
效价(%)
平均可信限率(%)
均值±SD(%)
99.73
2.43
99.25
4.81
99.82
2.05
99.36
5.27
100.36
, 百拇医药
3.18
100.03±0.27
99.85
5.91
99.77±0.56
99.99
1.97
99.80
4.73
100.24
2.09
100.67
, 百拇医药 5.36
两方法间经x2检验，无显著差异，P>0.05
3.2 样品测定：分别取硫酸庆大霉素注射液2.5、3.0ml，稀释，使成每1ml中分别含庆大霉素25、30IU的溶液，取此稀释液1.0ml按回收率项下操作，按生物检定统计方法计算，结果用微生物管蝶法对照，结果见表2。
表2 样品测定结果 比浊法
管碟法
效价(%)
平均可信限率(%)
效价(%)
平均可信限率(%)
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99.85
3.63
99.23
5.38
100.25
2.45
99.36
5.79
103.72
4.26
100.04
4.90
96.33
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2.11
97.01
5.87
97.32
5.27
98.00
5.38
99.46
3.21
100.00
2.79
4 讨论
4.1 比浊法测定所用培养基、缓冲液等液体，均须经4号垂熔玻璃漏斗滤过，所用玻璃试管等器具需用清洁液浸泡，比色杯用硝酸-硫酸(5∶95)浸泡并用过滤水冲洗干净，以除去纤维等杂质，保证比浊法的准确测定。
, http://www.100md.com
4.2 比浊法测定时应严格控制水浴温度为(37±1)℃之间，试管按正交拉丁方排列，以避免管间差异，保证较好的重现性。
4.3 实验用大试管应为质量一致，厚度、重量、直径相同的同一厂家、同一批号试管，以保证每只试管具有相同的导热性。
4.4 为避免因培养基菌悬液分装、抗生素加入和培养终结时甲醛溶液加入先后顺序的不同带来的实验误差，上述操作过程需在冰水浴中进行，且要求操作快速准确。
4.5 培养基菌悬液经4小时培养后在试管底部可见沉淀，在浊度测量前应振摇均匀，但振摇后会产生气泡，因此需放置一定时间使气泡消失后方可测定。本实验认为静置2分钟较理想。
5 结论
实验表明，本文所述方法较管蝶法有明显优点，其操作方便、快速，结果准确，重现性好，可信限率高，且可节约时间约1天，不需特殊设备，值得推广应用；尤其对医院或工厂检测半成品，能缩短检测时间，提高工作效率。■
参考文献：
[1]张治锬，刘秀珍，严德喜.微生物比浊法测定抗生素含量的探讨[J].药物分析杂志，1983，3(2)：65.
[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典(二部)[S].1995年版.北京：化学工业出版社、广东科技出版社，1995：附录70.
收稿日期：1999-06-01
修回日期：1999-08-03, 百拇医药