半巢式聚合酶链反应检测外套细胞淋巴瘤bcl-1/IgH基因重排
作者：孙文佶 林茂芳 蔡真 Reza Parwaresch
单位：孙文佶 林茂芳 蔡真(浙江医科大学附属第一医院血液病研究所 杭州，310003)；Reza Parwaresch(德国基尔大学血液病理研究所)
关键词：
中华检验医学杂志000618 外套细胞淋巴瘤(Mantle Cell Lymphoma, MCL) 是一类具有独特临床病理特征的非何杰金淋巴瘤，临床表现为病程进展快，对常规化疗耐受，但单纯依赖形态学特征进行诊断非常困难[1]。因此，寻找一种敏感而特异的检测方法来明确诊断就显得尤为重要。我们利用半巢式聚合酶链反应(semi-nested PCR)来检测此病患者的bcl-1/IgH基因的重排，得到了较好的结果。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.病例：28例外套细胞淋巴瘤来自1987～1990年德国病理协会下属的基尔淋巴结登记中心。以淋巴结的新鲜冰冻组织作为实验材料。诊断依据于基尔分类标准中对中央细胞性淋巴瘤病理特征的定义。
2.基因组DNA提取：采用QIAamp组织DNA提取试剂盒(Germany)。
3.半巢式PCR扩增bcl-1/IgH 连接区序列：引物序列如下，JH：5′-GGTCACCGTCTCCTCTAGGT-3′，P2(外侧引物)：5′-CTGAAGGACTTGTGGGTTGC-3′，Bcl-N(内侧引物)：5′-TCTTTATCTGAGTGGGATGAGATTA-3′。反应条件为：95℃ 15 min，95℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 10 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。将此PCR产物1∶1 000稀释进行第2轮循环，退火温度改为60℃。实验以带有t(11；14) 染色体易位的白血病细胞株JVM-2为阳性对照，阴性对照为不含t(11；14)的白血病细胞株JVM-13。最后将2 μl的反应终产物进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察结果。
, 百拇医药
二、结果
28例经半巢式PCR反应后，有17例出现特异的扩增产物，片断大小在80～160 bp，阳性检出率为60.7%。而一步PCR循环后，仅有9例出现特异的扩增条带，扩增产物在300～420 bp，阳性检出率为32.1%，两者差异有显著意义(P<0.05)。
三、讨论
对外套细胞淋巴瘤进行单纯形态学诊断是非常困难的，而且并非所有的病例都表现出特征性的MCL表面抗原，因此，分子遗传学的数据将有助于明确诊断。t(11;14)易位已被证明与MCL有很好的相关性，并可作为一可信的疾病标志[2]，其分子伴侣为bcl-1/IgH基因的重排。如采用常规的细胞遗传学方法，可测到65%以上的MCL病例有该易位，而采用Southern 杂交，可测得约50%的MCL病例有bcl-1基因的重排。但这两种方法均有费时和价格昂贵的缺陷。我们采用半巢式PCR能检测到60.7%MCL的新鲜冰冻组织有bcl-1/IgH基因重排，与以往的报道相似[3，4]。对本组标本我们还同时与一步PCR的结果进行了比较，发现再采用位于引物P2内侧的引物bcl-N和JH一起进行第2轮PCR扩增，则有17例标本有特异的bcl-1/IgH扩增，其敏感性明显高于一步PCR(P<0.05)，一步PCR时仅测得7例 MCL的新鲜冰冻组织有bcl-1/IgH基因重排(32.1 %)。
, http://www.100md.com
此外，PCR扩增后的bcl-1/IgH产物，大小不等，从80～160 bp，这是由于每一例MCL病人bcl-1上的断裂点不同，以及跨越到14号染色体不同的JH和所插入的额外的核苷酸序列的多少有关。
在某些病例中，除了特异性的bcl-1/IgH扩增产物外，还能看到第2条扩增片断，这是由于共义的JH引物与其他的JH片断发生退火现象，而该JH又位于直接发生易位的JH片断内侧所造成[4]。
因此，我们的研究证实了半巢式PCR方法在检测位于MTC区域内的bcl-1/IgH基因重排时的特异性和敏感性，该方法会有助于MCL的分子特征的鉴别及明确诊断，从而为治疗和预后判断及微小残留病灶(MRD)的检测提供帮助。
参考文献
1，Campo ME, Raffeld M, Jaffe ES. Mantle cell lymphoma. Semi Hemato, 1999,36:115-127.
, http://www.100md.com
2，Banks PM, Chan J, Cleary ML, et al. Mantle cell lymphoma: a proposal for unification of morphologic, immunologic, and molecular data. Am J Surg Pathol,1992,16:637-641.
3，Pott C, Tiemann M, Linke B, et al. Structure of Bcl-1 and IgH-CDR3 rearranggements as clonal markers in mantle cell lymphomas. Leukemia,1998,12:1630-1637.
4，Rimokh R, Berger F, Delsol G, et al. Dection of the chromosomal t(11;14) by polymerase chain reaction in mantle cell lymphomas. Blood,1994,3:1871-1875.
(收稿日期：2000-01-10), http://www.100md.com
单位：孙文佶 林茂芳 蔡真(浙江医科大学附属第一医院血液病研究所 杭州，310003)；Reza Parwaresch(德国基尔大学血液病理研究所)
关键词：
中华检验医学杂志000618 外套细胞淋巴瘤(Mantle Cell Lymphoma, MCL) 是一类具有独特临床病理特征的非何杰金淋巴瘤，临床表现为病程进展快，对常规化疗耐受，但单纯依赖形态学特征进行诊断非常困难[1]。因此，寻找一种敏感而特异的检测方法来明确诊断就显得尤为重要。我们利用半巢式聚合酶链反应(semi-nested PCR)来检测此病患者的bcl-1/IgH基因的重排，得到了较好的结果。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.病例：28例外套细胞淋巴瘤来自1987～1990年德国病理协会下属的基尔淋巴结登记中心。以淋巴结的新鲜冰冻组织作为实验材料。诊断依据于基尔分类标准中对中央细胞性淋巴瘤病理特征的定义。
2.基因组DNA提取：采用QIAamp组织DNA提取试剂盒(Germany)。
3.半巢式PCR扩增bcl-1/IgH 连接区序列：引物序列如下，JH：5′-GGTCACCGTCTCCTCTAGGT-3′，P2(外侧引物)：5′-CTGAAGGACTTGTGGGTTGC-3′，Bcl-N(内侧引物)：5′-TCTTTATCTGAGTGGGATGAGATTA-3′。反应条件为：95℃ 15 min，95℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 10 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。将此PCR产物1∶1 000稀释进行第2轮循环，退火温度改为60℃。实验以带有t(11；14) 染色体易位的白血病细胞株JVM-2为阳性对照，阴性对照为不含t(11；14)的白血病细胞株JVM-13。最后将2 μl的反应终产物进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察结果。
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二、结果
28例经半巢式PCR反应后，有17例出现特异的扩增产物，片断大小在80～160 bp，阳性检出率为60.7%。而一步PCR循环后，仅有9例出现特异的扩增条带，扩增产物在300～420 bp，阳性检出率为32.1%，两者差异有显著意义(P<0.05)。
三、讨论
对外套细胞淋巴瘤进行单纯形态学诊断是非常困难的，而且并非所有的病例都表现出特征性的MCL表面抗原，因此，分子遗传学的数据将有助于明确诊断。t(11;14)易位已被证明与MCL有很好的相关性，并可作为一可信的疾病标志[2]，其分子伴侣为bcl-1/IgH基因的重排。如采用常规的细胞遗传学方法，可测到65%以上的MCL病例有该易位，而采用Southern 杂交，可测得约50%的MCL病例有bcl-1基因的重排。但这两种方法均有费时和价格昂贵的缺陷。我们采用半巢式PCR能检测到60.7%MCL的新鲜冰冻组织有bcl-1/IgH基因重排，与以往的报道相似[3，4]。对本组标本我们还同时与一步PCR的结果进行了比较，发现再采用位于引物P2内侧的引物bcl-N和JH一起进行第2轮PCR扩增，则有17例标本有特异的bcl-1/IgH扩增，其敏感性明显高于一步PCR(P<0.05)，一步PCR时仅测得7例 MCL的新鲜冰冻组织有bcl-1/IgH基因重排(32.1 %)。
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此外，PCR扩增后的bcl-1/IgH产物，大小不等，从80～160 bp，这是由于每一例MCL病人bcl-1上的断裂点不同，以及跨越到14号染色体不同的JH和所插入的额外的核苷酸序列的多少有关。
在某些病例中，除了特异性的bcl-1/IgH扩增产物外，还能看到第2条扩增片断，这是由于共义的JH引物与其他的JH片断发生退火现象，而该JH又位于直接发生易位的JH片断内侧所造成[4]。
因此，我们的研究证实了半巢式PCR方法在检测位于MTC区域内的bcl-1/IgH基因重排时的特异性和敏感性，该方法会有助于MCL的分子特征的鉴别及明确诊断，从而为治疗和预后判断及微小残留病灶(MRD)的检测提供帮助。
参考文献
1，Campo ME, Raffeld M, Jaffe ES. Mantle cell lymphoma. Semi Hemato, 1999,36:115-127.
, http://www.100md.com
2，Banks PM, Chan J, Cleary ML, et al. Mantle cell lymphoma: a proposal for unification of morphologic, immunologic, and molecular data. Am J Surg Pathol,1992,16:637-641.
3，Pott C, Tiemann M, Linke B, et al. Structure of Bcl-1 and IgH-CDR3 rearranggements as clonal markers in mantle cell lymphomas. Leukemia,1998,12:1630-1637.
4，Rimokh R, Berger F, Delsol G, et al. Dection of the chromosomal t(11;14) by polymerase chain reaction in mantle cell lymphomas. Blood,1994,3:1871-1875.
(收稿日期：2000-01-10), http://www.100md.com