白细胞介素6单克隆抗体的研制
作者：陈 琳1 徐秀英1 边 疆1 于 芳1 黄培堂1}l, http://www.100md.com
单位：军事医学科学院生物工程研究所 北京100071}l, http://www.100md.com
关键词：IL-6 单克隆抗体 杂交瘤}l, http://www.100md.com
免疫学杂志990117 摘 要 采用纯化的工程菌表达产物白细胞介素6(Interleukin 6，IL-6)免疫BALB/C小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)在PEG作用下进行融合，通过ELISA筛选并多次亚克隆，获得了1株能分泌抗IL-6单克隆抗体的杂交瘤细胞Ic-1.3.4.5。Western blot显示：抗体结合抗原的分子量与IL-6相符，为特异性抗IL-6抗体。亚类鉴定表明：该细胞分泌的单克隆抗体为IgG1亚类，kappa型。染色体数目为100条左右。腹水效价为1∶104，无血清培养液效价为1∶102。此杂交瘤细胞株体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体滴度无明显降低。}l, http://www.100md.com
中图号 R392.11}l, http://www.100md.com
THE PREPARATION AND PRELIMINARY DETERMINATION OF ANTI-IL-6 MONOCLONAL ANTIBODY}l, http://www.100md.com
Chen Lin，Xu Xiuying，Bian Jiang，Yu Fang，Huang Peitang}l, http://www.100md.com
(Institute of Biotechnology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071)}l, http://www.100md.com
Abstract Balb/c mice were immunized with interleukin 6(IL-6)antigen purified from engineered E.coli strain，their spleen cells were fused with myeloma cells by polyethyleneglyco(PEG).After making ELISA screening and subcloning we obtained one positive hybridoma cell strain Ic-1.3.4.5.Western blot demonstrated that antibody was peculiar to combine with IL-6 antigen.The monoclonal antibody was IgG1 subclass，kappa type.Chromosomal numbers were 100 or so.We cultivated and frozen cells，prepared ascetic fluid and serum-free supernatant.The titer of ascetic fluid was 1∶104 and serum-free supernatant was 1∶102.The hybridoma cell was bequeathed more than six months and the titer of antibody had not obviously changed.
Key words Interleukin 6，Monoclonal antibody，Hybridomar7, http://www.100md.com
白细胞介素6(IL-6)主要是由单核-吞噬细胞产生，有多种生物学活性功能的细胞因子。它具有诱导淋巴细胞分化增殖、调节机体的免疫应答、促进造血细胞的分化和抗肿瘤的特性。临床一些疾病的发生和发展与IL-6有密切关系[1]。文献报道，临床上许多疾病患者体液中IL-6水平有所提高[2～3]。目前国内对IL-6的研究已比较深入，尤其在IL-6基因重组表达方面进展很快。IL-6抗体的研制为IL-6的检测、鉴定、纯化提供了方便。本文用PEG作为融合剂，使骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的脾细胞融合，获得了1株分泌抗IL-6单抗的杂交瘤细胞Ic-1.3.4.5。我们将细胞冻存，同时制备细胞无血清培养上清及小鼠腹水，并对该单抗进行了亚类鉴定及特异性鉴定。r7, http://www.100md.com
1 材料与方法r7, http://www.100md.com
1.1 材料r7, http://www.100md.com
PEG 4000：Serva产品；小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)：本组保存；IL-6抗原：为表达人重组白细胞介素6的大肠杆菌发酵、纯化产品[4]；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG：Promega产品；BALB/C小鼠：8～12周龄，雌性，按二级动物喂养，由本院动物中心提供；RPMI 1640干粉：GIBCO产品；无支原体小牛血清：浙江杭州四季青生物工程材料研究所生产；仪器：细胞培养成套仪器，SS-3000酶联仪，电泳仪，电转移装置。r7, http://www.100md.com
1.2 方法r7, http://www.100md.com
1.2.1 动物免疫：将200μgIL-6抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，充分乳化，经腹腔注射免疫BALB/C小鼠。加强免疫则采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。融合前3d，经尾静脉注射同等剂量的抗原生理盐水溶液。r7, http://www.100md.com
1.2.2 融合r7, http://www.100md.com
1.2.2.1 制备BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞。r7, http://www.100md.com
1.2.2.2 将小鼠脾细胞与SP2/0细胞按5∶1比例混合于50ml尖底离心管中，置于37°C水浴中，于45s内缓慢滴入1ml 50%PEG，静置1min，用GKN终止，离心收集细胞。将细胞悬于含HAT的选择培养基中，接种于96孔培养板中。
1.2.3 ELISA检测：采用间接ELISA法筛选分泌抗体阳性杂交瘤细胞。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆：采用有限稀释法进行。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.5 细胞冻存：按常规法进行。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.6 杂交瘤细胞无血清培养液及腹水制备：7x|4*, http://www.100md.com
1.2.6.1 通过亚克隆获得的单克隆杂交瘤细胞在细胞瓶中长满单层后，用无血清培养液洗1次，再加入无血清培养液培养，3d后收上清。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.6.2 小鼠腹腔接种福氏不完全佐剂0.3～0.4ml/只，7～14d后，经腹腔接种105～106杂交瘤细胞，待小鼠腹部膨大，抽取腹水，-20°C保存。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.7 抗体特异性鉴定[5]：抗原经SDS-PAGE后，通过电转移装置将其转移至硝酸纤维素膜上。将膜浸泡于杂交瘤细胞上清中，再加入酶标二抗作用底物DAB显色。同时以抗原与蛋白分子量标准品电泳、考马斯亮蓝染色后脱色结果为对照。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.8 亚类鉴定：采用ELISA酶标抗体法鉴定。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.9 染色体检查：在细胞培养基中加入终浓度为0.3μg/ml的秋水仙素，于37°C继续培养2h，收集细胞，加0.075mol/L KCl，37°C保温30min。用甲醇与冰醋酸混合液(两者比例为3∶1)固定3次，制片，Giemsa染色。7x|4*, http://www.100md.com
2 结果与讨论7x|4*, http://www.100md.com
2.1 融合率 计数生长杂交瘤细胞的孔数，计算其与接种杂交瘤细胞的孔数之比，获得融合率为4%。融合过程中，滋养细胞生长状况的优劣、融合的时间、PEG的分子量及其pH等多种因素均影响细胞的融合效率。7x|4*, http://www.100md.com
2.2 阳性率 经多次测定杂交瘤细胞阳性率为19%。7x|4*, http://www.100md.com
2.3 ELISA检测3次亚克隆的杂交瘤细胞上清 阳性率达100%(见图1)。
图1杂交瘤细胞3次亚克隆后ELISA检测结果m74}jg&, http://www.100md.com
Fig 1The ELISA results of hybridoma cell subclone for three timesm74}jg&, http://www.100md.com
1：A2：Blank； 2：B2：Negative control； 3.The rest：Samplem74}jg&, http://www.100md.com
2.4 测定抗IL-6单克隆抗体效价m74}jg&, http://www.100md.com
2.4.1 将杂交瘤细胞接种于预先致敏的小鼠腹腔，获得腹水并用ELISA测定抗体效价为1∶104。m74}jg&, http://www.100md.com
2.4.2 细胞无血清培养液培养3d，收上清测定抗体效价结果为1∶102。m74}jg&, http://www.100md.com
2.4.3 该杂交瘤细胞3d传一代，体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体效价无明显降低。m74}jg&, http://www.100md.com
2.5 Western blot结果表明，抗体能与转移至硝酸纤维素膜上的抗原结合，通过酶标二抗作用后使底物显色，其结合抗原的分子量与工程菌表达的IL-6分子量一致，证明该细胞分泌的单抗能与IL-6结合(见图2)。
m74}jg&, http://www.100md.com
图2 Western blot结果m74}jg&, http://www.100md.com
Fig 2 The results of Western blotm74}jg&, http://www.100md.com
1：IL-6； 2：Reduced IL-6； 3：Molecular weight standard：97400 66200 42700 31000 14400； 4：The result of Western blot for IL-6；m74}jg&, http://www.100md.com
5：The result of Western blot for reduced IL-6m74}jg&, http://www.100md.com
2.6 抗体亚类及型的鉴定 用ELISA法鉴定抗体为IgG1亚类、kappa型。m74}jg&, http://www.100md.com
2.7 染色体检查结果 染色体条数为100条左右，杂交瘤细胞染色体数为脾细胞与SP2/0细胞染色体数目之和，表明它们是融合产生的杂交瘤细胞(见图3)。
图 3 杂交瘤细胞染色体#:.c@, 百拇医药
Fig 3 The chromosomal morphology of hybridoma cell#:.c@, 百拇医药
IL-6是机体内具有多种调节功能的因子。体内IL-6水平的异常变化与多种疾病有关。采用细胞生物活性法[6]测定体液及工程菌表达的IL-6水平工作量大且费用高。我们用传统的细胞融合技术[7]，通过亚克隆、筛选获得了1株分泌抗IL-6单抗的杂交瘤细胞。抗体亚类鉴定为IgG1。IL-6单抗制备成功为临床和基础相关研究提供了方便。#:.c@, 百拇医药
第一作者：陈琳，女，33岁，大专，实验师#:.c@, 百拇医药
参考文献#:.c@, 百拇医药
[1] Hirano T，Akira S，Taga T，et al.Biological and clinical aspects of interleukin 6.Immunol Today，1990，11(12)：443#:.c@, 百拇医药
[2] Van Oers MHJ，Van Der Heyden AAPAM，Aarden LA，et al.IL-6 in serum and urine of renal transplant reci-pients.C1in Exp Immunol，1988，71：314#:.c@, 百拇医药
[3] Honda M，Kitamura K，Mizutani Y，et al.Qantitative analysis of serum IL-6 and its correlation with increased levels of serum IL-2R in HIV-induced diseases.J Immunol，1990，145(2)：4059#:.c@, 百拇医药
[4] 边 疆，陶好霞，薛 冲，等.重组人白细胞介素6的制备.生物工程进展，1995，15(6)；33#:.c@, 百拇医药
[5] Towbin H，Staehelin T，Gordon J.Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets；procedure and some applications.Proc Nat1 Aca Sci USA，1979，76：4530#:.c@, 百拇医药
[6] 侯 健，孔宪涛.四甲基偶氮唑蓝比色法检测人血清白细胞介素6.中华医学检验杂志，1993，16(4)：208#:.c@, 百拇医药
[7] Richard DL.A short-duration polyethylene glycol fusion techique for incresaing production of monoclonal anti-body-secreting hybridomas.J Immunol Methods，1985，81(2)：223#:.c@, 百拇医药
(1998-02-13收稿；1998-06-09修回)(陈 琳1 徐秀英1 边 疆1 于 芳1 黄培堂1)
单位：军事医学科学院生物工程研究所 北京100071}l, http://www.100md.com
关键词：IL-6 单克隆抗体 杂交瘤}l, http://www.100md.com
免疫学杂志990117 摘 要 采用纯化的工程菌表达产物白细胞介素6(Interleukin 6，IL-6)免疫BALB/C小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)在PEG作用下进行融合，通过ELISA筛选并多次亚克隆，获得了1株能分泌抗IL-6单克隆抗体的杂交瘤细胞Ic-1.3.4.5。Western blot显示：抗体结合抗原的分子量与IL-6相符，为特异性抗IL-6抗体。亚类鉴定表明：该细胞分泌的单克隆抗体为IgG1亚类，kappa型。染色体数目为100条左右。腹水效价为1∶104，无血清培养液效价为1∶102。此杂交瘤细胞株体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体滴度无明显降低。}l, http://www.100md.com
中图号 R392.11}l, http://www.100md.com
THE PREPARATION AND PRELIMINARY DETERMINATION OF ANTI-IL-6 MONOCLONAL ANTIBODY}l, http://www.100md.com
Chen Lin，Xu Xiuying，Bian Jiang，Yu Fang，Huang Peitang}l, http://www.100md.com
(Institute of Biotechnology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071)}l, http://www.100md.com
Abstract Balb/c mice were immunized with interleukin 6(IL-6)antigen purified from engineered E.coli strain，their spleen cells were fused with myeloma cells by polyethyleneglyco(PEG).After making ELISA screening and subcloning we obtained one positive hybridoma cell strain Ic-1.3.4.5.Western blot demonstrated that antibody was peculiar to combine with IL-6 antigen.The monoclonal antibody was IgG1 subclass，kappa type.Chromosomal numbers were 100 or so.We cultivated and frozen cells，prepared ascetic fluid and serum-free supernatant.The titer of ascetic fluid was 1∶104 and serum-free supernatant was 1∶102.The hybridoma cell was bequeathed more than six months and the titer of antibody had not obviously changed.
Key words Interleukin 6，Monoclonal antibody，Hybridomar7, http://www.100md.com
白细胞介素6(IL-6)主要是由单核-吞噬细胞产生，有多种生物学活性功能的细胞因子。它具有诱导淋巴细胞分化增殖、调节机体的免疫应答、促进造血细胞的分化和抗肿瘤的特性。临床一些疾病的发生和发展与IL-6有密切关系[1]。文献报道，临床上许多疾病患者体液中IL-6水平有所提高[2～3]。目前国内对IL-6的研究已比较深入，尤其在IL-6基因重组表达方面进展很快。IL-6抗体的研制为IL-6的检测、鉴定、纯化提供了方便。本文用PEG作为融合剂，使骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的脾细胞融合，获得了1株分泌抗IL-6单抗的杂交瘤细胞Ic-1.3.4.5。我们将细胞冻存，同时制备细胞无血清培养上清及小鼠腹水，并对该单抗进行了亚类鉴定及特异性鉴定。r7, http://www.100md.com
1 材料与方法r7, http://www.100md.com
1.1 材料r7, http://www.100md.com
PEG 4000：Serva产品；小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)：本组保存；IL-6抗原：为表达人重组白细胞介素6的大肠杆菌发酵、纯化产品[4]；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG：Promega产品；BALB/C小鼠：8～12周龄，雌性，按二级动物喂养，由本院动物中心提供；RPMI 1640干粉：GIBCO产品；无支原体小牛血清：浙江杭州四季青生物工程材料研究所生产；仪器：细胞培养成套仪器，SS-3000酶联仪，电泳仪，电转移装置。r7, http://www.100md.com
1.2 方法r7, http://www.100md.com
1.2.1 动物免疫：将200μgIL-6抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，充分乳化，经腹腔注射免疫BALB/C小鼠。加强免疫则采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。融合前3d，经尾静脉注射同等剂量的抗原生理盐水溶液。r7, http://www.100md.com
1.2.2 融合r7, http://www.100md.com
1.2.2.1 制备BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞。r7, http://www.100md.com
1.2.2.2 将小鼠脾细胞与SP2/0细胞按5∶1比例混合于50ml尖底离心管中，置于37°C水浴中，于45s内缓慢滴入1ml 50%PEG，静置1min，用GKN终止，离心收集细胞。将细胞悬于含HAT的选择培养基中，接种于96孔培养板中。
1.2.3 ELISA检测：采用间接ELISA法筛选分泌抗体阳性杂交瘤细胞。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆：采用有限稀释法进行。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.5 细胞冻存：按常规法进行。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.6 杂交瘤细胞无血清培养液及腹水制备：7x|4*, http://www.100md.com
1.2.6.1 通过亚克隆获得的单克隆杂交瘤细胞在细胞瓶中长满单层后，用无血清培养液洗1次，再加入无血清培养液培养，3d后收上清。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.6.2 小鼠腹腔接种福氏不完全佐剂0.3～0.4ml/只，7～14d后，经腹腔接种105～106杂交瘤细胞，待小鼠腹部膨大，抽取腹水，-20°C保存。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.7 抗体特异性鉴定[5]：抗原经SDS-PAGE后，通过电转移装置将其转移至硝酸纤维素膜上。将膜浸泡于杂交瘤细胞上清中，再加入酶标二抗作用底物DAB显色。同时以抗原与蛋白分子量标准品电泳、考马斯亮蓝染色后脱色结果为对照。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.8 亚类鉴定：采用ELISA酶标抗体法鉴定。7x|4*, http://www.100md.com
1.2.9 染色体检查：在细胞培养基中加入终浓度为0.3μg/ml的秋水仙素，于37°C继续培养2h，收集细胞，加0.075mol/L KCl，37°C保温30min。用甲醇与冰醋酸混合液(两者比例为3∶1)固定3次，制片，Giemsa染色。7x|4*, http://www.100md.com
2 结果与讨论7x|4*, http://www.100md.com
2.1 融合率 计数生长杂交瘤细胞的孔数，计算其与接种杂交瘤细胞的孔数之比，获得融合率为4%。融合过程中，滋养细胞生长状况的优劣、融合的时间、PEG的分子量及其pH等多种因素均影响细胞的融合效率。7x|4*, http://www.100md.com
2.2 阳性率 经多次测定杂交瘤细胞阳性率为19%。7x|4*, http://www.100md.com
2.3 ELISA检测3次亚克隆的杂交瘤细胞上清 阳性率达100%(见图1)。
图1杂交瘤细胞3次亚克隆后ELISA检测结果m74}jg&, http://www.100md.com
Fig 1The ELISA results of hybridoma cell subclone for three timesm74}jg&, http://www.100md.com
1：A2：Blank； 2：B2：Negative control； 3.The rest：Samplem74}jg&, http://www.100md.com
2.4 测定抗IL-6单克隆抗体效价m74}jg&, http://www.100md.com
2.4.1 将杂交瘤细胞接种于预先致敏的小鼠腹腔，获得腹水并用ELISA测定抗体效价为1∶104。m74}jg&, http://www.100md.com
2.4.2 细胞无血清培养液培养3d，收上清测定抗体效价结果为1∶102。m74}jg&, http://www.100md.com
2.4.3 该杂交瘤细胞3d传一代，体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体效价无明显降低。m74}jg&, http://www.100md.com
2.5 Western blot结果表明，抗体能与转移至硝酸纤维素膜上的抗原结合，通过酶标二抗作用后使底物显色，其结合抗原的分子量与工程菌表达的IL-6分子量一致，证明该细胞分泌的单抗能与IL-6结合(见图2)。
m74}jg&, http://www.100md.com图2 Western blot结果m74}jg&, http://www.100md.com
Fig 2 The results of Western blotm74}jg&, http://www.100md.com
1：IL-6； 2：Reduced IL-6； 3：Molecular weight standard：97400 66200 42700 31000 14400； 4：The result of Western blot for IL-6；m74}jg&, http://www.100md.com
5：The result of Western blot for reduced IL-6m74}jg&, http://www.100md.com
2.6 抗体亚类及型的鉴定 用ELISA法鉴定抗体为IgG1亚类、kappa型。m74}jg&, http://www.100md.com
2.7 染色体检查结果 染色体条数为100条左右，杂交瘤细胞染色体数为脾细胞与SP2/0细胞染色体数目之和，表明它们是融合产生的杂交瘤细胞(见图3)。
图 3 杂交瘤细胞染色体#:.c@, 百拇医药
Fig 3 The chromosomal morphology of hybridoma cell#:.c@, 百拇医药
IL-6是机体内具有多种调节功能的因子。体内IL-6水平的异常变化与多种疾病有关。采用细胞生物活性法[6]测定体液及工程菌表达的IL-6水平工作量大且费用高。我们用传统的细胞融合技术[7]，通过亚克隆、筛选获得了1株分泌抗IL-6单抗的杂交瘤细胞。抗体亚类鉴定为IgG1。IL-6单抗制备成功为临床和基础相关研究提供了方便。#:.c@, 百拇医药
第一作者：陈琳，女，33岁，大专，实验师#:.c@, 百拇医药
参考文献#:.c@, 百拇医药
[1] Hirano T，Akira S，Taga T，et al.Biological and clinical aspects of interleukin 6.Immunol Today，1990，11(12)：443#:.c@, 百拇医药
[2] Van Oers MHJ，Van Der Heyden AAPAM，Aarden LA，et al.IL-6 in serum and urine of renal transplant reci-pients.C1in Exp Immunol，1988，71：314#:.c@, 百拇医药
[3] Honda M，Kitamura K，Mizutani Y，et al.Qantitative analysis of serum IL-6 and its correlation with increased levels of serum IL-2R in HIV-induced diseases.J Immunol，1990，145(2)：4059#:.c@, 百拇医药
[4] 边 疆，陶好霞，薛 冲，等.重组人白细胞介素6的制备.生物工程进展，1995，15(6)；33#:.c@, 百拇医药
[5] Towbin H，Staehelin T，Gordon J.Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets；procedure and some applications.Proc Nat1 Aca Sci USA，1979，76：4530#:.c@, 百拇医药
[6] 侯 健，孔宪涛.四甲基偶氮唑蓝比色法检测人血清白细胞介素6.中华医学检验杂志，1993，16(4)：208#:.c@, 百拇医药
[7] Richard DL.A short-duration polyethylene glycol fusion techique for incresaing production of monoclonal anti-body-secreting hybridomas.J Immunol Methods，1985，81(2)：223#:.c@, 百拇医药
(1998-02-13收稿；1998-06-09修回)(陈 琳1 徐秀英1 边 疆1 于 芳1 黄培堂1)