多聚酶链反应检测广州地区不同人群生殖支原体感染情况
作者：罗迪青 翁智胜 宁波 陈志和
单位：广州市第二人民医院皮肤科 510150
关键词：多聚酶链反应；生殖支原体
中国现代医学杂志000421 目的：研究广州地区不同人群生殖支原体(Mg)的感染情况。方法：采用Mg粘附因子基因序列合成的引物MgPa-1和MgPa-3，用多聚酶链反应方法对1997年7～11月间本地区443例不同人群的泌尿生殖首拭子，在3次不同条件下进行了生殖支原体检测，并与阳性对照进行比较。结果：所有标本均未能扩增出任何片断。结论：目前，广州地区人群中生殖支原体感染还是很少见的。
分类号 R759
生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)是泌尿生殖道感染的病原体之一，国外对它的研究也很重视，但国内的报道却不多。目前尚未见广州地区人群中Mg发病情况的报道。我们用多聚酶链反应(PCR)检测了不同人群中的生殖支原体感染情况。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 研究对象
正常组：性活跃期无性生活史的男青年50例，已婚、单一性伴侣的健康妇女57例。高危人群组：卖淫妇女107例，嫖宿者118例(收容所取材)，性病门诊就诊者121例(包括广州医学院附一、附二院及广州市一院、红十字会医院各10例)。
1.2 人群入选要求
正常组在近3个月内没有服大环内酯类、四环素类及喹诺酮类等可以影响支原体生长的药物。卖淫及嫖宿者在被收容后没有治疗过。就诊性病门诊者在就诊前没有经过任何治疗。
1.3 标本采集
用消毒棉拭子，男性为插入尿道2～3 cm，女性则插入宫颈1～2 cm，缓慢旋转1周并停留约10 s，取出，洗脱于蒸馏水，-20 ℃保存。
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1.4 引物设计与合成
根据Mg粘附基因序列，参照Jensen等[1]的序列设计，由上海生物工程服务技术有限公司合成。阳性对照DNA由丹麦J Skov Jensen教授惠赠。
1.5 PCR扩增
用10 min煮沸法制备模板。采用5 μl反应体系，在0.5 ml离心管中进行。其中10×Baffer 5 μl,50×dNTPs 1 μl,MgPa-1+MgPa-3 1 μl,模板量为5 μl，加双蒸水至49.5 μl。上覆40 μl石蜡油。94 ℃预变性5 min后加Taq酶1 u，置于水浴式PCR仪(华美公司生产)，反应湿度及时间分别为94 ℃变性45 s、65 ℃复性45 s、72 ℃延伸60 s，共35个循环。之后72 ℃延伸5 min。对阴性者再按94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s、，共35个循环重复1次。仍阴性者将模板量加至15 μl，按94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s，共36个循环再重复一次。
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1.6 PCR产物的电泳检测
取5 μl反应产物与1 μl电泳指示液(溴酚蓝0.25%，蔗糖40%)混匀，于含0.5 μg/μl溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线灯下观察电泳结果。
2 结果
经MgPa-1和MgPa-3这对引物的检测，其阳性对照有281 bp特异性扩增片断出现，但所有标本经3次不同条件检测，均未能扩增出任何片断。
3 讨论
Mg是第12个被分离的支原体，它生长缓慢，如在Verocell中增殖一代约需16 h,而在传统的SP4培养基中常需1～5月才有改变[1]。在生理学、血清学及遗传学等方面,与肺炎支原体比较接近[2]。培养时营养要求很高，临床较难分离,但其致病性已经肯定。它不但可以引起非淋球菌性尿道炎/宫颈炎，还可以引起盆腔炎等。各地的感染情况不一，国外报道用PCR检测其感染率达6%～23%[3]，但也有检测300例而未见阳性者[4]。1996年北京用PCR检测，卖淫女的感染率为10.2%，性病门诊感染率为4%，但正常产检及妇检均阴性[5]。最近国内有培养分离Mg成功的报道，赵季文等[6]报道分离率3.52%,而性病的分离率为5.21%。而王荷英等[7]报道性病中分离率高达14.1%。说明Mg在我国并不少见。但我们采取不同条件先后3次用PCR法对443例不同人群的泌尿生殖道拭子进行检测，却未见阳性标本，说明目前广州地区人群中Mg感染还是很少见的。张伟云等[8]报道，用MgPa-1及MgPa-3引物行PCR检测Mg时，退火温度对反应产物有影响,当退火温度降至55 ℃时，其它支原体可以出现非特异性扩增。故此，用PCR检测时,应注意条件，以免出现假阳性。但我们的检测过程中尚未见非特异性扩增。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Jensen JS,Uldum SA,Sondergard-Andersen J,et al.Polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma genitalium in clinical samples.J Clin Microbiol,1991;29:46～50
2，Peterson SN,Lucier T,Heitzman K,et al.Genetic map of the Mycoplasma genitalium chromosome.J Bacteriol,1995;177:3199～3204
3，Busolo F,Camposampiero D,Bordignon G,et al.Detection of Mycoplasma genitalium and Chlamydia trachomatis DNAs in male patients with urethritis using the polymerasa chain reaction.New Microbiol,1997;20:325～332
, http://www.100md.com
4，Sharma S,Brousseau R,Kasatiya.Detection and confirmation of Mycoplasma pneumoniae in urogenital specimena by PCR.J Clin Microbiol,1998;36:277～280
5，孔繁荣，朱学骏，周骏马，等.泌尿生殖道人型支原体和生殖支原体的检测.临床皮肤科杂志，1996；25：3
6，赵季文，骆，丹，王婉云，等.高危人群生殖支原体分离培养的初步报告.中华皮肤科杂志，1998；31：147～148
7，王荷英，施美琴，叶顺章，等.非淋球菌性尿道炎的生殖支原体检测.中华皮肤科杂志，1998；31：149～151
8，张伟云，王荷英，叶顺章，等.聚合酶链反应检测生殖支原体的研究.中华皮肤科杂志，1997；30：170～171
收稿1999-12-30
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单位：广州市第二人民医院皮肤科 510150
关键词：多聚酶链反应；生殖支原体
中国现代医学杂志000421 目的：研究广州地区不同人群生殖支原体(Mg)的感染情况。方法：采用Mg粘附因子基因序列合成的引物MgPa-1和MgPa-3，用多聚酶链反应方法对1997年7～11月间本地区443例不同人群的泌尿生殖首拭子，在3次不同条件下进行了生殖支原体检测，并与阳性对照进行比较。结果：所有标本均未能扩增出任何片断。结论：目前，广州地区人群中生殖支原体感染还是很少见的。
分类号 R759
生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)是泌尿生殖道感染的病原体之一，国外对它的研究也很重视，但国内的报道却不多。目前尚未见广州地区人群中Mg发病情况的报道。我们用多聚酶链反应(PCR)检测了不同人群中的生殖支原体感染情况。
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1 资料与方法
1.1 研究对象
正常组：性活跃期无性生活史的男青年50例，已婚、单一性伴侣的健康妇女57例。高危人群组：卖淫妇女107例，嫖宿者118例(收容所取材)，性病门诊就诊者121例(包括广州医学院附一、附二院及广州市一院、红十字会医院各10例)。
1.2 人群入选要求
正常组在近3个月内没有服大环内酯类、四环素类及喹诺酮类等可以影响支原体生长的药物。卖淫及嫖宿者在被收容后没有治疗过。就诊性病门诊者在就诊前没有经过任何治疗。
1.3 标本采集
用消毒棉拭子，男性为插入尿道2～3 cm，女性则插入宫颈1～2 cm，缓慢旋转1周并停留约10 s，取出，洗脱于蒸馏水，-20 ℃保存。
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1.4 引物设计与合成
根据Mg粘附基因序列，参照Jensen等[1]的序列设计，由上海生物工程服务技术有限公司合成。阳性对照DNA由丹麦J Skov Jensen教授惠赠。
1.5 PCR扩增
用10 min煮沸法制备模板。采用5 μl反应体系，在0.5 ml离心管中进行。其中10×Baffer 5 μl,50×dNTPs 1 μl,MgPa-1+MgPa-3 1 μl,模板量为5 μl，加双蒸水至49.5 μl。上覆40 μl石蜡油。94 ℃预变性5 min后加Taq酶1 u，置于水浴式PCR仪(华美公司生产)，反应湿度及时间分别为94 ℃变性45 s、65 ℃复性45 s、72 ℃延伸60 s，共35个循环。之后72 ℃延伸5 min。对阴性者再按94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s、，共35个循环重复1次。仍阴性者将模板量加至15 μl，按94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s，共36个循环再重复一次。
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1.6 PCR产物的电泳检测
取5 μl反应产物与1 μl电泳指示液(溴酚蓝0.25%，蔗糖40%)混匀，于含0.5 μg/μl溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线灯下观察电泳结果。
2 结果
经MgPa-1和MgPa-3这对引物的检测，其阳性对照有281 bp特异性扩增片断出现，但所有标本经3次不同条件检测，均未能扩增出任何片断。
3 讨论
Mg是第12个被分离的支原体，它生长缓慢，如在Verocell中增殖一代约需16 h,而在传统的SP4培养基中常需1～5月才有改变[1]。在生理学、血清学及遗传学等方面,与肺炎支原体比较接近[2]。培养时营养要求很高，临床较难分离,但其致病性已经肯定。它不但可以引起非淋球菌性尿道炎/宫颈炎，还可以引起盆腔炎等。各地的感染情况不一，国外报道用PCR检测其感染率达6%～23%[3]，但也有检测300例而未见阳性者[4]。1996年北京用PCR检测，卖淫女的感染率为10.2%，性病门诊感染率为4%，但正常产检及妇检均阴性[5]。最近国内有培养分离Mg成功的报道，赵季文等[6]报道分离率3.52%,而性病的分离率为5.21%。而王荷英等[7]报道性病中分离率高达14.1%。说明Mg在我国并不少见。但我们采取不同条件先后3次用PCR法对443例不同人群的泌尿生殖道拭子进行检测，却未见阳性标本，说明目前广州地区人群中Mg感染还是很少见的。张伟云等[8]报道，用MgPa-1及MgPa-3引物行PCR检测Mg时，退火温度对反应产物有影响,当退火温度降至55 ℃时，其它支原体可以出现非特异性扩增。故此，用PCR检测时,应注意条件，以免出现假阳性。但我们的检测过程中尚未见非特异性扩增。
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参 考 文 献
1，Jensen JS,Uldum SA,Sondergard-Andersen J,et al.Polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma genitalium in clinical samples.J Clin Microbiol,1991;29:46～50
2，Peterson SN,Lucier T,Heitzman K,et al.Genetic map of the Mycoplasma genitalium chromosome.J Bacteriol,1995;177:3199～3204
3，Busolo F,Camposampiero D,Bordignon G,et al.Detection of Mycoplasma genitalium and Chlamydia trachomatis DNAs in male patients with urethritis using the polymerasa chain reaction.New Microbiol,1997;20:325～332
, http://www.100md.com
4，Sharma S,Brousseau R,Kasatiya.Detection and confirmation of Mycoplasma pneumoniae in urogenital specimena by PCR.J Clin Microbiol,1998;36:277～280
5，孔繁荣，朱学骏，周骏马，等.泌尿生殖道人型支原体和生殖支原体的检测.临床皮肤科杂志，1996；25：3
6，赵季文，骆，丹，王婉云，等.高危人群生殖支原体分离培养的初步报告.中华皮肤科杂志，1998；31：147～148
7，王荷英，施美琴，叶顺章，等.非淋球菌性尿道炎的生殖支原体检测.中华皮肤科杂志，1998；31：149～151
8，张伟云，王荷英，叶顺章，等.聚合酶链反应检测生殖支原体的研究.中华皮肤科杂志，1997；30：170～171
收稿1999-12-30
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