GM-CSF基因转染瘤苗对T淋巴细胞亚群影响的实验研究
作者：刘庆宏 钱海鑫 甘建和 陈易人 孙倍成
单位：扬州大学医学院附属医院 刘庆宏；苏州医学院附属第一医院 钱海鑫 甘建和 陈易人 孙倍成
关键词：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 基因转染 瘤苗 T淋巴细胞亚群
江苏医药990201 摘要 将携带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的重组腺病毒载体转染BALB/C小鼠肝癌细胞株(H22)，体外经60Coγ射线灭活后制成瘤苗，用以治疗荷瘤小鼠。应用流式细胞仪(FCM)测定荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化，并观察荷瘤小鼠生存期。结果发现，GM-CSF基因转染瘤苗能显著提高小鼠外周血CD+8T淋巴细胞亚群的含量，荷瘤小鼠生存期显著延长。结果表明：GM-CSF基因转染瘤苗能诱导出有效的抗肿瘤免疫反应，提示应用该疗法进行肿瘤基因治疗的可行性。
, 百拇医药
The Experimental Study on the Changes of T Lymphocyte Subsets of Mice After Treated with GM-CSF-Transfected Tumor Cells
Liu Qinghong et al
Yangzhou University， Medical College
Abstract H22 cells，a hepatocellular carcinoma cell line of BALB/C mice origin，were transfected with human GM-CSF via recombinant adenovirus and irradiated by 60Co γ ray.Bearing mice were treated by above tumor vaccine.The lymphocyte subsets in peripheral blood of bearing mice were determined by Flow Cytometer (FCM).And the survival stage of the animals was also observed.The results showed that the treatment with GM-CSF-tranfected，irradiated H22 cells not only increased the percentage of CD+8 T-lymphocytes in peripheral blood，but also significantly prolonged the survival stages of the tumor bearing mice.It is concluded that irradiated，GM-CSF-transfected tumor cells can induce effective antitumor immunity，indicating the feasibility of cancer gene therapy.
, 百拇医药
Key words GM-CSF Gene transfection Cancer vaccine T-lymphocyte subset
? 作者曾报道重组腺病毒载体能成功地介导GM-CSF基因转染H22细胞并能有效表达，GM-CSF基因转染瘤苗体内致瘤性显著降低[1]。本文进一步研究了该疗法体内应用后对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响以及对荷瘤小鼠生存期的影响，探讨其免疫机理，以期为该疗法应用于临床肿瘤治疗提供理论依据。
材料与方法
一、主要试剂
携带人GM-CSF基因的重组腺病毒(Ad5亚型)载体以及未携带人GM-CSF基因的假腺病毒颗粒由美国贝勒医学院黄汉贤博士研制并提供。抗L3T+4(CD+4)单抗及抗Lyt-2+(CD+8)单抗购自邦定医学公司。基因重组人IL-2购于上海生物化学研究所。RPMI-1640购自日本制药株式会社。
, 百拇医药
二、动物及细胞株
BALB/C近交系小鼠，雄性，6～8周龄，16～18g，购自中科院上海实验动物中心。BALB/C小鼠肝癌细胞株(H22)购自中科院上海药物研究所。
三、瘤苗的制备及瘤苗的辐照处理 方法见参考文献[1]。
四、T淋巴细胞亚群的测定
小鼠挖眼球采血1ml，肝素抗凝，应用FCM测定，测定前用鸡血红细胞调试仪器变异系数(CV%)，使其稳定在3%以内，每份标本测定5×104细胞，在荧光直方图上分别计算出L3T4及Lyt-2阳性细胞峰的百分率，方法见文献[2]。
五、荷瘤小鼠的制备和治疗观察
, 百拇医药
取体内传代H22肝癌细胞第5～7天的BALB/C小鼠，抽取癌性腹水，用Hanks液洗2遍，配成1×106/ml，给BALB/C小鼠左股部皮下接种0.1ml，当皮下长出肿瘤结节达2mm时随机分为4组，每组10只进行体内实验，下述分组治疗每周一次，连续2周，其中5只用于T淋巴细胞亚群的检测，于荷瘤后第15天取血送检。另5只用于观察生存期。
(A)Hanks对照组：腹腔内注射Hanks液0.1ml/次，每天3次，连续3天。(B)IL-2治疗组：腹腔内注射IL-2，每只2000u，每天3次，连续3天。(C)H22-GM-治疗组：腹腔内注射1×108H22-GM-瘤苗。(D)H22-GM+治疗组：腹腔内注射1×108H22-GM+瘤苗。
, http://www.100md.com
六、统计学分析
采用两样本均数比较的t检验，方差齐性检验。
结 果
一、T淋巴细胞亚群的变化
经H22-GM+治疗后，荷瘤小鼠外周血L3T+4亚群含量无明显变化，各组间差异不明显(P>0.05)，而lyt-2+亚群含量较对照组明显升高(P<0.05)，小鼠L3T+4和Lyt-2+分别相当于人CD+4和CD+8T细胞，由此可见，H22-GM+瘤苗应用能显著提高机体内CD+8T淋巴细胞亚群的含量(见附表)。
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二、对荷瘤小鼠存活期的影响
本实验以皮下接种H22肝癌细胞为荷瘤模型，观察了各种不同治疗对荷瘤小鼠存活期的影响，结果为：A组(Hanks)23.0±2.25、B组(IL-2)26.6±2.25、C组(H22-GM-)24.8±2.71、D组(H22-GM+)52.2±6.61，经统计学处理发现，B、C组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，而D组与对照组差异非常显著(P<0.05)，以上说明H22-GM+瘤苗体内应用后发挥了一定的抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长(如图所示)。
附表 不同治疗后小鼠外周血T淋细胞亚群的变化(
±s，%)
, 百拇医药
L3T4
Lyt-2
A(Hanks)
34.90±5.77
28.19±2.32
B(IL-2)
35.47±4.86
27.88±2.28
C(H22-GM-)
35.26±5.65
27.75±2.14
, 百拇医药
D(H22-GM+)
36.34±6.14
34.23±4.98*
注：与对照组相比*P<0.05
注：与对照组相比 *P<0.005
附图 不同治疗方法对荷瘤小鼠生存期的影响
讨 论
肿瘤免疫的基础是肿瘤特异性抗原的存在，以及免疫系统对肿瘤细胞有效的应答。肿瘤部位免疫系统的局部激活可以通过转染和表达细胞因子基因转染瘤苗而获得，此种细胞因子基因转染瘤苗一方面增强了肿瘤细胞的免疫原性而易被免疫系统所识别；另一方面可以靶向地输送细胞因子，局部高浓度的细胞因子能在缺乏Th细胞的情况下激活并增强CTL的活性，从而达到抗肿瘤的效果。
, http://www.100md.com
T淋巴细胞的研究是现代免疫学的重要课题。近年来随着免疫组织化学及杂交瘤技术的发展，对细胞膜表面的受体、抗原及酶等表面标志，可以通过单克隆抗体进行特异性识别，从而准确地证实淋巴细胞亚群及功能状态。根据细胞表面抗原分化簇(CD)的不同，淋巴细胞(CD+3)分为辅助/诱导(Th/Ti，CD+4)T细胞和细胞毒性/抑制性(Tc/Ts，CD+8)T细胞亚群，各自承担着特定的免疫功能[3]。
机体肿瘤免疫以细胞免疫为主，其中T淋巴细胞在机体内数量最多，构成机体细胞免疫的主要部分，是抗肿瘤免疫中起主导作用的免疫活性细胞[4]，但细胞因子基因转染瘤苗所诱导的免疫反应中CD+4和CD+8细胞所起的作用，目前报道尚少。Dranoff[5]等曾实验证实分泌GM-CSF的黑色素细胞在体内激发的强烈的、长期的、特异性的抗肿瘤免疫反应需CD+4和CD+8T细胞浸润。Armstrong[6]将分泌GM-CSF的黑色素瘤细胞接种小鼠皮下，局部组织切片显示大量CD+4、CD+8T细胞浸润。作者利用流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群，结果发现：GM-CSF基因转染瘤苗治疗后，小鼠外周血L3T+4亚群未见明显升高，而Lyt-2+亚群含量明显升高。小鼠外周L3T+4亚群及Lyt-2+亚群分别相当于人CD+4和CD+8亚群，由此可见治疗作用不是因为CD+4Th细胞增多而引起，而是绕过了CD+4Th细胞直接活化CD+8CTL细胞，从而对肿瘤细胞进行排斥和杀伤。这可能是GM-CSF基因转移瘤苗应用后发挥一定的抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长的主要原因之一。
, 百拇医药
邮政编码：225001
参考文献
[1] 钱海鑫，等.中华实验外科杂志 1998；15(2)：141.
[2] 李其英，等主编.实用临床医学检测.武汉：湖北人民出版社，1998；2：628.
[3] 化积德总主编.肿瘤外科学.北京：人民军医出版社，1994；100.
[4] Henkert PA，et al.Ann Rev Immunnol 1985；3：31.
[5] Dranoff G，et al.Proc Natl Acad Sci USA 1993；90：3539.
[6] Armstrong CA，et al.Cancer Res 1996；1；56(9)：2191.
(1998年6月15日收稿 同年8月5日修回), 百拇医药
单位：扬州大学医学院附属医院 刘庆宏；苏州医学院附属第一医院 钱海鑫 甘建和 陈易人 孙倍成
关键词：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 基因转染 瘤苗 T淋巴细胞亚群
江苏医药990201 摘要 将携带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的重组腺病毒载体转染BALB/C小鼠肝癌细胞株(H22)，体外经60Coγ射线灭活后制成瘤苗，用以治疗荷瘤小鼠。应用流式细胞仪(FCM)测定荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化，并观察荷瘤小鼠生存期。结果发现，GM-CSF基因转染瘤苗能显著提高小鼠外周血CD+8T淋巴细胞亚群的含量，荷瘤小鼠生存期显著延长。结果表明：GM-CSF基因转染瘤苗能诱导出有效的抗肿瘤免疫反应，提示应用该疗法进行肿瘤基因治疗的可行性。
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The Experimental Study on the Changes of T Lymphocyte Subsets of Mice After Treated with GM-CSF-Transfected Tumor Cells
Liu Qinghong et al
Yangzhou University， Medical College
Abstract H22 cells，a hepatocellular carcinoma cell line of BALB/C mice origin，were transfected with human GM-CSF via recombinant adenovirus and irradiated by 60Co γ ray.Bearing mice were treated by above tumor vaccine.The lymphocyte subsets in peripheral blood of bearing mice were determined by Flow Cytometer (FCM).And the survival stage of the animals was also observed.The results showed that the treatment with GM-CSF-tranfected，irradiated H22 cells not only increased the percentage of CD+8 T-lymphocytes in peripheral blood，but also significantly prolonged the survival stages of the tumor bearing mice.It is concluded that irradiated，GM-CSF-transfected tumor cells can induce effective antitumor immunity，indicating the feasibility of cancer gene therapy.
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Key words GM-CSF Gene transfection Cancer vaccine T-lymphocyte subset
? 作者曾报道重组腺病毒载体能成功地介导GM-CSF基因转染H22细胞并能有效表达，GM-CSF基因转染瘤苗体内致瘤性显著降低[1]。本文进一步研究了该疗法体内应用后对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响以及对荷瘤小鼠生存期的影响，探讨其免疫机理，以期为该疗法应用于临床肿瘤治疗提供理论依据。
材料与方法
一、主要试剂
携带人GM-CSF基因的重组腺病毒(Ad5亚型)载体以及未携带人GM-CSF基因的假腺病毒颗粒由美国贝勒医学院黄汉贤博士研制并提供。抗L3T+4(CD+4)单抗及抗Lyt-2+(CD+8)单抗购自邦定医学公司。基因重组人IL-2购于上海生物化学研究所。RPMI-1640购自日本制药株式会社。
, 百拇医药
二、动物及细胞株
BALB/C近交系小鼠，雄性，6～8周龄，16～18g，购自中科院上海实验动物中心。BALB/C小鼠肝癌细胞株(H22)购自中科院上海药物研究所。
三、瘤苗的制备及瘤苗的辐照处理 方法见参考文献[1]。
四、T淋巴细胞亚群的测定
小鼠挖眼球采血1ml，肝素抗凝，应用FCM测定，测定前用鸡血红细胞调试仪器变异系数(CV%)，使其稳定在3%以内，每份标本测定5×104细胞，在荧光直方图上分别计算出L3T4及Lyt-2阳性细胞峰的百分率，方法见文献[2]。
五、荷瘤小鼠的制备和治疗观察
, 百拇医药
取体内传代H22肝癌细胞第5～7天的BALB/C小鼠，抽取癌性腹水，用Hanks液洗2遍，配成1×106/ml，给BALB/C小鼠左股部皮下接种0.1ml，当皮下长出肿瘤结节达2mm时随机分为4组，每组10只进行体内实验，下述分组治疗每周一次，连续2周，其中5只用于T淋巴细胞亚群的检测，于荷瘤后第15天取血送检。另5只用于观察生存期。
(A)Hanks对照组：腹腔内注射Hanks液0.1ml/次，每天3次，连续3天。(B)IL-2治疗组：腹腔内注射IL-2，每只2000u，每天3次，连续3天。(C)H22-GM-治疗组：腹腔内注射1×108H22-GM-瘤苗。(D)H22-GM+治疗组：腹腔内注射1×108H22-GM+瘤苗。
, http://www.100md.com
六、统计学分析
采用两样本均数比较的t检验，方差齐性检验。
结 果
一、T淋巴细胞亚群的变化
经H22-GM+治疗后，荷瘤小鼠外周血L3T+4亚群含量无明显变化，各组间差异不明显(P>0.05)，而lyt-2+亚群含量较对照组明显升高(P<0.05)，小鼠L3T+4和Lyt-2+分别相当于人CD+4和CD+8T细胞，由此可见，H22-GM+瘤苗应用能显著提高机体内CD+8T淋巴细胞亚群的含量(见附表)。
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二、对荷瘤小鼠存活期的影响
本实验以皮下接种H22肝癌细胞为荷瘤模型，观察了各种不同治疗对荷瘤小鼠存活期的影响，结果为：A组(Hanks)23.0±2.25、B组(IL-2)26.6±2.25、C组(H22-GM-)24.8±2.71、D组(H22-GM+)52.2±6.61，经统计学处理发现，B、C组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，而D组与对照组差异非常显著(P<0.05)，以上说明H22-GM+瘤苗体内应用后发挥了一定的抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长(如图所示)。
附表 不同治疗后小鼠外周血T淋细胞亚群的变化(
±s，%), 百拇医药
L3T4
Lyt-2
A(Hanks)
34.90±5.77
28.19±2.32
B(IL-2)
35.47±4.86
27.88±2.28
C(H22-GM-)
35.26±5.65
27.75±2.14
, 百拇医药
D(H22-GM+)
36.34±6.14
34.23±4.98*
注：与对照组相比*P<0.05
注：与对照组相比 *P<0.005
附图 不同治疗方法对荷瘤小鼠生存期的影响
讨 论
肿瘤免疫的基础是肿瘤特异性抗原的存在，以及免疫系统对肿瘤细胞有效的应答。肿瘤部位免疫系统的局部激活可以通过转染和表达细胞因子基因转染瘤苗而获得，此种细胞因子基因转染瘤苗一方面增强了肿瘤细胞的免疫原性而易被免疫系统所识别；另一方面可以靶向地输送细胞因子，局部高浓度的细胞因子能在缺乏Th细胞的情况下激活并增强CTL的活性，从而达到抗肿瘤的效果。
, http://www.100md.com
T淋巴细胞的研究是现代免疫学的重要课题。近年来随着免疫组织化学及杂交瘤技术的发展，对细胞膜表面的受体、抗原及酶等表面标志，可以通过单克隆抗体进行特异性识别，从而准确地证实淋巴细胞亚群及功能状态。根据细胞表面抗原分化簇(CD)的不同，淋巴细胞(CD+3)分为辅助/诱导(Th/Ti，CD+4)T细胞和细胞毒性/抑制性(Tc/Ts，CD+8)T细胞亚群，各自承担着特定的免疫功能[3]。
机体肿瘤免疫以细胞免疫为主，其中T淋巴细胞在机体内数量最多，构成机体细胞免疫的主要部分，是抗肿瘤免疫中起主导作用的免疫活性细胞[4]，但细胞因子基因转染瘤苗所诱导的免疫反应中CD+4和CD+8细胞所起的作用，目前报道尚少。Dranoff[5]等曾实验证实分泌GM-CSF的黑色素细胞在体内激发的强烈的、长期的、特异性的抗肿瘤免疫反应需CD+4和CD+8T细胞浸润。Armstrong[6]将分泌GM-CSF的黑色素瘤细胞接种小鼠皮下，局部组织切片显示大量CD+4、CD+8T细胞浸润。作者利用流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群，结果发现：GM-CSF基因转染瘤苗治疗后，小鼠外周血L3T+4亚群未见明显升高，而Lyt-2+亚群含量明显升高。小鼠外周L3T+4亚群及Lyt-2+亚群分别相当于人CD+4和CD+8亚群，由此可见治疗作用不是因为CD+4Th细胞增多而引起，而是绕过了CD+4Th细胞直接活化CD+8CTL细胞，从而对肿瘤细胞进行排斥和杀伤。这可能是GM-CSF基因转移瘤苗应用后发挥一定的抗肿瘤效应，使荷瘤小鼠存活期明显延长的主要原因之一。
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邮政编码：225001
参考文献
[1] 钱海鑫，等.中华实验外科杂志 1998；15(2)：141.
[2] 李其英，等主编.实用临床医学检测.武汉：湖北人民出版社，1998；2：628.
[3] 化积德总主编.肿瘤外科学.北京：人民军医出版社，1994；100.
[4] Henkert PA，et al.Ann Rev Immunnol 1985；3：31.
[5] Dranoff G，et al.Proc Natl Acad Sci USA 1993；90：3539.
[6] Armstrong CA，et al.Cancer Res 1996；1；56(9)：2191.
(1998年6月15日收稿 同年8月5日修回), 百拇医药