糠秕孢子菌脂酶活性及影响因素检测
作者：罗东辉 王侠生 何芳德
单位：何芳德 罗东辉(上海市华东医院皮肤科，200040)；王侠生(上海市华山医院皮肤科)
关键词：糠秕孢子菌；脂肪酶
临床皮肤科杂志000206
摘要 测定糠秕孢子菌脂酶活性及影响因素，结果表明糠秕 孢子菌的脂酶活性有较大的株间差异性。不同pH值对糠秕孢子 菌的脂酶活性有明显影响。16株糠秕孢子菌最大脂酶活性值在 pH值为6.4时测得。金属离子液对脂酶活性有影响，Na+，K+较 Ca2+，Fe2+明显增加糠秕孢子菌脂酶的活性。经统计学检验有 显著性差异(P<0.01)。
An assay of the lipase in pityrosporum orbiculae
, 百拇医药
Luo Donghui, Wang Xiasheng, He Fangde
(Department of Dermatology, Hua Dong Hospital, Shanghai,200040)
Abstract The lipase activity of Pityrosporum orbiculae has been detected. The results showed that the lipase activity varied in different straints. It also changed depending on the PH value. The optimal PH value is at 6.4. Na+ ,K+ could significantly increase the lipase activity compared with Ca2+ , Fe2+ (P< 0.01).
, 百拇医药
Key words Pityrosporum orbiculae Lipase
糠秕孢子菌为嗜脂性酵母菌，属人体皮肤正常的菌群，亦 是一种条件致病真菌。已有的研究已证实，它可以引起花斑癣 、败血症、浆膜炎、骨关节炎、并与头皮屑、脂溢性皮炎、 异位性皮炎、银屑病有密切关系[1]。脂酶对该菌生长必不可少 。脂酶的活性与其致病力有密切关系，而脂酶活性受多种因 素包括金属离子的影响，故了解糠秕孢子菌脂酶生化特征对深 入研究其致病机制有重要意义。
1材料和方法
1.1培养基：麦芽浸膏2%，酵母浸膏0.01%，Tween800.2%，单 硬脂酸甘油酯0.25%，葡萄糖4%，蛋白胨1%，琼脂2%，常规 高温消毒灭菌备用。
1.2菌种及菌液制备：本试验所用菌种除一株标准圆形糠秕 孢子菌(ATCC44344)购自美国，其余均为我科真菌室从正常人头皮 、额部分离所得圆形糠秕孢子菌。将固体培养基上37℃生长1 周的菌落用消毒生理盐水洗脱，并调节菌液浓度为1×106/mL备 用。
, 百拇医药
1.3底物：脂酶特异底物为p-nitrophenylpalmitate(pNPP)(Sigma)。将 pNPP溶于异丙醇配成2mM的原液，取0.5mL加入4.95mL各种pH的PBS，再 加0.05mLTritonX-100摇匀备用。
1.4标准脂酶及检测仪：猪胰腺脂酶(Sigma公司)，批号970425， 活力≥10000U/g，检测仪为511酶标仪(上海第三分析仪器厂生产) 。
1.5金属离子溶液制备：用PBS配制1M浓度的NaCl、KCl、CaCl2、Fe SO4溶液备用。
1.6脂酶活性及影响因素检测
1.6.1脂酶活性的检测：采用Plotkin[2]的方法加以改良，具体 的步骤是：在通用的无菌一次性使用96孔培养板上进行检测。 第1列加300μLPBS，第2列加100μLPBS,200μLpH7.0的底物作对照。 第3～12列加200μLpH7.0的底物，再加上述配制好的100μL菌液， 每株菌一列，共10株菌。然后用不干胶封闭有盖96培养板侧缘 ，放入37℃孵育，1小时后在511酶标仪用波长405nm检测结果。
, 百拇医药
脂酶活性的标准曲线测定：第1列加300μLPBS，第2列加100μ LPBS，200μLpH7.0的底物作对照。第3～10列分别加浓度为500U/mL ，250U/mL，125U/mL，62.5U/mL，31.25U/mL，15.625U/mL，7.8125U/mL，3.90125U /mL的100μL标准脂酶液代替菌液检测结果。
1.6.2pH对脂酶活性的影响的检测：第1列加300μLPBS。第2列加 100μLPBS，200μL底物作对照，其中AB、CD、EF、G、H孔分别加pH 5.8,6.4,7.0,7.4,8.0的底物。第3～12列加200μL底物，其中3～4，5～ 6,7～8,9～10,11～12列分别加pH5.8，6.4，7.0，7.4，8.0的底物。再加 上述配制好的100μL菌液，每株菌一行，共16株菌。然后用不 干胶封闭有盖96培养板侧缘，放入37℃孵育，1小时后检测结果 。
1.6.3金属离子对脂酶活性的影响的检测：第1列加400μLPBS， 第2列加100μLpH7.4PBS，200μL底物，100μL金属离子溶液作对照 ，其中AB，CD，EF，GH孔分别加Ca2+,Na+,Fe2+,K+离子溶液。第 3～10列加200μLpH7.4的底物，其中3～4，5～6，7～8，9～10列 分别加Ca2+,Na+,Fe2+,K+离子溶液。再加上述配制好的100μ L菌液，每株菌一行，共8株菌。然后用不干胶封闭有盖96培养 板侧缘，放入37℃孵育，1小时后检测结果。
, 百拇医药
图1不同pH值对脂酶活性的影响
图2金属离子对脂酶活性的影响
2结果
2.1糠秕孢子菌的脂酶活性：10株糠秕孢子菌的脂酶活性(OD值 及U/mL)详见表1。由表1可见10株糠秕孢子菌的脂酶活性各不相 同，变化较大，最小149U/mL，最大527U/mL，相差达3倍以上。
2.2pH对脂酶活性的影响：不同pH值对16株糠秕孢子菌的脂酶 活性的影响见图1。
2.3金属离子对脂酶活性的影响：在37℃，pH7.4时Ca2+,Na+,Fe 2+,K+金属离子液对8株菌脂酶活性的影响见图2。由图2可见Na +,K+较Ca2+,Fe2+明显增加糠秕孢子菌脂酶的活性。经统计学 检验有显著性差异(P<0.01)。
, 百拇医药
3讨论
糠秕孢子菌一个重要的特性就是利用脂肪作为能量来源。 脂酶活性对糠秕孢子菌的生长起着关键的作用。Wilde等[3]发现 糠秕子菌脂肪酸代谢的最适pH值为4.5，生长的最适pH值为5.5～6 .5。脂酶的刺激剂牛磺胆酸盐可促进脂酶活性，同时促使糠秕 孢子菌从酵母型向菌丝型转化。而糠秕孢子菌从寄生性向致病 性常伴随酵母型向菌丝型转化，所以，脂酶不仅与糠秕孢子 菌的生长有关而且与致病有关。
表1 10株糠秕孢子菌pH7.0时的脂酶活性(OD值及U/mL) 菌株
OD值
U/mL
1
0.774
, 百拇医药
370
2
1.125
527
3
0.386
172
4
0.440
198
5
0.826
384
, 百拇医药
6
0.678
313
7
0.539
246
8
0.698
322
9
0.672
310
10
, 百拇医药
0.340
149
我们检测糠秕孢子菌的脂酶活性及其影响因素，结果表明 每株糠秕孢子菌的脂酶活性有较大的变动。这说明糠秕孢子菌 的脂酶活性存在着株间差异性。这种差异性是否与糠秕孢子 菌的致病性有关还有待进一步研究。
不同pH值对糠秕孢子菌的脂酶活性有明显影响。16株糖秕孢 子菌在不同pH值条件下脂酶活性有明显不同。从合计均值看， 最大脂酶活性值在pH为6.4时测得。这样的结果高于Ran等[4]测得 的脂酶活性最适pH值5.5，但低于Plotkin等[2]测得的脂酶活性最 适pH值7.5。金属离子液对脂酶活性有影响。Na+,K+较Ca2+,Fe2 +明显增加糠秕孢子菌脂酶的活性。经统计学检验有显著性差 异(P<0.01)。这与Plotkin等测得的结果相同。
, http://www.100md.com
P＆G公司资助课题
参考文献
1，Faergemann J. Lipophilic yeasts in skin disease. Semin Dermatol, 1985,4(2):173～ 184
2，Plotkin LI, Squiquera L, Mathov I, et al. Characterization of the lipase activity of Malassezia furfur. J Med Vet Mycol, 1996,34(1):43～ 48
3，Wilde PF, Stewart PS. A study of the fatty acid metabolism of the yeast pityrosporum ovale. Biochem J, 1968,108(2):225～ 231
4，Ran Y, Yoshiike T, Ogawa H. Lipase of Malassezia furfur: some properties and their relationship to cell growth. J Med Vet Mycol, 1993,31(1):77～ 85
(收稿：1999-06-14修回：1999-09-06), 百拇医药
单位：何芳德 罗东辉(上海市华东医院皮肤科，200040)；王侠生(上海市华山医院皮肤科)
关键词：糠秕孢子菌；脂肪酶
临床皮肤科杂志000206
摘要 测定糠秕孢子菌脂酶活性及影响因素，结果表明糠秕 孢子菌的脂酶活性有较大的株间差异性。不同pH值对糠秕孢子 菌的脂酶活性有明显影响。16株糠秕孢子菌最大脂酶活性值在 pH值为6.4时测得。金属离子液对脂酶活性有影响，Na+，K+较 Ca2+，Fe2+明显增加糠秕孢子菌脂酶的活性。经统计学检验有 显著性差异(P<0.01)。
An assay of the lipase in pityrosporum orbiculae
, 百拇医药
Luo Donghui, Wang Xiasheng, He Fangde
(Department of Dermatology, Hua Dong Hospital, Shanghai,200040)
Abstract The lipase activity of Pityrosporum orbiculae has been detected. The results showed that the lipase activity varied in different straints. It also changed depending on the PH value. The optimal PH value is at 6.4. Na+ ,K+ could significantly increase the lipase activity compared with Ca2+ , Fe2+ (P< 0.01).
, 百拇医药
Key words Pityrosporum orbiculae Lipase
糠秕孢子菌为嗜脂性酵母菌，属人体皮肤正常的菌群，亦 是一种条件致病真菌。已有的研究已证实，它可以引起花斑癣 、败血症、浆膜炎、骨关节炎、并与头皮屑、脂溢性皮炎、 异位性皮炎、银屑病有密切关系[1]。脂酶对该菌生长必不可少 。脂酶的活性与其致病力有密切关系，而脂酶活性受多种因 素包括金属离子的影响，故了解糠秕孢子菌脂酶生化特征对深 入研究其致病机制有重要意义。
1材料和方法
1.1培养基：麦芽浸膏2%，酵母浸膏0.01%，Tween800.2%，单 硬脂酸甘油酯0.25%，葡萄糖4%，蛋白胨1%，琼脂2%，常规 高温消毒灭菌备用。
1.2菌种及菌液制备：本试验所用菌种除一株标准圆形糠秕 孢子菌(ATCC44344)购自美国，其余均为我科真菌室从正常人头皮 、额部分离所得圆形糠秕孢子菌。将固体培养基上37℃生长1 周的菌落用消毒生理盐水洗脱，并调节菌液浓度为1×106/mL备 用。
, 百拇医药
1.3底物：脂酶特异底物为p-nitrophenylpalmitate(pNPP)(Sigma)。将 pNPP溶于异丙醇配成2mM的原液，取0.5mL加入4.95mL各种pH的PBS，再 加0.05mLTritonX-100摇匀备用。
1.4标准脂酶及检测仪：猪胰腺脂酶(Sigma公司)，批号970425， 活力≥10000U/g，检测仪为511酶标仪(上海第三分析仪器厂生产) 。
1.5金属离子溶液制备：用PBS配制1M浓度的NaCl、KCl、CaCl2、Fe SO4溶液备用。
1.6脂酶活性及影响因素检测
1.6.1脂酶活性的检测：采用Plotkin[2]的方法加以改良，具体 的步骤是：在通用的无菌一次性使用96孔培养板上进行检测。 第1列加300μLPBS，第2列加100μLPBS,200μLpH7.0的底物作对照。 第3～12列加200μLpH7.0的底物，再加上述配制好的100μL菌液， 每株菌一列，共10株菌。然后用不干胶封闭有盖96培养板侧缘 ，放入37℃孵育，1小时后在511酶标仪用波长405nm检测结果。
, 百拇医药
脂酶活性的标准曲线测定：第1列加300μLPBS，第2列加100μ LPBS，200μLpH7.0的底物作对照。第3～10列分别加浓度为500U/mL ，250U/mL，125U/mL，62.5U/mL，31.25U/mL，15.625U/mL，7.8125U/mL，3.90125U /mL的100μL标准脂酶液代替菌液检测结果。
1.6.2pH对脂酶活性的影响的检测：第1列加300μLPBS。第2列加 100μLPBS，200μL底物作对照，其中AB、CD、EF、G、H孔分别加pH 5.8,6.4,7.0,7.4,8.0的底物。第3～12列加200μL底物，其中3～4，5～ 6,7～8,9～10,11～12列分别加pH5.8，6.4，7.0，7.4，8.0的底物。再加 上述配制好的100μL菌液，每株菌一行，共16株菌。然后用不 干胶封闭有盖96培养板侧缘，放入37℃孵育，1小时后检测结果 。
1.6.3金属离子对脂酶活性的影响的检测：第1列加400μLPBS， 第2列加100μLpH7.4PBS，200μL底物，100μL金属离子溶液作对照 ，其中AB，CD，EF，GH孔分别加Ca2+,Na+,Fe2+,K+离子溶液。第 3～10列加200μLpH7.4的底物，其中3～4，5～6，7～8，9～10列 分别加Ca2+,Na+,Fe2+,K+离子溶液。再加上述配制好的100μ L菌液，每株菌一行，共8株菌。然后用不干胶封闭有盖96培养 板侧缘，放入37℃孵育，1小时后检测结果。
, 百拇医药
图1不同pH值对脂酶活性的影响
图2金属离子对脂酶活性的影响
2结果
2.1糠秕孢子菌的脂酶活性：10株糠秕孢子菌的脂酶活性(OD值 及U/mL)详见表1。由表1可见10株糠秕孢子菌的脂酶活性各不相 同，变化较大，最小149U/mL，最大527U/mL，相差达3倍以上。
2.2pH对脂酶活性的影响：不同pH值对16株糠秕孢子菌的脂酶 活性的影响见图1。
2.3金属离子对脂酶活性的影响：在37℃，pH7.4时Ca2+,Na+,Fe 2+,K+金属离子液对8株菌脂酶活性的影响见图2。由图2可见Na +,K+较Ca2+,Fe2+明显增加糠秕孢子菌脂酶的活性。经统计学 检验有显著性差异(P<0.01)。
, 百拇医药
3讨论
糠秕孢子菌一个重要的特性就是利用脂肪作为能量来源。 脂酶活性对糠秕孢子菌的生长起着关键的作用。Wilde等[3]发现 糠秕子菌脂肪酸代谢的最适pH值为4.5，生长的最适pH值为5.5～6 .5。脂酶的刺激剂牛磺胆酸盐可促进脂酶活性，同时促使糠秕 孢子菌从酵母型向菌丝型转化。而糠秕孢子菌从寄生性向致病 性常伴随酵母型向菌丝型转化，所以，脂酶不仅与糠秕孢子 菌的生长有关而且与致病有关。
表1 10株糠秕孢子菌pH7.0时的脂酶活性(OD值及U/mL) 菌株
OD值
U/mL
1
0.774
, 百拇医药
370
2
1.125
527
3
0.386
172
4
0.440
198
5
0.826
384
, 百拇医药
6
0.678
313
7
0.539
246
8
0.698
322
9
0.672
310
10
, 百拇医药
0.340
149
我们检测糠秕孢子菌的脂酶活性及其影响因素，结果表明 每株糠秕孢子菌的脂酶活性有较大的变动。这说明糠秕孢子菌 的脂酶活性存在着株间差异性。这种差异性是否与糠秕孢子 菌的致病性有关还有待进一步研究。
不同pH值对糠秕孢子菌的脂酶活性有明显影响。16株糖秕孢 子菌在不同pH值条件下脂酶活性有明显不同。从合计均值看， 最大脂酶活性值在pH为6.4时测得。这样的结果高于Ran等[4]测得 的脂酶活性最适pH值5.5，但低于Plotkin等[2]测得的脂酶活性最 适pH值7.5。金属离子液对脂酶活性有影响。Na+,K+较Ca2+,Fe2 +明显增加糠秕孢子菌脂酶的活性。经统计学检验有显著性差 异(P<0.01)。这与Plotkin等测得的结果相同。
, http://www.100md.com
P＆G公司资助课题
参考文献
1，Faergemann J. Lipophilic yeasts in skin disease. Semin Dermatol, 1985,4(2):173～ 184
2，Plotkin LI, Squiquera L, Mathov I, et al. Characterization of the lipase activity of Malassezia furfur. J Med Vet Mycol, 1996,34(1):43～ 48
3，Wilde PF, Stewart PS. A study of the fatty acid metabolism of the yeast pityrosporum ovale. Biochem J, 1968,108(2):225～ 231
4，Ran Y, Yoshiike T, Ogawa H. Lipase of Malassezia furfur: some properties and their relationship to cell growth. J Med Vet Mycol, 1993,31(1):77～ 85
(收稿：1999-06-14修回：1999-09-06), 百拇医药