Gq/11蛋白在缺血再灌注和缺血预处理中的作用
作者：吴立玲 王瑶 王岩眉 克拉拉 刘俊昌
单位：100083 北京医科大学病理生理学教研室
关键词：
中华医学杂志990221 刺激血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)、血栓素A2等多种细胞膜受体，可激活Gq/11蛋白。通过增加磷脂酶C(phospholipase C, PLC)活性，产生细胞内信使三磷酸肌醇和二脂酰甘油。三磷酸肌醇可促进细胞内储存的钙释放，二脂酰甘油则通过激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)对细胞的生长、代谢与功能产生重要的调控作用。已有大量研究表明，PKC激活是预处理的重要保护机制[1]，但对其上游信号转导通路了解甚少。为此我们对Gq/11蛋白在心肌缺血-再灌注(ischemia reperfusion, IR)和缺血预处理(ischemic preconditioning, IP)中的变化及意义进行了探讨，并对AngⅡ和异丙肾上腺素(isoproterenol ISO)对乳鼠心肌细胞Gq/11表达的影响进行了研究。
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一、材料与方法
1.离体灌流大鼠心脏等容收缩模型：健康雄性Wistar大鼠，200～250 g，200 g/L氨基甲酸乙酯(5 ml/kg)腹腔注射麻醉，迅速取出心脏，悬挂于Langendorff灌流架上，以95% O2～5% CO2平衡的37 ℃ K-H液行主动脉逆行恒压灌流。预灌流15分钟后动物随机分为3组(各组6只)：(1)对照组：正常灌流75分钟；(2)缺血-再灌注(IR)组：正常灌流30分钟后，停灌30分钟，再灌15分钟；(3)缺血预处理(IP)组：5分钟停灌/5分钟再灌×3，停灌30分钟，再灌15分钟，用生理四导仪记录灌流期左室收缩末压(LVSP)、左室舒张末压(LVDP)和心率(HR)。灌流结束后取心房肌测定血管紧张素转换酶(angiotensin converse enzyme, ACE)活性。
2.乳鼠心肌细胞培养：取新生2～4天Wistar大鼠心室肌，1.25 g/L胰酶消化，用含15%灭活胎牛血清和青霉素100 U，链霉素100 μg/100 ml的DMEM培养基将细胞悬液稀释成3×106个/ml，均匀接种于培养瓶内，随机分为3组：(1)对照组：置于37 ℃，含5%和95%空气的二氧化碳培养箱内培养144小时；(2)异丙肾上腺素(ISO)组：培养72小时后，加1×10-6 mol/L ISO培养72小时；(3) AngⅡ组：培养114小时后，加1×10-9 mol/L AngⅡ培养30小时。
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3.免疫印迹杂交分析：差速离心法制备心肌细胞膜，Lowry氏法测定膜蛋白含量。100 g/L SDS-PAGE分离蛋白，25 V 10小时将蛋白转移至硝酸纤维膜，含50 g/L脱脂奶粉PBS非特异性封闭后，加入抗Gαq/11亚单位抗体(Santa Cruz公司产品)4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时，化学发光法曝光。用LEICA-550IW图像分析系统对所得区带密度进行扫描。
4.统计学处理：所有数据以均数±标准误表示，采用one-way ANOVA计算机软件进行统计分析。
二、结果
1.IR和IP对离体灌流大鼠心功能和ACE活性的影响：实验开始时3组动物心功能无明显差异。对照组在整个实验中心功能保持稳定，IR组再灌注5分钟时[(LVSP-LVDP)×HR][2]比对照组降低45%，再灌注15分钟时降低33%，P均<0.01；预处理可明显减轻心肌缺血造成的损伤，心功能指标恢复率达到100%。对照组ACE活性为(0.18±0.03)μmol.min-1.g-1，IR组增加到(0.45±0.08) μmol.min-1.g-1，P<0.05，IP组与对照组差异无显著性意义。
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2.IR和IP时心脏Gαq/11含量的变化：用抗Gαq/11抗体检测心脏G蛋白，在相对分子质量42×103和43×103处呈现2条区带，Gα11在上，Gαq在下，与文献报道一致[3]。IR组Gαq/11含量与对照组相比无明显差异，IP组较对照组增加(45±7)%，P<0.01。
3.乳鼠心肌细胞Gαq/11表达的变化：1×10-6 mol/L ISO刺激正常乳鼠心肌细胞后，Gαq/11含量较对照组增加27%；1×10-9 mol/L AngⅡ使心肌细胞Gαq/11表达增加51%。
三、讨论
IR引起心肌Gαi含量增加[4]，这是导致腺苷酸环化酶信号转导通路功能障碍及心功能异常的重要原因。但IP时心肌Gαi含量与对照组相似，提示IP的保护作用并不是通过激活Gi实现的[5]。本实验用免疫印迹法直接观察心脏Gαq/11含量的变化，结果显示，IP组Gαq/11较对照组明显升高，这表明Gq/11蛋白介导的肌醇磷脂信号转导系统是IP保护的重要途径。IP通过激活Gq/11蛋白增加PLC活性，进而激活PKC，减轻缺血造成的心肌损伤。而IR时Gαq/11含量无明显变化，提示Gq/11蛋白及PLC激活可能不参与IR对心肌的损伤。与Gq/11相连的膜受体达几十种之多，在IR和IP时是哪种激素或介质在G蛋白介导的信号转导功能异常中起主要作用呢?Miyawaki等[6]的研究表明，ISO预处理可能通过激活PKC减轻缺血造成的损伤。实验表明，ISO使乳鼠心肌细胞Gαq/11含量显著升高，这提示ISO可能通过激活Gq/11蛋白完成对缺血心肌的保护作用。但目前尚未见β肾上腺素能受体与Gq/11蛋白直接偶联的报道，关于ISO激活Gq/11蛋白的途径尚需进一步探讨。
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AngⅡ受体可与Gi或Gq/11蛋白偶联，我们的工作表明，AngⅡ可刺激乳鼠心肌Gαq/11含量明显增加，这说明在正常心肌，AngⅡ可通过Gi又可通过Gq/11蛋白调节细胞的功能。但在病理情况下，心肌AngⅡ激活可能通过选择性激活某种G蛋白参与细胞的代偿或损伤。例如IR时通过激活Gi产生心肌损伤；而IP时主要通过激活Gαq/11，激活PKC，产生对缺血心肌的保护作用。
本课题为国家教委博士点基金资助项目(95101014)
参考文献
1 Liu Y, Yrehus K, Downey J. Evidence that translocation of protein kinase is a key event during ischemic preconditioning of rabbit myocardium. J Mol Cell Cardiol, 1994,26：661-668.
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2 Kingma JG, Simard D, Rouleau JR. Timely administration of AICA reside reduces reperfusion injury in rabbits. Cardiovas Res, 1994,28：1003-1007.
3 Lajat S, Tanfin Z, Guillon G, et al. Modulation of phospholipase C pathway and level of Gαq/G11α in rat myometrium during gestation. Am J Physiol, 1996,271：C895-C904.
4 王瑶，吴立玲，葛明珠.缺血-再灌注时大鼠心脏Gi蛋白α亚基的变化.生理学报，1998，50：514-518.
5 王瑶，吴立玲，罗婕，等.Giα2和Giα3蛋白在心脏缺血预处理中的作用.北京医科大学学报，1998，30：333-334.
6 Miyawaki H, Ashraf M. Isoproternol mimic calcium preconditioning induced protection against ischemia. Am J Physiol, 1997, 272：H927-H936.
(收稿：1998-07-09 修回：1998-10-20), http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学病理生理学教研室
关键词：
中华医学杂志990221 刺激血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)、血栓素A2等多种细胞膜受体，可激活Gq/11蛋白。通过增加磷脂酶C(phospholipase C, PLC)活性，产生细胞内信使三磷酸肌醇和二脂酰甘油。三磷酸肌醇可促进细胞内储存的钙释放，二脂酰甘油则通过激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)对细胞的生长、代谢与功能产生重要的调控作用。已有大量研究表明，PKC激活是预处理的重要保护机制[1]，但对其上游信号转导通路了解甚少。为此我们对Gq/11蛋白在心肌缺血-再灌注(ischemia reperfusion, IR)和缺血预处理(ischemic preconditioning, IP)中的变化及意义进行了探讨，并对AngⅡ和异丙肾上腺素(isoproterenol ISO)对乳鼠心肌细胞Gq/11表达的影响进行了研究。
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一、材料与方法
1.离体灌流大鼠心脏等容收缩模型：健康雄性Wistar大鼠，200～250 g，200 g/L氨基甲酸乙酯(5 ml/kg)腹腔注射麻醉，迅速取出心脏，悬挂于Langendorff灌流架上，以95% O2～5% CO2平衡的37 ℃ K-H液行主动脉逆行恒压灌流。预灌流15分钟后动物随机分为3组(各组6只)：(1)对照组：正常灌流75分钟；(2)缺血-再灌注(IR)组：正常灌流30分钟后，停灌30分钟，再灌15分钟；(3)缺血预处理(IP)组：5分钟停灌/5分钟再灌×3，停灌30分钟，再灌15分钟，用生理四导仪记录灌流期左室收缩末压(LVSP)、左室舒张末压(LVDP)和心率(HR)。灌流结束后取心房肌测定血管紧张素转换酶(angiotensin converse enzyme, ACE)活性。
2.乳鼠心肌细胞培养：取新生2～4天Wistar大鼠心室肌，1.25 g/L胰酶消化，用含15%灭活胎牛血清和青霉素100 U，链霉素100 μg/100 ml的DMEM培养基将细胞悬液稀释成3×106个/ml，均匀接种于培养瓶内，随机分为3组：(1)对照组：置于37 ℃，含5%和95%空气的二氧化碳培养箱内培养144小时；(2)异丙肾上腺素(ISO)组：培养72小时后，加1×10-6 mol/L ISO培养72小时；(3) AngⅡ组：培养114小时后，加1×10-9 mol/L AngⅡ培养30小时。
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3.免疫印迹杂交分析：差速离心法制备心肌细胞膜，Lowry氏法测定膜蛋白含量。100 g/L SDS-PAGE分离蛋白，25 V 10小时将蛋白转移至硝酸纤维膜，含50 g/L脱脂奶粉PBS非特异性封闭后，加入抗Gαq/11亚单位抗体(Santa Cruz公司产品)4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时，化学发光法曝光。用LEICA-550IW图像分析系统对所得区带密度进行扫描。
4.统计学处理：所有数据以均数±标准误表示，采用one-way ANOVA计算机软件进行统计分析。
二、结果
1.IR和IP对离体灌流大鼠心功能和ACE活性的影响：实验开始时3组动物心功能无明显差异。对照组在整个实验中心功能保持稳定，IR组再灌注5分钟时[(LVSP-LVDP)×HR][2]比对照组降低45%，再灌注15分钟时降低33%，P均<0.01；预处理可明显减轻心肌缺血造成的损伤，心功能指标恢复率达到100%。对照组ACE活性为(0.18±0.03)μmol.min-1.g-1，IR组增加到(0.45±0.08) μmol.min-1.g-1，P<0.05，IP组与对照组差异无显著性意义。
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2.IR和IP时心脏Gαq/11含量的变化：用抗Gαq/11抗体检测心脏G蛋白，在相对分子质量42×103和43×103处呈现2条区带，Gα11在上，Gαq在下，与文献报道一致[3]。IR组Gαq/11含量与对照组相比无明显差异，IP组较对照组增加(45±7)%，P<0.01。
3.乳鼠心肌细胞Gαq/11表达的变化：1×10-6 mol/L ISO刺激正常乳鼠心肌细胞后，Gαq/11含量较对照组增加27%；1×10-9 mol/L AngⅡ使心肌细胞Gαq/11表达增加51%。
三、讨论
IR引起心肌Gαi含量增加[4]，这是导致腺苷酸环化酶信号转导通路功能障碍及心功能异常的重要原因。但IP时心肌Gαi含量与对照组相似，提示IP的保护作用并不是通过激活Gi实现的[5]。本实验用免疫印迹法直接观察心脏Gαq/11含量的变化，结果显示，IP组Gαq/11较对照组明显升高，这表明Gq/11蛋白介导的肌醇磷脂信号转导系统是IP保护的重要途径。IP通过激活Gq/11蛋白增加PLC活性，进而激活PKC，减轻缺血造成的心肌损伤。而IR时Gαq/11含量无明显变化，提示Gq/11蛋白及PLC激活可能不参与IR对心肌的损伤。与Gq/11相连的膜受体达几十种之多，在IR和IP时是哪种激素或介质在G蛋白介导的信号转导功能异常中起主要作用呢?Miyawaki等[6]的研究表明，ISO预处理可能通过激活PKC减轻缺血造成的损伤。实验表明，ISO使乳鼠心肌细胞Gαq/11含量显著升高，这提示ISO可能通过激活Gq/11蛋白完成对缺血心肌的保护作用。但目前尚未见β肾上腺素能受体与Gq/11蛋白直接偶联的报道，关于ISO激活Gq/11蛋白的途径尚需进一步探讨。
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AngⅡ受体可与Gi或Gq/11蛋白偶联，我们的工作表明，AngⅡ可刺激乳鼠心肌Gαq/11含量明显增加，这说明在正常心肌，AngⅡ可通过Gi又可通过Gq/11蛋白调节细胞的功能。但在病理情况下，心肌AngⅡ激活可能通过选择性激活某种G蛋白参与细胞的代偿或损伤。例如IR时通过激活Gi产生心肌损伤；而IP时主要通过激活Gαq/11，激活PKC，产生对缺血心肌的保护作用。
本课题为国家教委博士点基金资助项目(95101014)
参考文献
1 Liu Y, Yrehus K, Downey J. Evidence that translocation of protein kinase is a key event during ischemic preconditioning of rabbit myocardium. J Mol Cell Cardiol, 1994,26：661-668.
, http://www.100md.com
2 Kingma JG, Simard D, Rouleau JR. Timely administration of AICA reside reduces reperfusion injury in rabbits. Cardiovas Res, 1994,28：1003-1007.
3 Lajat S, Tanfin Z, Guillon G, et al. Modulation of phospholipase C pathway and level of Gαq/G11α in rat myometrium during gestation. Am J Physiol, 1996,271：C895-C904.
4 王瑶，吴立玲，葛明珠.缺血-再灌注时大鼠心脏Gi蛋白α亚基的变化.生理学报，1998，50：514-518.
5 王瑶，吴立玲，罗婕，等.Giα2和Giα3蛋白在心脏缺血预处理中的作用.北京医科大学学报，1998，30：333-334.
6 Miyawaki H, Ashraf M. Isoproternol mimic calcium preconditioning induced protection against ischemia. Am J Physiol, 1997, 272：H927-H936.
(收稿：1998-07-09 修回：1998-10-20), http://www.100md.com