茶多酚对小鼠肿瘤L2细胞DNA引物酶－多聚酶α复合体活性的抑制作用
作者：郝东磊 谢冰芬 刘宗潮 朱孝峰 冯公侃 潘启超
单位：郝东磊 谢冰芬 刘宗潮 朱孝峰(中山医科大学肿瘤防治中心，广东 广州 510060)；冯公侃 潘启超(中山医科大学肿瘤防治中心，广东 广州 510060)
关键词：
癌症000403
【摘要】目的：探讨茶多酚的抗癌作用机理。方法：应用DE-52和P-11层析柱分离小鼠肿瘤L2细胞DNA引物酶-多聚酶α复合体，并通过闪烁计数仪测定茶多酚对DNA引物酶的影响。结果：茶多酚对小鼠肿瘤L2细胞DNA引物酶-多聚酶α复合体活性有抑制作用，半数抑制浓度(IC50)值为20.28(15.17～27.13)μg/ml；对DNA引物合成有促进作用；对引物延长亦有明显抑制作用，其IC50值为36.43μg/ml。结论：茶多酚对DNA引物酶-多聚酶α复合体和引物延长活性有抑制作用，DNA引物酶-多聚酶α复合体是茶多酚的靶点之一。
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中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0314-03
Inhibition effect of tea polyphenol on the activity of DNA primase-polymerase α complex from tumor L2 cells in mice
HAO Dong-lei XIE Bing-fen LIU Zong-chao et al.
(Cancer Institute, Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060,P.R.China)
【Abstract】 Objective: To investigate the mechanism of antitumor action of tea polyphenol (TP). Methods: DNA primase-polymerase α complex was extracted from mice tumor cell line L2. The crude enzyme was loaded on DE-52 column and P-11 column,sequentially, to obtain partial purified enzyme.Effect of TP on DNA primase-polymerase α complex activity was examined using Liquid Scintillation counter. Results:It showed that IC50 value of TP inhibiting DNA primase-polymerase α complex activity was 20.28 (15.17～ 27.13) μ g/ml. TP could promote DNA primer synthesis but inhibit DNA primer extension. IC50 value of TP inhibiting DNA primer extension was 36.43 (12.55～ 105.25)μ g/ml. Conclusion: TP was shown to have inhibitory effect on activity of DNA primase-polymerase α complex and primer extention. DNA primase-polymerase α complex may be one of the target of TP.
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Key words: Tea polyphenol(TP)； Tumor cells； DNA primase； Inhibitory effect
DNA引物酶在DNA复制中起着非常重要的作用，它负责DNA链的启动。DNA复制首先合成一段引物，然后供DNA多聚酶α来延长DNA链[1]。而DNA引物酶与多聚酶α是以复合体形式存在于细胞核中，不管用什么方法提取，得到的DNA引物酶仍然是与多聚酶α结合在一起的复合体[2]。肿瘤细胞中DNA复制活跃，引物酶活性明显高于正常细胞[3]。先前研究表明，茶多酚(teapolyphenol,TP)和毛叶茶提取物及龙井茶提取物具有抗癌作用[4，5]。亦证明毛叶茶和龙井茶提取物对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性有抑制作用[6]。TP是绿茶中提取的多酚类物质，是茶叶的主要活性成分，对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的作用如何，国内外尚未见报道。本文研究茶多酚对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性等的影响，为茶多酚可能的抗癌作用机理提供理论依据。
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1 材料和方法
1.1实验材料
TP是黄褐色粉末，总儿茶素的最小含量为60%，Sigma公司产品，临用前用三蒸水配制，调pH为7.4。实验用昆明种小鼠，购自中山医科大学动物中心，合格证号：粤检证字96A53；小鼠网织
细胞肉瘤(L2)腹水型，由本科室传代。DEAE-cellulise(DE-52)为Serva公司产品，Phosphocellulose(P-11)为Whatman公司产品，Dithiothreitol(DTT)为Promeger公司产品。Poly(dT)、激活小牛胸腺DNA、ATP为Sigma公司产品，BSA、PMSF、乙酸纤维素膜、dTTP、dCTP、dGTP均为国内购买。3H-dATP为中科院上海技术开发公司产品，比活为962GBq/毫克分子、放射性浓度37GBq/L；α-32P-ATP为Amersham公司产品，放射性浓度37GBq/L。闪烁计数仪为Beckman公司产品，型号LS6500。
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1.2实验方法
1.2.1 DNA引物酶-多聚酶α复合体的分离和提取[7]：抽取接种7～9天的小鼠肿瘤L2腹水，2000rpm离心5min，分别用PBS洗涤2次，再2000rpm离心5min，以下步骤均在4℃中进行。取上述细胞10ml(约10克)，加入30mlbufferA(含50mmol/LTris-HClpH7.5，1mmol/LDTT，0.1mmol/LEDTA，0.1mmol/LPMSF)混匀，用18A超声破碎器作用1.5min，停1min，共5次。细胞破碎液于4℃下18000rpm×30min恒温匀速离心，取上清液(此液含粗酶)。
取上述粗酶液上样于预先用bufferB(50mmol/LTris-HClpH7.2，20mmol/LKCl，0.1mmol/LEDTA，20%甘油)平衡过的DE-52柱(30ml)用60mlbufferB洗之，再用20mlbufferB和20mlbufferC(50mmol/LTris-HClpH7.2,300mmol/LKCl,0.1mmol/LEDTA,20%甘油)作线性梯度洗脱，共收集22管，每管2ml，检测各管的蛋白含量，测定各管的酶活性。收集有酶活性部分，混合加入预先用bufferD(50mmol/LTris-HClpH7.2，150mmol/LKCl，1mmol/LDTT，30%甘油)平衡过的P-11柱，用50mlbufferD洗之，再用10mlbufferD和10mlbufferE(50mmol/LTris-HClpH7.2,400mmol/LKCl,1mmol/LDTT，30%甘油)作线性梯度洗脱，共收集11管，每管2ml，测定酶活性，收集有酶活性部分，并于-70℃保存备用。
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1.2.2 引物酶活性的测定[7]：酶反应液含50mmol/LTris-HClpH7.2，0.1%
PEG6000,0.1mg/mlBSA,3mmol/LDTT,6mmol/LMgCl2,10%甘油，33.3μg/mlPoly(dT),2mmol/LATP,5μl1mci/ml3H-dATP。取上述反应液30μl分装各测定管，每一管再加入待测的酶液3μl，37℃水浴30分钟，然后加入EDTA至10mmol/L终止反应，转移至乙酸纤维素薄膜上晾干。留一管不漂洗用于测定总cpm数，其余均用5%三氯乙酸漂洗3min×2次，再用95%乙醇漂洗2min×2次，晾干，放入内有5ml闪烁液的测定瓶中，在LKB液闪仪中检测cpm数。以每聚合1pmoldATP为一个酶活性单位。
1.2.3 TP对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的影响[2]：取上述酶反应液30μl/每管，设对照管和实验管，实验管中加入不同浓度的TP，使TP的最终浓度分别为7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml。各组均设2个平行管，各管加入酶3μl，充分混匀，其他步骤与1.2.2同，测定各管的放射性活度cpm数。按如下公式计算TP对酶活性的抑制率。
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再按Litchfield＆WilcoxonI(46)计算半数抑制浓度(IC50)。
1.2.4 TP对DNA引物合成的影响[2,8]：酶反应液与酶活性检测液基本相同。不同的是以α-
32P-ATP取代3H-dATP。每管含酶反应液30μl，加入TP液使其最终浓度分别为7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml，每管加上酶液3μl，在37℃水浴中30分钟，以下步骤同前1.2.2项。根据各的管cpm数再按如下公式计算TP对引物合成的影响。
1.2.5 TP对DNA引物延长的影响[2]：以激活小牛胸腺DNA为模板引物，3H-dATP为底物进行检测。反应液(50μl)含50mmol/LTris-HClpH8.5,5mmol/LMgCl2,75mmol/LKCl,1mmol/LDTT,0.1mg/mlBSA,100μmol/LdGTP,100μmol/LdTTP,100μmol/LdCTP,3.7GBq/L3H-dATP,200μg/ml激活的小牛胸腺DNA。酶反应液中依次加入上述不同浓度的TP和酶液4.5μl，其他步骤同1.2.3。根据cpm数计算引物延长的抑制率及其IC50。
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2 实验结果
2.1TP对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的抑制作用
在TP7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml浓度作用下对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的抑制作用见表1，其平均抑制率分别为29.8%、47.6%、63.8%、66.4%和74.8%。IC50及95%可信区间为20.28(15.17，27.13)μg/ml。可见随TP浓度增加，酶抑制率亦逐渐增加，各浓度抑制率相关检测r=0.9152,P<0.0001
表1 不同浓度的TP对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的抑制率(IR%) 实验次数
TP作用浓度(μg/ml)
7.81
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15.63
31.25
62.5
125
1
32.1
39.3
59.4
61.0
70.1
2
25.5
57.4
, 百拇医药
69.4
72.4
82.3
3
31.9
46.2
62.1
65.8
72.1
±s(%)
29.8±3.7
47.6±7.4
63.8±5.4
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66.4±4.6
74.8±6.5
2.2TP对DNA引物合成的影响
从表2可见，TP在7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml浓度作用下，引物合成的平均促进率分别为116.1%、209.2%、280.6%、298.3%和390.6%。结果表明TP对DNA引物合成有促进作用，随TP浓度增加，促进率也增加，各浓度抑制率相关检测r=0.9324,P<0.0001表2 不同浓度的TP对DNA引物合成的促进率(promotiverate,PR%) 实验次数
TP作用浓度(μg/ml)
7.81
15.63
, 百拇医药
31.25
62.5
125
1
115.3
212.6
266.1
281.5
395.2
2
105.2
217.1
345.2
, 百拇医药
347.9
422.3
3
127.9
197.9
230.6
265.5
354.3±s(%)
116.111.4
209.2±9.9
280.6±
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298.3±43.7
390.6±34.3
2.3TP对DNA引物延长的影响
从表3可见，TP在7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml浓度作用下，对引物延长的平均抑制率分别为7.1%、49.2%、52.2%、61.6%和72.7%，IC50值及95%可信区间为36.43(12.55，105.75)μg/ml。该结果显示，TP对DNA引物延长有抑制作用，其抑制作用随TP浓度的增加而增强，各浓度抑制率相关检测r=0.9069,P<0.0001表3 不同浓度的TP对DNA引物延长的抑制率(IR%) 实验次数
TP作用浓度(μg/ml)
7.81
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15.63
31.25
62.5
125
1
5.7
49.7
51.3
60.1
70.3
2
8.3
46.2
, 百拇医药
50.3
59.8
71.5
3
7.3
51.8
54.7
64.7
76.4±s(%)
7.1±1.3
49.2±2.8
52.2±2.2
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61.6±2.7
72.7±3.3
3 讨论
先前研究证明绿茶提取物对多种人癌细胞有细胞毒作用，体内有抗小鼠移植性肿瘤的作用[5]；TP对小鼠移植肿瘤和裸鼠移植人肺癌有抗瘤作用。本结果又表明，TP对小鼠L2细胞DNA引物酶-多聚酶α复合体活性有抑制作用，对DNA引物延长有明显抑制作用，而对DNA引物的合成有促进作用。因为DNA引物酶-多聚酶α复合体具有引物合成和引物延长的两种活性，而DNA复制首先要通过DNA拓扑异构酶Ⅱ来解旋，然后由DNA引物酶-多聚酶α复合体启动，合成一段7～10个核苷酸的RNA引物，再由多聚酶α聚合dNTP来完成引物的延长[9]。TP对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的抑制，即是抑制了DNA引物的合成或链的延长，使DNA合成受抑制[10]，从而阻止肿瘤细胞的繁殖，这可能是其抗瘤作用机理之一，即DNA引物酶-多聚酶α复合体可能是TP的靶酶。至于TP既能抑制引物的延长，又能促进引物的合成，其抑制作用和促进作用是否同一种物质起作用，尚未清楚，因为茶多酚中80%左右虽均为儿茶素组成，但尚有20%的其他物质如黄酮、黄酮醇及花色素类等物质，对本酶各活性起作用的是哪种成份，因目前国内外尚未见有关的报道，有待进一步探讨。
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基金项目：本课题受国家自然科学基金(N0：39370800)、国家“九五”攻关研究项目(
No：96-906-01-03)及中山医科大学“211工程”重点学科基金(No：98069)资助
通讯作者：谢冰芬 Tel：86-20-87765368-7333
[参考文献]
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arabinofuranosyl-2-fluoroadenine 5
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[2]Kuchta RD, Reid B, Chang LM, et al. DNA primase:Processivity and the primase to polymerase
alpha activity switch [J]. J Bio Chem, 1990, 265: 16158～ 16165.
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furanosylnucleoside triphosphates and related compounds [J].Biochemistry,1992,31:4720～ 4728.
[4]谢冰芬，郝东磊，刘宗潮，等.茶多酚的细胞毒作用和抗瘤作用研究[J].癌症,1998,17(6):418～420.
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作用[J].癌症,1991,11(6):424～428.
[6]朱孝峰，刘宗潮，潘启超，等.绿茶提取物对肿瘤细胞DNA引物酶多聚酶α复合体活性的影响[J].
癌症,1997,16(3):161～164.
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[8]Chang LM,Rafter E,Augl C,et al. Purification of a DNA polymerase-DNA primase complex from calf thymus
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[9]Sheaff RJ,Kuchta RD,Ilsley D. Calf thymus DNA polymerase α -primase:“ communication” and
primertemplate movement between the two active sites [J]. Biochemistry, 1994, 3: 2247～ 2254.
[10]Nasheuer HP, Grosse F. DNA polymerase α -primase from calf thymus [J]. J Biol Chem, 1988,263: 8981～ 8983.
收稿日期：1999-08-11
修回日期：1999-09-17, 百拇医药
单位：郝东磊 谢冰芬 刘宗潮 朱孝峰(中山医科大学肿瘤防治中心，广东 广州 510060)；冯公侃 潘启超(中山医科大学肿瘤防治中心，广东 广州 510060)
关键词：
癌症000403
【摘要】目的：探讨茶多酚的抗癌作用机理。方法：应用DE-52和P-11层析柱分离小鼠肿瘤L2细胞DNA引物酶-多聚酶α复合体，并通过闪烁计数仪测定茶多酚对DNA引物酶的影响。结果：茶多酚对小鼠肿瘤L2细胞DNA引物酶-多聚酶α复合体活性有抑制作用，半数抑制浓度(IC50)值为20.28(15.17～27.13)μg/ml；对DNA引物合成有促进作用；对引物延长亦有明显抑制作用，其IC50值为36.43μg/ml。结论：茶多酚对DNA引物酶-多聚酶α复合体和引物延长活性有抑制作用，DNA引物酶-多聚酶α复合体是茶多酚的靶点之一。
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中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0314-03
Inhibition effect of tea polyphenol on the activity of DNA primase-polymerase α complex from tumor L2 cells in mice
HAO Dong-lei XIE Bing-fen LIU Zong-chao et al.
(Cancer Institute, Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060,P.R.China)
【Abstract】 Objective: To investigate the mechanism of antitumor action of tea polyphenol (TP). Methods: DNA primase-polymerase α complex was extracted from mice tumor cell line L2. The crude enzyme was loaded on DE-52 column and P-11 column,sequentially, to obtain partial purified enzyme.Effect of TP on DNA primase-polymerase α complex activity was examined using Liquid Scintillation counter. Results:It showed that IC50 value of TP inhibiting DNA primase-polymerase α complex activity was 20.28 (15.17～ 27.13) μ g/ml. TP could promote DNA primer synthesis but inhibit DNA primer extension. IC50 value of TP inhibiting DNA primer extension was 36.43 (12.55～ 105.25)μ g/ml. Conclusion: TP was shown to have inhibitory effect on activity of DNA primase-polymerase α complex and primer extention. DNA primase-polymerase α complex may be one of the target of TP.
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Key words: Tea polyphenol(TP)； Tumor cells； DNA primase； Inhibitory effect
DNA引物酶在DNA复制中起着非常重要的作用，它负责DNA链的启动。DNA复制首先合成一段引物，然后供DNA多聚酶α来延长DNA链[1]。而DNA引物酶与多聚酶α是以复合体形式存在于细胞核中，不管用什么方法提取，得到的DNA引物酶仍然是与多聚酶α结合在一起的复合体[2]。肿瘤细胞中DNA复制活跃，引物酶活性明显高于正常细胞[3]。先前研究表明，茶多酚(teapolyphenol,TP)和毛叶茶提取物及龙井茶提取物具有抗癌作用[4，5]。亦证明毛叶茶和龙井茶提取物对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性有抑制作用[6]。TP是绿茶中提取的多酚类物质，是茶叶的主要活性成分，对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的作用如何，国内外尚未见报道。本文研究茶多酚对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性等的影响，为茶多酚可能的抗癌作用机理提供理论依据。
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1 材料和方法
1.1实验材料
TP是黄褐色粉末，总儿茶素的最小含量为60%，Sigma公司产品，临用前用三蒸水配制，调pH为7.4。实验用昆明种小鼠，购自中山医科大学动物中心，合格证号：粤检证字96A53；小鼠网织
细胞肉瘤(L2)腹水型，由本科室传代。DEAE-cellulise(DE-52)为Serva公司产品，Phosphocellulose(P-11)为Whatman公司产品，Dithiothreitol(DTT)为Promeger公司产品。Poly(dT)、激活小牛胸腺DNA、ATP为Sigma公司产品，BSA、PMSF、乙酸纤维素膜、dTTP、dCTP、dGTP均为国内购买。3H-dATP为中科院上海技术开发公司产品，比活为962GBq/毫克分子、放射性浓度37GBq/L；α-32P-ATP为Amersham公司产品，放射性浓度37GBq/L。闪烁计数仪为Beckman公司产品，型号LS6500。
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1.2实验方法
1.2.1 DNA引物酶-多聚酶α复合体的分离和提取[7]：抽取接种7～9天的小鼠肿瘤L2腹水，2000rpm离心5min，分别用PBS洗涤2次，再2000rpm离心5min，以下步骤均在4℃中进行。取上述细胞10ml(约10克)，加入30mlbufferA(含50mmol/LTris-HClpH7.5，1mmol/LDTT，0.1mmol/LEDTA，0.1mmol/LPMSF)混匀，用18A超声破碎器作用1.5min，停1min，共5次。细胞破碎液于4℃下18000rpm×30min恒温匀速离心，取上清液(此液含粗酶)。
取上述粗酶液上样于预先用bufferB(50mmol/LTris-HClpH7.2，20mmol/LKCl，0.1mmol/LEDTA，20%甘油)平衡过的DE-52柱(30ml)用60mlbufferB洗之，再用20mlbufferB和20mlbufferC(50mmol/LTris-HClpH7.2,300mmol/LKCl,0.1mmol/LEDTA,20%甘油)作线性梯度洗脱，共收集22管，每管2ml，检测各管的蛋白含量，测定各管的酶活性。收集有酶活性部分，混合加入预先用bufferD(50mmol/LTris-HClpH7.2，150mmol/LKCl，1mmol/LDTT，30%甘油)平衡过的P-11柱，用50mlbufferD洗之，再用10mlbufferD和10mlbufferE(50mmol/LTris-HClpH7.2,400mmol/LKCl,1mmol/LDTT，30%甘油)作线性梯度洗脱，共收集11管，每管2ml，测定酶活性，收集有酶活性部分，并于-70℃保存备用。
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1.2.2 引物酶活性的测定[7]：酶反应液含50mmol/LTris-HClpH7.2，0.1%
PEG6000,0.1mg/mlBSA,3mmol/LDTT,6mmol/LMgCl2,10%甘油，33.3μg/mlPoly(dT),2mmol/LATP,5μl1mci/ml3H-dATP。取上述反应液30μl分装各测定管，每一管再加入待测的酶液3μl，37℃水浴30分钟，然后加入EDTA至10mmol/L终止反应，转移至乙酸纤维素薄膜上晾干。留一管不漂洗用于测定总cpm数，其余均用5%三氯乙酸漂洗3min×2次，再用95%乙醇漂洗2min×2次，晾干，放入内有5ml闪烁液的测定瓶中，在LKB液闪仪中检测cpm数。以每聚合1pmoldATP为一个酶活性单位。
1.2.3 TP对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的影响[2]：取上述酶反应液30μl/每管，设对照管和实验管，实验管中加入不同浓度的TP，使TP的最终浓度分别为7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml。各组均设2个平行管，各管加入酶3μl，充分混匀，其他步骤与1.2.2同，测定各管的放射性活度cpm数。按如下公式计算TP对酶活性的抑制率。
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再按Litchfield＆WilcoxonI(46)计算半数抑制浓度(IC50)。
1.2.4 TP对DNA引物合成的影响[2,8]：酶反应液与酶活性检测液基本相同。不同的是以α-
32P-ATP取代3H-dATP。每管含酶反应液30μl，加入TP液使其最终浓度分别为7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml，每管加上酶液3μl，在37℃水浴中30分钟，以下步骤同前1.2.2项。根据各的管cpm数再按如下公式计算TP对引物合成的影响。
1.2.5 TP对DNA引物延长的影响[2]：以激活小牛胸腺DNA为模板引物，3H-dATP为底物进行检测。反应液(50μl)含50mmol/LTris-HClpH8.5,5mmol/LMgCl2,75mmol/LKCl,1mmol/LDTT,0.1mg/mlBSA,100μmol/LdGTP,100μmol/LdTTP,100μmol/LdCTP,3.7GBq/L3H-dATP,200μg/ml激活的小牛胸腺DNA。酶反应液中依次加入上述不同浓度的TP和酶液4.5μl，其他步骤同1.2.3。根据cpm数计算引物延长的抑制率及其IC50。
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2 实验结果
2.1TP对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的抑制作用
在TP7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml浓度作用下对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的抑制作用见表1，其平均抑制率分别为29.8%、47.6%、63.8%、66.4%和74.8%。IC50及95%可信区间为20.28(15.17，27.13)μg/ml。可见随TP浓度增加，酶抑制率亦逐渐增加，各浓度抑制率相关检测r=0.9152,P<0.0001
表1 不同浓度的TP对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的抑制率(IR%) 实验次数
TP作用浓度(μg/ml)
7.81
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15.63
31.25
62.5
125
1
32.1
39.3
59.4
61.0
70.1
2
25.5
57.4
, 百拇医药
69.4
72.4
82.3
3
31.9
46.2
62.1
65.8
72.1
±s(%)29.8±3.7
47.6±7.4
63.8±5.4
, http://www.100md.com
66.4±4.6
74.8±6.5
2.2TP对DNA引物合成的影响
从表2可见，TP在7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml浓度作用下，引物合成的平均促进率分别为116.1%、209.2%、280.6%、298.3%和390.6%。结果表明TP对DNA引物合成有促进作用，随TP浓度增加，促进率也增加，各浓度抑制率相关检测r=0.9324,P<0.0001表2 不同浓度的TP对DNA引物合成的促进率(promotiverate,PR%) 实验次数
TP作用浓度(μg/ml)
7.81
15.63
, 百拇医药
31.25
62.5
125
1
115.3
212.6
266.1
281.5
395.2
2
105.2
217.1
345.2
, 百拇医药
347.9
422.3
3
127.9
197.9
230.6
265.5
354.3
±s(%)116.111.4
209.2±9.9
280.6±
, http://www.100md.com
298.3±43.7
390.6±34.3
2.3TP对DNA引物延长的影响
从表3可见，TP在7.81μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml浓度作用下，对引物延长的平均抑制率分别为7.1%、49.2%、52.2%、61.6%和72.7%，IC50值及95%可信区间为36.43(12.55，105.75)μg/ml。该结果显示，TP对DNA引物延长有抑制作用，其抑制作用随TP浓度的增加而增强，各浓度抑制率相关检测r=0.9069,P<0.0001表3 不同浓度的TP对DNA引物延长的抑制率(IR%) 实验次数
TP作用浓度(μg/ml)
7.81
, 百拇医药
15.63
31.25
62.5
125
1
5.7
49.7
51.3
60.1
70.3
2
8.3
46.2
, 百拇医药
50.3
59.8
71.5
3
7.3
51.8
54.7
64.7
76.4
±s(%)7.1±1.3
49.2±2.8
52.2±2.2
, 百拇医药
61.6±2.7
72.7±3.3
3 讨论
先前研究证明绿茶提取物对多种人癌细胞有细胞毒作用，体内有抗小鼠移植性肿瘤的作用[5]；TP对小鼠移植肿瘤和裸鼠移植人肺癌有抗瘤作用。本结果又表明，TP对小鼠L2细胞DNA引物酶-多聚酶α复合体活性有抑制作用，对DNA引物延长有明显抑制作用，而对DNA引物的合成有促进作用。因为DNA引物酶-多聚酶α复合体具有引物合成和引物延长的两种活性，而DNA复制首先要通过DNA拓扑异构酶Ⅱ来解旋，然后由DNA引物酶-多聚酶α复合体启动，合成一段7～10个核苷酸的RNA引物，再由多聚酶α聚合dNTP来完成引物的延长[9]。TP对DNA引物酶-多聚酶α复合体活性的抑制，即是抑制了DNA引物的合成或链的延长，使DNA合成受抑制[10]，从而阻止肿瘤细胞的繁殖，这可能是其抗瘤作用机理之一，即DNA引物酶-多聚酶α复合体可能是TP的靶酶。至于TP既能抑制引物的延长，又能促进引物的合成，其抑制作用和促进作用是否同一种物质起作用，尚未清楚，因为茶多酚中80%左右虽均为儿茶素组成，但尚有20%的其他物质如黄酮、黄酮醇及花色素类等物质，对本酶各活性起作用的是哪种成份，因目前国内外尚未见有关的报道，有待进一步探讨。
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基金项目：本课题受国家自然科学基金(N0：39370800)、国家“九五”攻关研究项目(
No：96-906-01-03)及中山医科大学“211工程”重点学科基金(No：98069)资助
通讯作者：谢冰芬 Tel：86-20-87765368-7333
[参考文献]
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收稿日期：1999-08-11
修回日期：1999-09-17, 百拇医药