葛属植物中3种异黄酮成分分析
作者：宋洪杰 曾明 胡晋红 王大业 张汉明
单位：宋洪杰 胡晋红(上海长海医院 上海 200433)；曾明 张汉明(第二军医大学药学院生药教研室)；王大业(药学95队实习学员)
关键词：葛属植物；葛根素；大豆苷；大豆苷元；高效液相色谱
药物分析杂志000402 摘要 目的：测定7种葛属植物根中异黄酮成分的含量。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Hypersil ODS2(150 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长250 nm；葛根素、大豆苷、大豆苷元的加样回收率±RSD分别为(105.7±4.6)%，(105.4±6.9)%，(104.5±9.2)%。结果：葛属植物中3种异黄酮成分含量差异较大，野葛、粉葛和峨嵋葛中含有的葛根素和大豆苷比其它几种葛属植物高，野葛中葛根素的含量最高；从液相色谱图中观察到不同产地野葛的图谱与其它种的葛属植物有明显区别。结论：异黄酮成分可作为评价葛属植物质量的参考依据。
, 百拇医药
Determination and Chromatographic Identification of
3 Isoflavones of Pueraria Plants
Song Hongjie Zeng Ming Hu Jinhong Wang Daye Zhang Hanming
(Department of Clinical Pharmacology,Shanghai Changhai Hospital,Shanghai 200433)
Abstract Objective：To determine the content of isoflavones in seven species of genus Pueraria roots.Method:RP-HPLC method was used.The separation was performed on Hypersil ODS2(150 mm×4.6 mm,5 μm)column,the wavelength for detection was 250 nm.The recoveries for puerarin,daidzin and daidzein were as follows:(105.7±4.6)%，(105.4±6.9)%，(104.5±9.2)%.Results:The contents of three kinds of isoflavones in seven species of Pueraria plants were different.The contents of puerarin and daidzin in Pueraria lobata,P.thomsonii and P.omeiensis were higher than those of other Pueraria plants.The content of puerarin in Pueraria lobata was highest compared with other species.The chromatograms of Pueraria lobata from different districts were different from other species.Conclusion:The isoflavone components may be adopted as reference for evaluating the quality of genus Pueraria roots.
, 百拇医药
Key words Pueraria,puerarin,daidzin,daidzein,HPLC▲
葛根作为常用的中药材，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻之功效。现代药理研究表明药材中含有的异黄酮类成分如葛根素、大豆苷和大豆苷元是主要的药理活性成分，临床上常用单味药或复方制剂治疗冠心病、心肌梗塞和高血压病。本文从异黄酮成分含量测定和鉴别的角度考察了葛属植物中7个种，为葛根的质量评价提供参考。目前报道的葛根中葛根素、大豆苷、大豆苷元3种异黄酮成分的分析方法有HPLC和HPCE法[1，2]，本文采用反相高效液相色谱法，利用二元梯度洗脱，一次进样即同时完成3种异黄酮成分的含量测定，并进行了定性分析，可为评价葛根的质量提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试药 野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi,粉葛P.thomsonii Benth.,峨嵋葛P.omeiensis Wang et Tang,食用葛P.edulis Pampan.,苦葛P.peduncuradis(Grah.ex Benth.)Benth.,黄毛葛P.calycina Fanch.,三裂叶葛P.phaseloides(Roxb.)Benth.,由第二军医大学生药教研室曾明博士提供并鉴定；葛根素对照品(纯度为95.6%)由中国药品生物制品检定所提供，大豆苷(纯度为90.1%)、大豆苷元(纯度为92.5%)对照品由中国医学科学院药物所植化室提供；甲醇、乙腈为HPLC级，无水乙醇、磷酸二氢钾为分析纯。
, 百拇医药
1.2 仪器 日本岛津液相色谱仪LC-10AD泵，SPD-10Avp二极管阵列检测器，CLASS-LC10工作站，7725i进样阀配以20 μL定量管，上海必能信超声有限公司SB5200超声震荡器。
1.3 样品溶液的制备 将葛根生药粉碎，过60目筛，50 ℃烘干。称取10 mg，置10 mL量瓶中，分别用无水乙醇、甲醇、水稀释至刻度，超声振荡60 min，冷却至室温，补足挥发损失的溶剂，0.45 μm微孔滤膜过滤。经比较，无水乙醇提取葛根素、大豆苷及大豆苷元3种成分含量均最低，水提取葛根素含量显著高于甲醇，大豆苷、大豆苷元含量两者无显著差别，所以采用水作溶剂进行上述提取，即得样品溶液。
1.4 色谱条件 Hypersil ODS2(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，大连依利特科学仪器有限公司。检测波长250 nm。流动相：0～10 min，乙腈-0.02 mol.L-1磷酸二氢钾(12∶88)，10～25 min，乙腈-0.02 mol.L-1磷酸二氢钾(25∶75)；流速1.0 mL.min-1。保留时间为葛根素6.9 min，大豆苷13.1 min，大豆苷元22.0 min。色谱图见图1。
, 百拇医药
图1 三维高效液相色谱图
A.对照品 B.野葛
1.葛根素 2.大豆苷 3.大豆苷元
2 结果
2.1 线性关系考察 精密称取葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品适量，分别配制系列浓度溶液，葛根素：1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0，64.0，130.0 μg.mL-1，大豆苷：0.325，0.65，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0 μg.mL-1，大豆苷元：0.0845，0.169，0.325，0.65，1.3，2.6，5.2，10.4 μg.mL-1。进样10 μL，以峰高对浓度进行回归，葛根素、大豆苷、大豆苷元回归方程及相关系数分别为：
, 百拇医药
Y=-1 251.39+3 018.04C r=0.999 8 n=8
Y=-778.15+2 348.95C r=0.998 9 n=7
Y=-242.81+4 096.03C r=0.999 9 n=8
2.2 加样回收率 称取葛根样品(河北井陉)10 mg，置10 mL量瓶中，共6份，其中3份为空白样品组，3份加入葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品350.0 μg，8.0 μg，10.0 μg作为加样组，按“1.3”项下操作制备溶液，进样10 μL，葛根素、大豆苷、大豆苷元的加样回收率±RSD分别为(105.7±4.6)%，(105.4±6.9)%，(104.5±9.2)%，n=3。
2.3 精密度和重复性试验 取同一对照品溶液，连续进样3次，葛根素、大豆苷、大豆苷元的峰高的RSD分别为1.8%，2.3%，3.6%；取江西南昌野葛按“1.3”项下操作制备3份样品溶液，按测定条件进样3次，葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量的RSD分别为3.6%，3.1%，5.9%。
, 百拇医药
2.4 样品测定 按“1.3”项下操作制备样品溶液，进样10 μL，计算结果见表1，葛属植物7个种的色谱鉴别见图2。由图中可见 ，野葛与其它种葛属植物的色谱图有明显区别，苦葛、食用葛和三裂叶葛色谱图相近，同时也可以看出各个种都存在葛根素的色谱峰，但含量高低相差悬殊。
表1 葛属植物异黄酮成分测定结果
(%，n=3) 产地
种属
葛根素
大豆苷
大豆苷元
贵州岑巩
野葛
, 百拇医药 3.297(2.5)
0.246(1.9)
0.170(3.1)
江西南昌
野葛
1.012(3.6)
0.103(3.1)
0.028(5.9)
安徽金寨
野葛
2.044(1.8)
0.183(2.6)
, 百拇医药
0.039(3.2)
峨嵋山
野葛
4.875(1.3)
0.911(1.8)
0.099(2.3)
辽宁旅顺
野葛
6.021(2.7)
0.588(3.4)
0.088(2.9)
山东泰安
, 百拇医药
野葛
1.879(3.6)
0.058(4.5)
0.117(4.3)
天津蓟县
野葛
5.149(1.5)
0.129(2.1)
0.391(2.7)
西安
野葛
2.472(2.0)
, http://www.100md.com
0.102(2.7)
0.208(3.2)
河北井陉
野葛
2.885(2.2)
0.123(2.6)
0.128(2.8)
浙江天目山
野葛
2.501(2.4)
0.244(2.3)
0.103(3.0)
, 百拇医药
云南丽江
粉葛
0.806(1.8)
0.096(2.8)
0.030(3.2)
江西奉新
粉葛
0.537(3.1)
0.057(4.6)
0.039(4.9)
峨嵋山
峨嵋葛
, 百拇医药
1.126(2.4)
0.084(3.3)
0.055(3.7)
云南巍山
食用葛
0.244(3.7)
0.045(4.8)
0.074(1.8)
云南丽江
食用葛
—
—
, 百拇医药
0.052(3.4)
峨嵋山
苦葛
0.158(2.6)
0.036(3.5)
0.053(4.8)
云南巍山
苦葛
—
—
0.042(3.3)
云南永胜
黄毛葛
, http://www.100md.com
0.140(3.9)
—
0.030(4.0)
广州
三裂叶葛
0.373(2.4)
—
0.090(3.6)
注：—表示未测出，括号内数据为RSD(%)
图2 7种葛属植物的液相鉴别图
a.野葛 b.粉葛 c.峨嵋葛 d.苦葛
, 百拇医药
e.食用葛 f.三裂叶葛 g.黄毛葛
1.葛根素 2.大豆苷 3.大豆苷元
3 讨论
3.1 液相条件考察 作者考察色谱条件时发现葛根素、大豆苷、大豆苷元3种异黄酮成分的保留时间在流动相pH 3～7范围内保持恒定，但它们对流动相极性的变化敏感，随乙腈比例增加，保留时间均提前，尤其是葛根素和大豆苷，当乙腈比例由12%变为12.5%时，2者的保留时间均提前约1 min，当乙腈比例达到30%时，葛根样品中的组分已无法分开，为了保证待测组分短时间内出峰且无干扰，经过反复考察确定了本文的梯度洗脱条件进行定量、定性，比文献[3]报道的分别测定异黄酮的方法大大缩短了时间。
3.2 葛属植物测定结果探讨 作者测定了葛属植物的7个种，从表1可见，3种异黄酮成分的含量差异较大，中国药典收载了野葛和粉葛作为药用，从本研究的结果可见野葛中3种成分的含量明显高于其它种葛属植物，粉葛的含量明显低于野葛，以异黄酮作为药理活性成分，在食用葛、苦葛、黄毛葛和三裂叶葛中含量甚低，也证明其药用价值较低。本实验中发现不同产地的同种葛色谱图较相似(因篇幅关系未一一列出)，说明同种葛之间的化学组成差异小。值得一提的是峨嵋葛，色谱图介于野葛和粉葛之间，3种异黄酮成分的含量接近于药用的野葛和粉葛，故其可考虑作为药用，但需要进一步的研究。■
, 百拇医药
参考文献
1.Yoshimi K,Munehiko M,Yasuyuki U,et al.Analysis of isoflavones in Puerariae radix by high-performance liquid chromatography with amperometric detection.J Chromatogr,1985,347:438
2.Wang Chinyu,Huang Hisya,Kuo Kuanglung,et al.Analysis of Puerariae radix and its medicinal preparations by capillary electrophoresis.J Chromatogr A,1998,802:225
3.楼之岑，秦波.常用中药材品种整理和质量研究(北方编).第1册.北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社，1995.418
(本文于1999年7月13日收到), http://www.100md.com
单位：宋洪杰 胡晋红(上海长海医院 上海 200433)；曾明 张汉明(第二军医大学药学院生药教研室)；王大业(药学95队实习学员)
关键词：葛属植物；葛根素；大豆苷；大豆苷元；高效液相色谱
药物分析杂志000402 摘要 目的：测定7种葛属植物根中异黄酮成分的含量。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Hypersil ODS2(150 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长250 nm；葛根素、大豆苷、大豆苷元的加样回收率±RSD分别为(105.7±4.6)%，(105.4±6.9)%，(104.5±9.2)%。结果：葛属植物中3种异黄酮成分含量差异较大，野葛、粉葛和峨嵋葛中含有的葛根素和大豆苷比其它几种葛属植物高，野葛中葛根素的含量最高；从液相色谱图中观察到不同产地野葛的图谱与其它种的葛属植物有明显区别。结论：异黄酮成分可作为评价葛属植物质量的参考依据。
, 百拇医药
Determination and Chromatographic Identification of
3 Isoflavones of Pueraria Plants
Song Hongjie Zeng Ming Hu Jinhong Wang Daye Zhang Hanming
(Department of Clinical Pharmacology,Shanghai Changhai Hospital,Shanghai 200433)
Abstract Objective：To determine the content of isoflavones in seven species of genus Pueraria roots.Method:RP-HPLC method was used.The separation was performed on Hypersil ODS2(150 mm×4.6 mm,5 μm)column,the wavelength for detection was 250 nm.The recoveries for puerarin,daidzin and daidzein were as follows:(105.7±4.6)%，(105.4±6.9)%，(104.5±9.2)%.Results:The contents of three kinds of isoflavones in seven species of Pueraria plants were different.The contents of puerarin and daidzin in Pueraria lobata,P.thomsonii and P.omeiensis were higher than those of other Pueraria plants.The content of puerarin in Pueraria lobata was highest compared with other species.The chromatograms of Pueraria lobata from different districts were different from other species.Conclusion:The isoflavone components may be adopted as reference for evaluating the quality of genus Pueraria roots.
, 百拇医药
Key words Pueraria,puerarin,daidzin,daidzein,HPLC▲
葛根作为常用的中药材，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻之功效。现代药理研究表明药材中含有的异黄酮类成分如葛根素、大豆苷和大豆苷元是主要的药理活性成分，临床上常用单味药或复方制剂治疗冠心病、心肌梗塞和高血压病。本文从异黄酮成分含量测定和鉴别的角度考察了葛属植物中7个种，为葛根的质量评价提供参考。目前报道的葛根中葛根素、大豆苷、大豆苷元3种异黄酮成分的分析方法有HPLC和HPCE法[1，2]，本文采用反相高效液相色谱法，利用二元梯度洗脱，一次进样即同时完成3种异黄酮成分的含量测定，并进行了定性分析，可为评价葛根的质量提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试药 野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi,粉葛P.thomsonii Benth.,峨嵋葛P.omeiensis Wang et Tang,食用葛P.edulis Pampan.,苦葛P.peduncuradis(Grah.ex Benth.)Benth.,黄毛葛P.calycina Fanch.,三裂叶葛P.phaseloides(Roxb.)Benth.,由第二军医大学生药教研室曾明博士提供并鉴定；葛根素对照品(纯度为95.6%)由中国药品生物制品检定所提供，大豆苷(纯度为90.1%)、大豆苷元(纯度为92.5%)对照品由中国医学科学院药物所植化室提供；甲醇、乙腈为HPLC级，无水乙醇、磷酸二氢钾为分析纯。
, 百拇医药
1.2 仪器 日本岛津液相色谱仪LC-10AD泵，SPD-10Avp二极管阵列检测器，CLASS-LC10工作站，7725i进样阀配以20 μL定量管，上海必能信超声有限公司SB5200超声震荡器。
1.3 样品溶液的制备 将葛根生药粉碎，过60目筛，50 ℃烘干。称取10 mg，置10 mL量瓶中，分别用无水乙醇、甲醇、水稀释至刻度，超声振荡60 min，冷却至室温，补足挥发损失的溶剂，0.45 μm微孔滤膜过滤。经比较，无水乙醇提取葛根素、大豆苷及大豆苷元3种成分含量均最低，水提取葛根素含量显著高于甲醇，大豆苷、大豆苷元含量两者无显著差别，所以采用水作溶剂进行上述提取，即得样品溶液。
1.4 色谱条件 Hypersil ODS2(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，大连依利特科学仪器有限公司。检测波长250 nm。流动相：0～10 min，乙腈-0.02 mol.L-1磷酸二氢钾(12∶88)，10～25 min，乙腈-0.02 mol.L-1磷酸二氢钾(25∶75)；流速1.0 mL.min-1。保留时间为葛根素6.9 min，大豆苷13.1 min，大豆苷元22.0 min。色谱图见图1。
, 百拇医药
图1 三维高效液相色谱图
A.对照品 B.野葛
1.葛根素 2.大豆苷 3.大豆苷元
2 结果
2.1 线性关系考察 精密称取葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品适量，分别配制系列浓度溶液，葛根素：1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0，64.0，130.0 μg.mL-1，大豆苷：0.325，0.65，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0 μg.mL-1，大豆苷元：0.0845，0.169，0.325，0.65，1.3，2.6，5.2，10.4 μg.mL-1。进样10 μL，以峰高对浓度进行回归，葛根素、大豆苷、大豆苷元回归方程及相关系数分别为：
, 百拇医药
Y=-1 251.39+3 018.04C r=0.999 8 n=8
Y=-778.15+2 348.95C r=0.998 9 n=7
Y=-242.81+4 096.03C r=0.999 9 n=8
2.2 加样回收率 称取葛根样品(河北井陉)10 mg，置10 mL量瓶中，共6份，其中3份为空白样品组，3份加入葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品350.0 μg，8.0 μg，10.0 μg作为加样组，按“1.3”项下操作制备溶液，进样10 μL，葛根素、大豆苷、大豆苷元的加样回收率±RSD分别为(105.7±4.6)%，(105.4±6.9)%，(104.5±9.2)%，n=3。
2.3 精密度和重复性试验 取同一对照品溶液，连续进样3次，葛根素、大豆苷、大豆苷元的峰高的RSD分别为1.8%，2.3%，3.6%；取江西南昌野葛按“1.3”项下操作制备3份样品溶液，按测定条件进样3次，葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量的RSD分别为3.6%，3.1%，5.9%。
, 百拇医药
2.4 样品测定 按“1.3”项下操作制备样品溶液，进样10 μL，计算结果见表1，葛属植物7个种的色谱鉴别见图2。由图中可见 ，野葛与其它种葛属植物的色谱图有明显区别，苦葛、食用葛和三裂叶葛色谱图相近，同时也可以看出各个种都存在葛根素的色谱峰，但含量高低相差悬殊。
表1 葛属植物异黄酮成分测定结果
(%，n=3) 产地
种属
葛根素
大豆苷
大豆苷元
贵州岑巩
野葛
, 百拇医药 3.297(2.5)
0.246(1.9)
0.170(3.1)
江西南昌
野葛
1.012(3.6)
0.103(3.1)
0.028(5.9)
安徽金寨
野葛
2.044(1.8)
0.183(2.6)
, 百拇医药
0.039(3.2)
峨嵋山
野葛
4.875(1.3)
0.911(1.8)
0.099(2.3)
辽宁旅顺
野葛
6.021(2.7)
0.588(3.4)
0.088(2.9)
山东泰安
, 百拇医药
野葛
1.879(3.6)
0.058(4.5)
0.117(4.3)
天津蓟县
野葛
5.149(1.5)
0.129(2.1)
0.391(2.7)
西安
野葛
2.472(2.0)
, http://www.100md.com
0.102(2.7)
0.208(3.2)
河北井陉
野葛
2.885(2.2)
0.123(2.6)
0.128(2.8)
浙江天目山
野葛
2.501(2.4)
0.244(2.3)
0.103(3.0)
, 百拇医药
云南丽江
粉葛
0.806(1.8)
0.096(2.8)
0.030(3.2)
江西奉新
粉葛
0.537(3.1)
0.057(4.6)
0.039(4.9)
峨嵋山
峨嵋葛
, 百拇医药
1.126(2.4)
0.084(3.3)
0.055(3.7)
云南巍山
食用葛
0.244(3.7)
0.045(4.8)
0.074(1.8)
云南丽江
食用葛
—
—
, 百拇医药
0.052(3.4)
峨嵋山
苦葛
0.158(2.6)
0.036(3.5)
0.053(4.8)
云南巍山
苦葛
—
—
0.042(3.3)
云南永胜
黄毛葛
, http://www.100md.com
0.140(3.9)
—
0.030(4.0)
广州
三裂叶葛
0.373(2.4)
—
0.090(3.6)
注：—表示未测出，括号内数据为RSD(%)
图2 7种葛属植物的液相鉴别图
a.野葛 b.粉葛 c.峨嵋葛 d.苦葛
, 百拇医药
e.食用葛 f.三裂叶葛 g.黄毛葛
1.葛根素 2.大豆苷 3.大豆苷元
3 讨论
3.1 液相条件考察 作者考察色谱条件时发现葛根素、大豆苷、大豆苷元3种异黄酮成分的保留时间在流动相pH 3～7范围内保持恒定，但它们对流动相极性的变化敏感，随乙腈比例增加，保留时间均提前，尤其是葛根素和大豆苷，当乙腈比例由12%变为12.5%时，2者的保留时间均提前约1 min，当乙腈比例达到30%时，葛根样品中的组分已无法分开，为了保证待测组分短时间内出峰且无干扰，经过反复考察确定了本文的梯度洗脱条件进行定量、定性，比文献[3]报道的分别测定异黄酮的方法大大缩短了时间。
3.2 葛属植物测定结果探讨 作者测定了葛属植物的7个种，从表1可见，3种异黄酮成分的含量差异较大，中国药典收载了野葛和粉葛作为药用，从本研究的结果可见野葛中3种成分的含量明显高于其它种葛属植物，粉葛的含量明显低于野葛，以异黄酮作为药理活性成分，在食用葛、苦葛、黄毛葛和三裂叶葛中含量甚低，也证明其药用价值较低。本实验中发现不同产地的同种葛色谱图较相似(因篇幅关系未一一列出)，说明同种葛之间的化学组成差异小。值得一提的是峨嵋葛，色谱图介于野葛和粉葛之间，3种异黄酮成分的含量接近于药用的野葛和粉葛，故其可考虑作为药用，但需要进一步的研究。■
, 百拇医药
参考文献
1.Yoshimi K,Munehiko M,Yasuyuki U,et al.Analysis of isoflavones in Puerariae radix by high-performance liquid chromatography with amperometric detection.J Chromatogr,1985,347:438
2.Wang Chinyu,Huang Hisya,Kuo Kuanglung,et al.Analysis of Puerariae radix and its medicinal preparations by capillary electrophoresis.J Chromatogr A,1998,802:225
3.楼之岑，秦波.常用中药材品种整理和质量研究(北方编).第1册.北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社，1995.418
(本文于1999年7月13日收到), http://www.100md.com