乙型肝炎疫苗免疫失败儿童S基因变异株研究
作者：吕晴 朱启 熊思东 俞蕙 段恕诚
单位：吕晴 朱启 俞蕙 段恕诚 上海医科大学儿科医院 200032；熊思东上海医科大学免疫教研室
关键词：肝炎病毒；乙型；基因；突变；肝炎疫苗；乙型
中华儿科杂志991208 【摘要】 目的 探讨乙型肝炎(乙肝)疫苗免疫失败与S基因变异的关系。方法 106名乙肝疫苗免疫失败儿童血清为研究标本，从中提取DNA，经PCR扩增乙肝病毒(HBV)S区基因片段、Southern blot转移至尼龙膜，与S区标准序列探针杂交，选择PCR阳性与寡核苷酸探针不杂交的样本作序列分析。结果 免疫失败儿童中HBV DNA阳性率为93.4%(99/106)，99份样本中有30份与探针不杂交，占30.3%。选择11份作序列分析，10份存在核苷酸变异伴氨基酸改变，分别位于氨基酸残基113(S→T,T→P)、126(I→T)、 127(P→T)、131(N→T)、143(S→T)、161(Y→F)和175(L→F)。同时对一对母婴测序结果显示其序列完全一致，均存在131和161位氨基酸被取代。结论 该组免疫失败儿童中28.3%存在S区基因变异。变异株可经母婴传播。
, http://www.100md.com
Hepatitis B virus S gene mutants in infants who were infected despite immunoprophylaxis
*LU Qing, ZHU Qirong, XIONG Sidong, et al.
* Children′s Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To assess the correlation between the infants with surface gene mutant of hepatitis B virus (HBV) infection and failure in HB vaccination. Methods Sera from 106 infants who were born to HBV carrier mothers and had failure of HB vaccination were detected for HBV mutant by means of PCR, Southern blot, oligonucleotide hybridization and direct sequencing. Results Of the 106 cases, 99 (93.4%) were HBV DNA positive, 30.3% (30/99) of the samples failed to hybridize with any of the four probes. DNA sequencing confirmed 10 out of 11 samples had S gene mutation with amino acid (aa) change. The identified mutants include substitutions at nuclotide (nt) 546 T→A (aa131 N→T), nt531 T→C (aa126 I→T), nt491 A→C (aa113 T→P), nt491 T→A (aa113 S→T), nt533 C→A (aa127 P→T), nt581 T→A (aa143 S→T), nt 636 A→T (aa 161 Y→F) and nt 679 A→C (aa 175 L→F), respectively. The sequence in one pair of mother and her infant showed completely the same with mutation at aa131 and aa161. Conclusion The prevalence of HBV S gene mutants in the children who failed in HB vaccination was about 28.3%. The HBV mutants can be transmitted from mother to her infant.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B virus Genes Mutantion Hepatitis B vaccines
乙型肝炎(乙肝)病毒(hepatits B Virus, HBV)高度易变，变异可发生于前S/S、前C/C、P和X区。接种乙肝疫苗、抗HBV化学药物治疗、应用乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunogloubin， HBIG)和HBV慢性感染等均可引起S区基因变异[1-3]。从而导致病毒生物学特性和致病性改变。本研究分析和总结106例免疫失败儿童中 HBV S 变异株感染及意义。
材料和方法
一、研究对象
1 324例出生于HBV慢性携带者母亲的婴儿按0、1、6程序接种乙肝疫苗联合应用HBIG，定期临床随访和检测HBV、血清学标志，出现下列情况之一列为免疫失败：(1)HBsAg和(或)HBV DNA阳性，无论抗HBs产生与否；(2)HBsAg阴性、抗HBs阴性。1 324例婴儿中106例免疫失败，以这些婴儿并选择其中10例母亲作为研究对象。有5例儿童经序列分析已知存在“a”决定族变异，分别位于氨基酸残基145、144、129、126和122位。
, 百拇医药
二、血清HBsAg和抗HBs检测
选用美国Abbott公司或上海科华生物公司试剂，酶联免疫检测。
三、血清HBV DNA
取血清100 μl，经酚/氯仿法抽提DNA，乙醇沉淀干燥后溶30 μl TE缓冲液中。应用巢式PCR扩增HBV S区基因片段。
四、寡核苷酸杂交
设计4段包括“a”决定族序列在内的寡核苷酸探针，分别为P1(S495～S518)、P2(S519～S542)、P3(S543～S568)和P4(S569～S593)。探针由日本Takara Biotech公司合成和纯化。根据公式Tm=4℃(G/C)+2℃(A/G)计算熔解温度(melting temperature， Tm，即双链DNA半数裂解为单链时的温度)。4段探针Tm均设计为74℃。探针标记用r-32P-dATP(北京亚辉生物医学工程公司产品)和Takara公司末端标记试剂盒。
, 百拇医药
取PCR产物10 μl，电泳后经Southern blot转移至尼龙膜(Boehringer公司)分别与4段探针杂交。杂交温度取Tm-15℃(59℃)，洗膜温度为Tm-5 ℃(69℃)。膜置-70℃放射自显影24小时。选择质粒HBVDNA为阳性对照，5例已知序列的S变异株为不与相应探针杂交的阴性对照。
五、基因序列分析
从PCR反应阳性但与探针不杂交的样本中选择11份作序列分析。10份为免疫失败儿童样本，1份为母亲样本。10例免疫失败儿童中8例单用乙肝疫苗，2例乙肝疫苗联合应用HBIG(例1和例5)。测序试剂为扩增Taq DNA多聚酶染色终止循环序列试剂盒。测序仪为Abiprism Tm 377 DNA序列仪，根据测序结果自动打印出彩色波形图和碱基序列。
结果
一、血清HBV DNA检测结果
, 百拇医药
106份儿童样本HBV DNA阳性99例，占93.4%。见表1。
表1 106例免疫失败儿童HBV血清学标志检测 HBV DNA
HBsAg
合计
HBsAg(+)
HBsAg(-)
(+)
91
8
99
(-)
1
, 百拇医药
6
7
合计
92
14
106
二、寡核苷酸探针杂交结果
116份样本(106份免疫失败儿童样本，10份其母亲样本)中32份与其中1段或2段探针不杂交，其中30份为儿童样本。77份样本与所有探针均杂交，7份均不杂交(此7份样本血清HBV DNA检测结果阳性)。32份HBV DNA阳性与探针不杂交的样本中25份为与P2不杂交，占78.1%(表2)。5份已知HBV S区变异位置的变异株杂交结果与变异位点相符合(表3)。表2 116份样本寡核苷酸探针杂交结果 杂交结果
, 百拇医药
例数
杂交结果
例数
P1
P2
P3
P4
P1
P2
P3
P4
+
+
+
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+
77
+
+
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3
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7
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3
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2
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19
+
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1
+
+
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+
2
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表3 5份HBV S变异株与探针杂交结果 碱基变异位置
P1
P2
P3
P4
587G→A
+
+
+
-
585A→C
+
+
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+
-
541A→C
+
-
+
+
531T→G
+
-
+
+
499T→A
-
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-
+
+
520G→A
-
-
+
+
三、序列分析结果
从PCR检测HBV DNA阳性、与探针杂交阴性的32份样本中选择11份作序列分析，10份存在1个或1个以上碱基变异伴氨基酸改变，分别位于氨基酸残基113、126、127、131、143、161和175位。其中例7和例8是一对母婴，其核苷酸序列完全一致。
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四、HBV亚型
根据S基因519位和633位碱基决定HBV亚型，519位A/G决定d/y亚型，633位G/A决定w/r亚型。本组11例中7例为adw亚型，4例为adr亚型，与我国南方汉族人群中HBV亚型分布相符。
讨论
一、乙肝病毒S基因变异的意义
HBV S基因编码226个氨基酸残基，含二段亲水区，一段位于30～79，存在于HBsAg颗粒内部，另一段位于99～168，位于HBsAg表面，与其免疫原性关系密切。“a”决定族是HBV各型的共同抗原决定族，位于高度保守的124～147位氨基酸亲水区，并以124和127、139和147间的双硫键形成双襻样结构。这一结构对于维持HBsAg抗原性十分重要。该区域变异的临床意义包括(1)与乙肝疫苗免疫失败有关的变异株感染；(2)因病毒变异而不能与抗HBs结合，因而常规检测HBsAg阴性，对此类HBsAg阴性的HBV感染的诊断。(3)接受HBIG或特异性抗病毒治疗(如famciclovir和lamivucline)诱导的变异和变异株的耐药性[2]。
, 百拇医药
二、乙肝病毒S基因变异的检测
由于基因序列分析受试剂和仪器限制难以常规和在大样本中开展。应用寡核苷酸探针杂交是一种简便和实用的方法，并已应用于检测HBV前C区变异株[4]。它要求作为探针的序列高度保守，在严格控制杂交和洗膜温度时可检测出与探针序列不一致的单个或多个核苷酸变异。但由于不同亚型、地区和人种核苷酸序列的差异可引起假阳性结果，可通过设计含本区域常见基因序列的探针来提高检测特异性。
三、免疫失败儿童中的乙肝病毒S基因变异
本研究从106例乙肝免疫失败儿童中检测HBV S变异株，阳性率为30.3%，经序列分析验证，符合率达90.1%。目前我们参照的标准HBV亚型很少来自中国人[5]，因而在分析序列结果时应考虑到不同地理区域和人种间存在的差异。本研究7例adw亚型在核苷酸494、546和616位均与标准株同一亚型不同，结合临床综合分析考虑可能我国人群中该亚型的某位序列不同于国外标准株[6]，这需要更多的有关资料来证实。
, 百拇医药
基金项目：本课题由卫生部课题基金资助(项目编号：96-1-180)
参考文献
1 Carman WF, Zanetti AK, Karayiannis P, et al. Vaccine induced escape mutant of hepatitis B virus. Lancet, 1990, 336: 325-329.
2 Locarnini SA. Hepatitis B virus surface antigen and polymerase gene variants: potential viological and clinical significance. Hepatology, 1998, 27: 294-297.
3 Ghany MG, Ayola B, Villamil FG, et al. Hepatitis B virus mutant in liver transplant recipients with reinfected despite hepatitis B immune globulin prophylxis. Hepatology, 1998, 27:213-216.
, 百拇医药
4 Li JS, Tong SP, Vitvitski L, et al. Rapid detection and further characterization of infection with hepatitis B virus variantts containing a stop codon in the distal pre C region. J General Virology, 1990, 71: 1993-1998.
5 骆抗先. 乙型肝炎病毒变异的研究及临床意义评估中的问题. 中华医学杂志, 1997, 77：565-566.
6 He JW, Lu Q, Zhu QR, et al. Mutations in the “a” determinant of hepatitis B surface antigen among Chinese infants receiving active post posture hepatitis B immunization. Vaccine, 1998, 16:170-173.
(收稿：1999-02-01 修回：1999-06-15), 百拇医药
单位：吕晴 朱启 俞蕙 段恕诚 上海医科大学儿科医院 200032；熊思东上海医科大学免疫教研室
关键词：肝炎病毒；乙型；基因；突变；肝炎疫苗；乙型
中华儿科杂志991208 【摘要】 目的 探讨乙型肝炎(乙肝)疫苗免疫失败与S基因变异的关系。方法 106名乙肝疫苗免疫失败儿童血清为研究标本，从中提取DNA，经PCR扩增乙肝病毒(HBV)S区基因片段、Southern blot转移至尼龙膜，与S区标准序列探针杂交，选择PCR阳性与寡核苷酸探针不杂交的样本作序列分析。结果 免疫失败儿童中HBV DNA阳性率为93.4%(99/106)，99份样本中有30份与探针不杂交，占30.3%。选择11份作序列分析，10份存在核苷酸变异伴氨基酸改变，分别位于氨基酸残基113(S→T,T→P)、126(I→T)、 127(P→T)、131(N→T)、143(S→T)、161(Y→F)和175(L→F)。同时对一对母婴测序结果显示其序列完全一致，均存在131和161位氨基酸被取代。结论 该组免疫失败儿童中28.3%存在S区基因变异。变异株可经母婴传播。
, http://www.100md.com
Hepatitis B virus S gene mutants in infants who were infected despite immunoprophylaxis
*LU Qing, ZHU Qirong, XIONG Sidong, et al.
* Children′s Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To assess the correlation between the infants with surface gene mutant of hepatitis B virus (HBV) infection and failure in HB vaccination. Methods Sera from 106 infants who were born to HBV carrier mothers and had failure of HB vaccination were detected for HBV mutant by means of PCR, Southern blot, oligonucleotide hybridization and direct sequencing. Results Of the 106 cases, 99 (93.4%) were HBV DNA positive, 30.3% (30/99) of the samples failed to hybridize with any of the four probes. DNA sequencing confirmed 10 out of 11 samples had S gene mutation with amino acid (aa) change. The identified mutants include substitutions at nuclotide (nt) 546 T→A (aa131 N→T), nt531 T→C (aa126 I→T), nt491 A→C (aa113 T→P), nt491 T→A (aa113 S→T), nt533 C→A (aa127 P→T), nt581 T→A (aa143 S→T), nt 636 A→T (aa 161 Y→F) and nt 679 A→C (aa 175 L→F), respectively. The sequence in one pair of mother and her infant showed completely the same with mutation at aa131 and aa161. Conclusion The prevalence of HBV S gene mutants in the children who failed in HB vaccination was about 28.3%. The HBV mutants can be transmitted from mother to her infant.
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【Key words】 Hepatitis B virus Genes Mutantion Hepatitis B vaccines
乙型肝炎(乙肝)病毒(hepatits B Virus, HBV)高度易变，变异可发生于前S/S、前C/C、P和X区。接种乙肝疫苗、抗HBV化学药物治疗、应用乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunogloubin， HBIG)和HBV慢性感染等均可引起S区基因变异[1-3]。从而导致病毒生物学特性和致病性改变。本研究分析和总结106例免疫失败儿童中 HBV S 变异株感染及意义。
材料和方法
一、研究对象
1 324例出生于HBV慢性携带者母亲的婴儿按0、1、6程序接种乙肝疫苗联合应用HBIG，定期临床随访和检测HBV、血清学标志，出现下列情况之一列为免疫失败：(1)HBsAg和(或)HBV DNA阳性，无论抗HBs产生与否；(2)HBsAg阴性、抗HBs阴性。1 324例婴儿中106例免疫失败，以这些婴儿并选择其中10例母亲作为研究对象。有5例儿童经序列分析已知存在“a”决定族变异，分别位于氨基酸残基145、144、129、126和122位。
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二、血清HBsAg和抗HBs检测
选用美国Abbott公司或上海科华生物公司试剂，酶联免疫检测。
三、血清HBV DNA
取血清100 μl，经酚/氯仿法抽提DNA，乙醇沉淀干燥后溶30 μl TE缓冲液中。应用巢式PCR扩增HBV S区基因片段。
四、寡核苷酸杂交
设计4段包括“a”决定族序列在内的寡核苷酸探针，分别为P1(S495～S518)、P2(S519～S542)、P3(S543～S568)和P4(S569～S593)。探针由日本Takara Biotech公司合成和纯化。根据公式Tm=4℃(G/C)+2℃(A/G)计算熔解温度(melting temperature， Tm，即双链DNA半数裂解为单链时的温度)。4段探针Tm均设计为74℃。探针标记用r-32P-dATP(北京亚辉生物医学工程公司产品)和Takara公司末端标记试剂盒。
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取PCR产物10 μl，电泳后经Southern blot转移至尼龙膜(Boehringer公司)分别与4段探针杂交。杂交温度取Tm-15℃(59℃)，洗膜温度为Tm-5 ℃(69℃)。膜置-70℃放射自显影24小时。选择质粒HBVDNA为阳性对照，5例已知序列的S变异株为不与相应探针杂交的阴性对照。
五、基因序列分析
从PCR反应阳性但与探针不杂交的样本中选择11份作序列分析。10份为免疫失败儿童样本，1份为母亲样本。10例免疫失败儿童中8例单用乙肝疫苗，2例乙肝疫苗联合应用HBIG(例1和例5)。测序试剂为扩增Taq DNA多聚酶染色终止循环序列试剂盒。测序仪为Abiprism Tm 377 DNA序列仪，根据测序结果自动打印出彩色波形图和碱基序列。
结果
一、血清HBV DNA检测结果
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106份儿童样本HBV DNA阳性99例，占93.4%。见表1。
表1 106例免疫失败儿童HBV血清学标志检测 HBV DNA
HBsAg
合计
HBsAg(+)
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6
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合计
92
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二、寡核苷酸探针杂交结果
116份样本(106份免疫失败儿童样本，10份其母亲样本)中32份与其中1段或2段探针不杂交，其中30份为儿童样本。77份样本与所有探针均杂交，7份均不杂交(此7份样本血清HBV DNA检测结果阳性)。32份HBV DNA阳性与探针不杂交的样本中25份为与P2不杂交，占78.1%(表2)。5份已知HBV S区变异位置的变异株杂交结果与变异位点相符合(表3)。表2 116份样本寡核苷酸探针杂交结果 杂交结果
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例数
杂交结果
例数
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表3 5份HBV S变异株与探针杂交结果 碱基变异位置
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587G→A
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三、序列分析结果
从PCR检测HBV DNA阳性、与探针杂交阴性的32份样本中选择11份作序列分析，10份存在1个或1个以上碱基变异伴氨基酸改变，分别位于氨基酸残基113、126、127、131、143、161和175位。其中例7和例8是一对母婴，其核苷酸序列完全一致。
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四、HBV亚型
根据S基因519位和633位碱基决定HBV亚型，519位A/G决定d/y亚型，633位G/A决定w/r亚型。本组11例中7例为adw亚型，4例为adr亚型，与我国南方汉族人群中HBV亚型分布相符。
讨论
一、乙肝病毒S基因变异的意义
HBV S基因编码226个氨基酸残基，含二段亲水区，一段位于30～79，存在于HBsAg颗粒内部，另一段位于99～168，位于HBsAg表面，与其免疫原性关系密切。“a”决定族是HBV各型的共同抗原决定族，位于高度保守的124～147位氨基酸亲水区，并以124和127、139和147间的双硫键形成双襻样结构。这一结构对于维持HBsAg抗原性十分重要。该区域变异的临床意义包括(1)与乙肝疫苗免疫失败有关的变异株感染；(2)因病毒变异而不能与抗HBs结合，因而常规检测HBsAg阴性，对此类HBsAg阴性的HBV感染的诊断。(3)接受HBIG或特异性抗病毒治疗(如famciclovir和lamivucline)诱导的变异和变异株的耐药性[2]。
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二、乙肝病毒S基因变异的检测
由于基因序列分析受试剂和仪器限制难以常规和在大样本中开展。应用寡核苷酸探针杂交是一种简便和实用的方法，并已应用于检测HBV前C区变异株[4]。它要求作为探针的序列高度保守，在严格控制杂交和洗膜温度时可检测出与探针序列不一致的单个或多个核苷酸变异。但由于不同亚型、地区和人种核苷酸序列的差异可引起假阳性结果，可通过设计含本区域常见基因序列的探针来提高检测特异性。
三、免疫失败儿童中的乙肝病毒S基因变异
本研究从106例乙肝免疫失败儿童中检测HBV S变异株，阳性率为30.3%，经序列分析验证，符合率达90.1%。目前我们参照的标准HBV亚型很少来自中国人[5]，因而在分析序列结果时应考虑到不同地理区域和人种间存在的差异。本研究7例adw亚型在核苷酸494、546和616位均与标准株同一亚型不同，结合临床综合分析考虑可能我国人群中该亚型的某位序列不同于国外标准株[6]，这需要更多的有关资料来证实。
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基金项目：本课题由卫生部课题基金资助(项目编号：96-1-180)
参考文献
1 Carman WF, Zanetti AK, Karayiannis P, et al. Vaccine induced escape mutant of hepatitis B virus. Lancet, 1990, 336: 325-329.
2 Locarnini SA. Hepatitis B virus surface antigen and polymerase gene variants: potential viological and clinical significance. Hepatology, 1998, 27: 294-297.
3 Ghany MG, Ayola B, Villamil FG, et al. Hepatitis B virus mutant in liver transplant recipients with reinfected despite hepatitis B immune globulin prophylxis. Hepatology, 1998, 27:213-216.
, 百拇医药
4 Li JS, Tong SP, Vitvitski L, et al. Rapid detection and further characterization of infection with hepatitis B virus variantts containing a stop codon in the distal pre C region. J General Virology, 1990, 71: 1993-1998.
5 骆抗先. 乙型肝炎病毒变异的研究及临床意义评估中的问题. 中华医学杂志, 1997, 77：565-566.
6 He JW, Lu Q, Zhu QR, et al. Mutations in the “a” determinant of hepatitis B surface antigen among Chinese infants receiving active post posture hepatitis B immunization. Vaccine, 1998, 16:170-173.
(收稿：1999-02-01 修回：1999-06-15), 百拇医药