IgH、TCRδ基因重排与急性非淋巴细胞白血病的相关性
作者：王阳 王玮 陆庭伟 潘金兰 李建勇 吴德沛 陈子兴
单位：215006 苏州医学院第一附属医院、江苏省血液研究所
关键词：聚合酶链反应；白血病，非淋巴细胞性，急性；免疫球蛋白，重链；T细胞受体δ链
中华血液学杂志000508 【摘要】 目的 探讨初诊急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者中免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体δ链(TCRδ)基因重排情况。方法 用聚合酶链反应方法检测IgH及TCRδ基因重排。结果 30例患者中9例(30%)发生IgH基因重排，5例出现TCRδ基因重排。结论 ANLL中确实存在系列不保真现象：不仅具有较高的IgH重排发生率，还具有TCRδ重排发生。
The rearrangements of immunoglobulin heavy chain and T cell receptor δ genes in patients with acute nonlymphocytic leukemia
, 百拇医药
WANG Yang, WANG Wei, LU Tingwei, et al.
(The First Affiliated Hospital, Suzhou Medical College,Suzhou 215006，China)
【Abstract】 Objective To explore the clinical significance of rearrangements of immunoglobulin heavy chain (IgH) and T cell receptor(TCR) genes in patients with acute nonlymphocytic leukemias. Methods Polymerase chain reaction(PCR) was used to study IgH and TCRδ genes rearrangements in 30 untreated acute nonlymphocytic leukemia patients. Results IgH gene rearrangements were found in 9 patients, and TCRδ gene rearrangements in 5 patients. Conclusion The lineage infidelity does occur in acute nonlymphocytic leukemia, showing not only a high frequency of IgH gene rearrangement, but also of TCRδ gene rearrangement.
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【Key words】 Polymerase chain reaction(PCR)； Leukemia,nonlymphocytic,acute; Immunoglobulin, heavy chain; T cell receptor δ chain
目前认为，当多能造血干细胞向淋巴细胞系定向分化时可发生免疫球蛋白重链(IgH)、T细胞受体(TCR)基因特异性重排，因此，重排的IgH、TCR基因可作为淋巴细胞克隆标志。然而，上述特异性重排发生在急性非淋巴细胞白血病(ANLL)中的报道已陆续出现[1-5]。但初诊患者中的发生率及其相关临床意义仍有待进一步研究。我们用聚合酶链反应(PCR)方法对30例初诊ANLL患者进行了IgH、TCRδ基因重排的检测，并就相关问题作了探讨。
病例和方法
1 病例 经形态学和免疫学确诊的ANLL患者30例，FAB分型中M1 6例，M2 6例，M3 12例，M4 2例，M5 3例，M6 1例。均为初诊患者。
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2 免疫分型采用细胞间接免疫荧光进行标记，Epics XL型流式细胞仪(Coulter, USA)检测。所用单克隆抗体T系列为CD2、CD3、CD7；B系列为CD10、CD19、CD22；髓系系列为CD13、CD14、CD33；干/祖细胞抗原为CD34。均购自Immunotech公司。第二抗体为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠免疫球蛋白，购自军事医学科学院。结果判定：CD34细胞阳性率>10%为阳性指标，其余抗原阳性细胞>20%为阳性标准。
3 寡核苷酸引物选择 根据PCR引物设计原则，参考文献[4，6]设计如下引物：①针对IgH CDR-Ⅲ区域、Ⅴ区和J区的共同保守序列的引物A和B，引物序列：A：5′-ACACGGCCGTGTATTACTGT-3′；B：5′-ACTCTAGAGGAGACGGTGACC-3′。②针对TCRδ基因重排所产生的DNA片段，引物序列为：A：5′-GTGTGTATTTGTGGCCTTCAGCTAC-3′；B：5′-AAATGCTAGCTATTTCACCCA-3′。以上引物均由上海Sagon公司合成。
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4 标本来源为骨髓细胞。DNA提取见文献[7]。
5 PCR反应及产物检测 反应体系为50μl，Taq DNA聚合酶2.0U(Sagon),0.5μg DNA模板，100mmol/L dNTP，引物各100ng。针对IgH的PCR反应条件为94℃ 30s,56℃ 45s,72℃ 105s，共32个循环[5]。针对TCRδ基因重排的PCR条件为94℃ 60s，56℃ 60s， 72℃ 120s，共35个循环[6]。取扩增产物6μl，20g/L琼脂糖凝胶，TAE电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
结果
1 IgH重排 30例患者中9例PCR检测阳性，阳性率为30.0%。PCR特异性产物约为110bp，不同个体间产物亮度略有差异，且较急性淋巴细胞白血病(急淋)阳性标本为弱。阳性标本在FAB分型中的分布为M1 2例，M2 2例，M3 4例，M5 1例。见图1。
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图1 PCR扩增ANLL中重排IgH基因
2 TCRδ重排 30例患者中共有5例出现特异性阳性区带，片段大小约190bp。FAB分型：M1 2例，M2 2例，M3 1例。见图2。
图2 PCR扩增ANLL中的TCRδ重排基因
3 30例患者中随访16例(M1 2例，M2 3例，M3 9例，M4 1例，M5 1例)，其中4例IgH阳性；1例TCRδ阳性；1例M1 IgH、TCRδ双阳性。 除M3用全反式维甲酸诱导缓解外，余均用以柔红霉素(30～60mg/m2)、阿糖胞苷(100～200mg/m2)为主的DA方案诱导缓解。按照目前临床普遍接受的标准：两个疗程以上强烈化疗未获缓解即为难治性白血病[8]，6例阳性患者中，只有1例双阳性者为难治性白血病；10例阴性者中2例达到这一标准。
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4 30例患者中出现淋系相关抗原的有6例。它与FAB分型及IgH/TCRδ重排间的关系见表1。
讨论
白血病分型已从一般形态学和免疫学分型进入基因分型。通过设计引物扩增IgH基因重排产生的CDR-Ⅲ序列和TCR基因重排序列，可作为临床诊断急性淋巴细胞白血病恶性增殖的指标。但近来发现，IgH和TCR基因重排也可在其它分化系列的细胞上出现，如Rovigatti等[1]在ANLL 14例中利用Southern杂交发现2例具有IgH基因重排，此即系列不保真(lineage infidelity)[9]。最近有文献报道，利用PCR方法也发现了ANLL中出现IgH基因重排和TCRγ基因重排，但各家报道不一。陈冬梅等[3]在17例初诊ANLL患者中发现2例，徐兵等[4]在29例初诊ANLL患者中发现4例IgH基因重排，我们利用Kyoda等[5]设计的反应条件，对30例ANLL患者进行了IgH的PCR检测，结果不仅证明IgH重排并不局限于淋巴系统肿瘤，同时发现其在ANLL中的表达可能远高于文献的报道，达到了30%，而Kyoda等则达到了40%(共35例)，说明随着检测手段的改进以及灵敏度的提高，这种系列不保真现象的发生率可能较目前所知的更高。
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表1 出现阳性的淋系相关抗原与FAB分型及IgH/TCRδ
重排的关系 出现阳性的
淋系相关抗原
例数
FAB分型
基因重排
CD2
2
M3
IgH
M5
(-)
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CD7
2
M1
IgH及TCRδ
M1
(-)
CD2、CD7
1
M2
TCRδ
CD19
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1
M2
TCRδ
关于TCR基因重排在非淋巴细胞白血病中发生的现象，Schmist等[2]曾对ANLL 100例进行的Southern分析发现9例具有TCR基因重排，陈冬梅等[3]利用PCR方法在17例初诊患者中发现了3例具有TCRγ基因重排。我们利用该法对初诊ANLL患者30例TCRδ的基因重排进行了检测，结果发现5例阳性，与陈冬梅等TCRγ基因重排的检出率基本相同。
如何解释这种系列不保真现象，各家说法不一。多数学者认为，可能恶性克隆最初发生在多能干细胞阶段，但肿瘤本身更促使变化了的多能干细胞向髓系定向发展，因此从形态学角度，细胞仍以髓系特点为主。Greaves等[9]对他及其它研究小组发现的淋、髓两系中系列不保真现象进行总结，认为在排除技术因素后，那些确实具有系列不保真现象的标本，不是因为细胞内基因发生了错排，而是因为正常多能干细胞中本身存在着短暂的基因表达混杂现象(promiscuity)，上述患者中，由于成熟障碍致使原始的白血病细胞保留了上述混杂现象的痕迹。从30例ANLL患者的免疫表型也可看出，这些患者中共有6例出现了淋巴细胞系相关抗原。当然，值得注意的是，这种免疫表型的“不保真性”与IgH/TCRδ重排间并无明显的相关性，其原因有待进一步了解。
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上述系列不保真现象是否具有一定的临床意义针对可随访的16例患者所做的治疗效果分析未显示出统计学差异(P=0.5)。但观察例数较少。同时，治疗方案的不同(如M3多使用全反式维甲酸治疗，余病例则用ANLL相关的化疗方案)也掩盖了患者白血病细胞生物学特性的差异。值得注意的是：仅1例IgH、TCRδ双阳性患者表现出明显的难治性白血病特点，我们在另一组慢性粒细胞白血病患者中发现1例患者具有IgH重排，其在接受异基因造血干细胞移植后6个月以急淋变的形式复发。Kyoda等[5]对35例ANLL的观察也提示IgH重排阳性组较阴性组生存期长(P=0.2)。还有文献报道在ANLL缓解期中发现IgH重排的出现并可预测微小残留病变[3，4]。这些结果均表明系列不保真现象的临床价值不容忽视。
总之，作为B、T急淋基因分型的重要标志的IgH、TCR基因重排确实存在系列不保真现象。一方面，它提示我们IgH、TCR基因重排可能不宜作为ALL的绝对指标。同时，它为分子水平的杂合性白血病的诊断提供了依据。另外，在理论上，它也为研究白血病在造血细胞分化阶段的发生提供了新的资料。
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参考文献
1，Rovigatti U, Mirro J, Kitchingman G, et al. Heavy chain immunology gene rearrangement in acute nonlymphocytic leukemia. Blood, 1984, 63:1023-1027.
2，Schmist CA, Oettle H, Neubauer A, et al. Rearrangements of T-cell receptor δ,τ and β genes in acute myeloid leukemia coexpressing T-lymphoid features. Leukemia, 1992, 6:1263-1267.
3，陈冬梅，王辨明，李崇渔，等. 急性非淋巴细胞白血病免疫球蛋白和T细胞受体基因的研究及意义. 临床血液学杂志，1997， 10：98-101.
, 百拇医药
4，徐兵，周淑云，孙竟. 聚合酶链反应联合Southern杂交检测急性非淋巴细胞白血病IgH基因重排. 中华内科杂志，1996，35：587-590.
5，Kyoda K, Nakamura S, Matano S, et al. Prognostic significance of immunoglobulin heavy chain gene rearrangement in patients with acute myelogenous leukemia. Leukemia, 1997, 11:801-806.
6，林万明，主编.PCR技术操作和应用指南. 北京：人民军医出版社，1990. 422-424.
7，J 萨姆布鲁克，ET 弗里奇，T 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第2版. 北京：科学出版社， 1995. 463-469.
8，杨天楹，刘海川，卞寿庚，等. 急性白血病的治疗. 中国实用内科杂志，1994，14：515-520.
9，Greaves MF, Chan LC, Furley AJW, et al. Lineage promiscuity in hemopoietic differentiation and leukemia. Blood, 1986,67:1-7.
(收稿日期：1999-12-28), 百拇医药
单位：215006 苏州医学院第一附属医院、江苏省血液研究所
关键词：聚合酶链反应；白血病，非淋巴细胞性，急性；免疫球蛋白，重链；T细胞受体δ链
中华血液学杂志000508 【摘要】 目的 探讨初诊急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者中免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体δ链(TCRδ)基因重排情况。方法 用聚合酶链反应方法检测IgH及TCRδ基因重排。结果 30例患者中9例(30%)发生IgH基因重排，5例出现TCRδ基因重排。结论 ANLL中确实存在系列不保真现象：不仅具有较高的IgH重排发生率，还具有TCRδ重排发生。
The rearrangements of immunoglobulin heavy chain and T cell receptor δ genes in patients with acute nonlymphocytic leukemia
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WANG Yang, WANG Wei, LU Tingwei, et al.
(The First Affiliated Hospital, Suzhou Medical College,Suzhou 215006，China)
【Abstract】 Objective To explore the clinical significance of rearrangements of immunoglobulin heavy chain (IgH) and T cell receptor(TCR) genes in patients with acute nonlymphocytic leukemias. Methods Polymerase chain reaction(PCR) was used to study IgH and TCRδ genes rearrangements in 30 untreated acute nonlymphocytic leukemia patients. Results IgH gene rearrangements were found in 9 patients, and TCRδ gene rearrangements in 5 patients. Conclusion The lineage infidelity does occur in acute nonlymphocytic leukemia, showing not only a high frequency of IgH gene rearrangement, but also of TCRδ gene rearrangement.
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【Key words】 Polymerase chain reaction(PCR)； Leukemia,nonlymphocytic,acute; Immunoglobulin, heavy chain; T cell receptor δ chain
目前认为，当多能造血干细胞向淋巴细胞系定向分化时可发生免疫球蛋白重链(IgH)、T细胞受体(TCR)基因特异性重排，因此，重排的IgH、TCR基因可作为淋巴细胞克隆标志。然而，上述特异性重排发生在急性非淋巴细胞白血病(ANLL)中的报道已陆续出现[1-5]。但初诊患者中的发生率及其相关临床意义仍有待进一步研究。我们用聚合酶链反应(PCR)方法对30例初诊ANLL患者进行了IgH、TCRδ基因重排的检测，并就相关问题作了探讨。
病例和方法
1 病例 经形态学和免疫学确诊的ANLL患者30例，FAB分型中M1 6例，M2 6例，M3 12例，M4 2例，M5 3例，M6 1例。均为初诊患者。
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2 免疫分型采用细胞间接免疫荧光进行标记，Epics XL型流式细胞仪(Coulter, USA)检测。所用单克隆抗体T系列为CD2、CD3、CD7；B系列为CD10、CD19、CD22；髓系系列为CD13、CD14、CD33；干/祖细胞抗原为CD34。均购自Immunotech公司。第二抗体为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠免疫球蛋白，购自军事医学科学院。结果判定：CD34细胞阳性率>10%为阳性指标，其余抗原阳性细胞>20%为阳性标准。
3 寡核苷酸引物选择 根据PCR引物设计原则，参考文献[4，6]设计如下引物：①针对IgH CDR-Ⅲ区域、Ⅴ区和J区的共同保守序列的引物A和B，引物序列：A：5′-ACACGGCCGTGTATTACTGT-3′；B：5′-ACTCTAGAGGAGACGGTGACC-3′。②针对TCRδ基因重排所产生的DNA片段，引物序列为：A：5′-GTGTGTATTTGTGGCCTTCAGCTAC-3′；B：5′-AAATGCTAGCTATTTCACCCA-3′。以上引物均由上海Sagon公司合成。
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4 标本来源为骨髓细胞。DNA提取见文献[7]。
5 PCR反应及产物检测 反应体系为50μl，Taq DNA聚合酶2.0U(Sagon),0.5μg DNA模板，100mmol/L dNTP，引物各100ng。针对IgH的PCR反应条件为94℃ 30s,56℃ 45s,72℃ 105s，共32个循环[5]。针对TCRδ基因重排的PCR条件为94℃ 60s，56℃ 60s， 72℃ 120s，共35个循环[6]。取扩增产物6μl，20g/L琼脂糖凝胶，TAE电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
结果
1 IgH重排 30例患者中9例PCR检测阳性，阳性率为30.0%。PCR特异性产物约为110bp，不同个体间产物亮度略有差异，且较急性淋巴细胞白血病(急淋)阳性标本为弱。阳性标本在FAB分型中的分布为M1 2例，M2 2例，M3 4例，M5 1例。见图1。
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图1 PCR扩增ANLL中重排IgH基因
2 TCRδ重排 30例患者中共有5例出现特异性阳性区带，片段大小约190bp。FAB分型：M1 2例，M2 2例，M3 1例。见图2。
图2 PCR扩增ANLL中的TCRδ重排基因
3 30例患者中随访16例(M1 2例，M2 3例，M3 9例，M4 1例，M5 1例)，其中4例IgH阳性；1例TCRδ阳性；1例M1 IgH、TCRδ双阳性。 除M3用全反式维甲酸诱导缓解外，余均用以柔红霉素(30～60mg/m2)、阿糖胞苷(100～200mg/m2)为主的DA方案诱导缓解。按照目前临床普遍接受的标准：两个疗程以上强烈化疗未获缓解即为难治性白血病[8]，6例阳性患者中，只有1例双阳性者为难治性白血病；10例阴性者中2例达到这一标准。
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4 30例患者中出现淋系相关抗原的有6例。它与FAB分型及IgH/TCRδ重排间的关系见表1。
讨论
白血病分型已从一般形态学和免疫学分型进入基因分型。通过设计引物扩增IgH基因重排产生的CDR-Ⅲ序列和TCR基因重排序列，可作为临床诊断急性淋巴细胞白血病恶性增殖的指标。但近来发现，IgH和TCR基因重排也可在其它分化系列的细胞上出现，如Rovigatti等[1]在ANLL 14例中利用Southern杂交发现2例具有IgH基因重排，此即系列不保真(lineage infidelity)[9]。最近有文献报道，利用PCR方法也发现了ANLL中出现IgH基因重排和TCRγ基因重排，但各家报道不一。陈冬梅等[3]在17例初诊ANLL患者中发现2例，徐兵等[4]在29例初诊ANLL患者中发现4例IgH基因重排，我们利用Kyoda等[5]设计的反应条件，对30例ANLL患者进行了IgH的PCR检测，结果不仅证明IgH重排并不局限于淋巴系统肿瘤，同时发现其在ANLL中的表达可能远高于文献的报道，达到了30%，而Kyoda等则达到了40%(共35例)，说明随着检测手段的改进以及灵敏度的提高，这种系列不保真现象的发生率可能较目前所知的更高。
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表1 出现阳性的淋系相关抗原与FAB分型及IgH/TCRδ
重排的关系 出现阳性的
淋系相关抗原
例数
FAB分型
基因重排
CD2
2
M3
IgH
M5
(-)
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CD7
2
M1
IgH及TCRδ
M1
(-)
CD2、CD7
1
M2
TCRδ
CD19
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1
M2
TCRδ
关于TCR基因重排在非淋巴细胞白血病中发生的现象，Schmist等[2]曾对ANLL 100例进行的Southern分析发现9例具有TCR基因重排，陈冬梅等[3]利用PCR方法在17例初诊患者中发现了3例具有TCRγ基因重排。我们利用该法对初诊ANLL患者30例TCRδ的基因重排进行了检测，结果发现5例阳性，与陈冬梅等TCRγ基因重排的检出率基本相同。
如何解释这种系列不保真现象，各家说法不一。多数学者认为，可能恶性克隆最初发生在多能干细胞阶段，但肿瘤本身更促使变化了的多能干细胞向髓系定向发展，因此从形态学角度，细胞仍以髓系特点为主。Greaves等[9]对他及其它研究小组发现的淋、髓两系中系列不保真现象进行总结，认为在排除技术因素后，那些确实具有系列不保真现象的标本，不是因为细胞内基因发生了错排，而是因为正常多能干细胞中本身存在着短暂的基因表达混杂现象(promiscuity)，上述患者中，由于成熟障碍致使原始的白血病细胞保留了上述混杂现象的痕迹。从30例ANLL患者的免疫表型也可看出，这些患者中共有6例出现了淋巴细胞系相关抗原。当然，值得注意的是，这种免疫表型的“不保真性”与IgH/TCRδ重排间并无明显的相关性，其原因有待进一步了解。
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上述系列不保真现象是否具有一定的临床意义针对可随访的16例患者所做的治疗效果分析未显示出统计学差异(P=0.5)。但观察例数较少。同时，治疗方案的不同(如M3多使用全反式维甲酸治疗，余病例则用ANLL相关的化疗方案)也掩盖了患者白血病细胞生物学特性的差异。值得注意的是：仅1例IgH、TCRδ双阳性患者表现出明显的难治性白血病特点，我们在另一组慢性粒细胞白血病患者中发现1例患者具有IgH重排，其在接受异基因造血干细胞移植后6个月以急淋变的形式复发。Kyoda等[5]对35例ANLL的观察也提示IgH重排阳性组较阴性组生存期长(P=0.2)。还有文献报道在ANLL缓解期中发现IgH重排的出现并可预测微小残留病变[3，4]。这些结果均表明系列不保真现象的临床价值不容忽视。
总之，作为B、T急淋基因分型的重要标志的IgH、TCR基因重排确实存在系列不保真现象。一方面，它提示我们IgH、TCR基因重排可能不宜作为ALL的绝对指标。同时，它为分子水平的杂合性白血病的诊断提供了依据。另外，在理论上，它也为研究白血病在造血细胞分化阶段的发生提供了新的资料。
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参考文献
1，Rovigatti U, Mirro J, Kitchingman G, et al. Heavy chain immunology gene rearrangement in acute nonlymphocytic leukemia. Blood, 1984, 63:1023-1027.
2，Schmist CA, Oettle H, Neubauer A, et al. Rearrangements of T-cell receptor δ,τ and β genes in acute myeloid leukemia coexpressing T-lymphoid features. Leukemia, 1992, 6:1263-1267.
3，陈冬梅，王辨明，李崇渔，等. 急性非淋巴细胞白血病免疫球蛋白和T细胞受体基因的研究及意义. 临床血液学杂志，1997， 10：98-101.
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4，徐兵，周淑云，孙竟. 聚合酶链反应联合Southern杂交检测急性非淋巴细胞白血病IgH基因重排. 中华内科杂志，1996，35：587-590.
5，Kyoda K, Nakamura S, Matano S, et al. Prognostic significance of immunoglobulin heavy chain gene rearrangement in patients with acute myelogenous leukemia. Leukemia, 1997, 11:801-806.
6，林万明，主编.PCR技术操作和应用指南. 北京：人民军医出版社，1990. 422-424.
7，J 萨姆布鲁克，ET 弗里奇，T 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第2版. 北京：科学出版社， 1995. 463-469.
8，杨天楹，刘海川，卞寿庚，等. 急性白血病的治疗. 中国实用内科杂志，1994，14：515-520.
9，Greaves MF, Chan LC, Furley AJW, et al. Lineage promiscuity in hemopoietic differentiation and leukemia. Blood, 1986,67:1-7.
(收稿日期：1999-12-28), 百拇医药