PCR和PCR扩增产物斑点杂交技术检测人乳头瘤病毒敏感性比较
作者：陈柏坤 包其郁 张洪勤 陈波蓓
单位：陈柏坤 温州医学院微生物学教研室(325027)；包其郁 张洪勤 分子生物学研究中心；陈波蓓 温州医学院附属第二医院耳鼻喉科
关键词：
温州医学院学报/990434 人体感染人乳头瘤病毒(HPV)常表现为皮肤疣、疣状表皮发育不良、湿疣等，HPV还与诸如宫颈癌等多种疾病的发生相关。HPV型别多，且不同型的HPV引起的疣部位不同，其临床意义也不同。为研究某一病变组织的HPV型别分布，经常要对同一组织标本进行多型别HPV分析，但有时标本量少，或病毒基因拷贝低，使分型无法进行或影响结果的准确性。因此，为寻求一种更为敏感特异的检测方法，我们对41份喉乳头瘤组织和喉息肉标本，应用聚合酶链式反应(PCR)结合核酸探针杂交技术进行HPV6型分析比较。现将结果报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 标本 41例喉乳头瘤和喉息肉标本取自1998年1月至1999年7月间温州医学院附属第二医院耳鼻喉科手术治疗患者。
1.2 标本处理 乳头瘤和息肉组织用磷酸盐缓冲液洗涤，组织匀浆器匀浆后常规蛋白酶K消化，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于TE。
1.3 PCR扩增 HPV6引物(扩增260bp)序列为5-TAGTGGGCCTATGGCTCGTC-3和5
-TCCATTAGCCTCCACGGGTG-3，由中国科学院上海细胞生物学研究室合成。试剂用量为每50μL反应体系中，含分型引物50μmol/L,四种脱氧三磷酸核苷各200μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5单位，模板用量5μL，反应步骤为：92℃ 30秒变性，55℃ 30秒复性，72℃ 60秒引物延伸，共进行35个循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外光下观察结果并照相记录。
, 百拇医药
1.4 斑点杂交 地高辛(Dig)标记的HPV6寡核苷酸探针序列为：5Dig-CATTAACGCAGGGCCGC-
CTGAAATTGTGCC-3，由上海生工生物工程公司合成。试剂盒用贝灵曼公司(BOEHRINGER
MANNHEIM)产品(DIG DNA Labeling and Detection Kit,Cat.No.1093657),按说明书操作。主要步骤：①乳头瘤和息肉组织DNA提取物或PCR扩增产物经变性后点样于经10×SSC溶液浸湿的硝酸纤维膜上，80℃烘烤2小时；②预杂交30分钟；③37℃杂交过夜(5×SSC，1%阻断试剂，0.1%十二烷基肌酸钠，0.02%SDS，50%甲酰胺，Dig标记的寡核苷酸探针10ng/ml)；④2×SSC，0.1%SDS洗膜2次，0.1×SSC，0.1%SDS，68℃洗膜2次；⑤抗Dig抗体-碱性磷酸酶复合物作用30分钟；⑥BCIP和NBT显色，阳性标本可见紫色或蓝色斑点出现。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
2.1 PCR扩增产物和斑点杂交结果分析 PCR扩增产物和斑点杂交结果见图1、2。
图1 PCR扩增产物扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
A DNA分子量标准：ΦX174DNA/Hae Ⅲmarker(kb),1353，1078，872，603，310，281，271，234，194，118，72
B、C 阴性结果 D、E 阳性结果
, http://www.100md.com
图2 HPV6斑点杂交结果
A、B、C、D 阳性结果 E、F 阴性结果
2.2 三种方法检测结果 41份乳头瘤和息肉组织DNA提取物直接点膜斑点杂交检出HPV6型2例，检出率为4.9%(2/41)；PCR扩增检出率为19.5%(8/41)；PCR扩增产物斑点杂交检出率为34.1%(14/41)。三种方法检测结果的差异具有非常显著性意义(χ2=11.18，P<0.01)
2.3 PCR扩增法和PCR扩增产物斑点杂交法敏感性比较 41份标本用PCR扩增法和PCR扩增产物杂交法检测结果见表1，两种方法检测结果完全一致者为85.4%(35/41)，不一致者为14.6%(6/41)。
表1 两种方法检测HPV6结果比较
扩增产物
, 百拇医药
合计
+
-
PCR
+
8
0
8
-
6
27
33
合计
14
, 百拇医药
27
41
3 讨论
虽然PCR方法与核酸杂交技术均具有敏感性高等优点，但却难以检出基因拷贝低于104的病原[1，2]。HPV型别多，不同型的HPV引起不同部位组织病变，故为研究某一病变组织的HPV型别分布，经常要对同一组织标本进行多型别HPV分析。如果标本量少，或病毒基因拷贝低，必将影响结果的准确性。为寻求一种更为敏感特异的检测方法，Shibata在对石蜡切片标本进行的HPV16和HPV18的检测中发现，使用PCR扩增后的杂交检测能使检测敏感性达到可检出20个病毒基因拷贝的水平[3]，使敏感性提高近1000倍。我们对41份喉乳头瘤组织和喉息肉标本应用PCR扩增结合核酸探针杂交技术进行HPV6型分析比较，三种方法的41份喉乳头瘤和息肉组织的HPV6型检测结果显示，PCR扩增产物斑点杂交法的检出率最高(34.1%)，PCR扩增法检出率次之(19.5%)，DNA提取物直接点膜斑点杂交检出率最低(4.9%)(P<0.01)。由此可见，PCR扩增产物斑点杂交法的HPV6型检出率明显高于其他两种方法。虽然核酸杂交法较为繁琐，但其特异性强，使PCR扩增结果得到验证。因此，PCR扩增产物斑点杂交法不仅在HPV检测中，而且在其他病原的检测中应予以推广应用。
, 百拇医药
参考文献
1 林万明主编.临床基因探针诊断实验技术.上海：上海科学技术出版社，1992.7～10
2 林万明主编.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993.7～8
3 Shibata DK,Arnheim N,Martin WJ.Detection of human papilloma virus in paraffin-embedded tissue using the polymerase chain reaction.J Exp Med,1988,167(1)∶225～230
(收稿：1999-08-23), 百拇医药
单位：陈柏坤 温州医学院微生物学教研室(325027)；包其郁 张洪勤 分子生物学研究中心；陈波蓓 温州医学院附属第二医院耳鼻喉科
关键词：
温州医学院学报/990434 人体感染人乳头瘤病毒(HPV)常表现为皮肤疣、疣状表皮发育不良、湿疣等，HPV还与诸如宫颈癌等多种疾病的发生相关。HPV型别多，且不同型的HPV引起的疣部位不同，其临床意义也不同。为研究某一病变组织的HPV型别分布，经常要对同一组织标本进行多型别HPV分析，但有时标本量少，或病毒基因拷贝低，使分型无法进行或影响结果的准确性。因此，为寻求一种更为敏感特异的检测方法，我们对41份喉乳头瘤组织和喉息肉标本，应用聚合酶链式反应(PCR)结合核酸探针杂交技术进行HPV6型分析比较。现将结果报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 标本 41例喉乳头瘤和喉息肉标本取自1998年1月至1999年7月间温州医学院附属第二医院耳鼻喉科手术治疗患者。
1.2 标本处理 乳头瘤和息肉组织用磷酸盐缓冲液洗涤，组织匀浆器匀浆后常规蛋白酶K消化，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于TE。
1.3 PCR扩增 HPV6引物(扩增260bp)序列为5-TAGTGGGCCTATGGCTCGTC-3和5
-TCCATTAGCCTCCACGGGTG-3，由中国科学院上海细胞生物学研究室合成。试剂用量为每50μL反应体系中，含分型引物50μmol/L,四种脱氧三磷酸核苷各200μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5单位，模板用量5μL，反应步骤为：92℃ 30秒变性，55℃ 30秒复性，72℃ 60秒引物延伸，共进行35个循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外光下观察结果并照相记录。
, 百拇医药
1.4 斑点杂交 地高辛(Dig)标记的HPV6寡核苷酸探针序列为：5Dig-CATTAACGCAGGGCCGC-
CTGAAATTGTGCC-3，由上海生工生物工程公司合成。试剂盒用贝灵曼公司(BOEHRINGER
MANNHEIM)产品(DIG DNA Labeling and Detection Kit,Cat.No.1093657),按说明书操作。主要步骤：①乳头瘤和息肉组织DNA提取物或PCR扩增产物经变性后点样于经10×SSC溶液浸湿的硝酸纤维膜上，80℃烘烤2小时；②预杂交30分钟；③37℃杂交过夜(5×SSC，1%阻断试剂，0.1%十二烷基肌酸钠，0.02%SDS，50%甲酰胺，Dig标记的寡核苷酸探针10ng/ml)；④2×SSC，0.1%SDS洗膜2次，0.1×SSC，0.1%SDS，68℃洗膜2次；⑤抗Dig抗体-碱性磷酸酶复合物作用30分钟；⑥BCIP和NBT显色，阳性标本可见紫色或蓝色斑点出现。
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1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
2.1 PCR扩增产物和斑点杂交结果分析 PCR扩增产物和斑点杂交结果见图1、2。
图1 PCR扩增产物扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
A DNA分子量标准：ΦX174DNA/Hae Ⅲmarker(kb),1353，1078，872，603，310，281，271，234，194，118，72
B、C 阴性结果 D、E 阳性结果
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图2 HPV6斑点杂交结果
A、B、C、D 阳性结果 E、F 阴性结果
2.2 三种方法检测结果 41份乳头瘤和息肉组织DNA提取物直接点膜斑点杂交检出HPV6型2例，检出率为4.9%(2/41)；PCR扩增检出率为19.5%(8/41)；PCR扩增产物斑点杂交检出率为34.1%(14/41)。三种方法检测结果的差异具有非常显著性意义(χ2=11.18，P<0.01)
2.3 PCR扩增法和PCR扩增产物斑点杂交法敏感性比较 41份标本用PCR扩增法和PCR扩增产物杂交法检测结果见表1，两种方法检测结果完全一致者为85.4%(35/41)，不一致者为14.6%(6/41)。
表1 两种方法检测HPV6结果比较
扩增产物
, 百拇医药
合计
+
-
PCR
+
8
0
8
-
6
27
33
合计
14
, 百拇医药
27
41
3 讨论
虽然PCR方法与核酸杂交技术均具有敏感性高等优点，但却难以检出基因拷贝低于104的病原[1，2]。HPV型别多，不同型的HPV引起不同部位组织病变，故为研究某一病变组织的HPV型别分布，经常要对同一组织标本进行多型别HPV分析。如果标本量少，或病毒基因拷贝低，必将影响结果的准确性。为寻求一种更为敏感特异的检测方法，Shibata在对石蜡切片标本进行的HPV16和HPV18的检测中发现，使用PCR扩增后的杂交检测能使检测敏感性达到可检出20个病毒基因拷贝的水平[3]，使敏感性提高近1000倍。我们对41份喉乳头瘤组织和喉息肉标本应用PCR扩增结合核酸探针杂交技术进行HPV6型分析比较，三种方法的41份喉乳头瘤和息肉组织的HPV6型检测结果显示，PCR扩增产物斑点杂交法的检出率最高(34.1%)，PCR扩增法检出率次之(19.5%)，DNA提取物直接点膜斑点杂交检出率最低(4.9%)(P<0.01)。由此可见，PCR扩增产物斑点杂交法的HPV6型检出率明显高于其他两种方法。虽然核酸杂交法较为繁琐，但其特异性强，使PCR扩增结果得到验证。因此，PCR扩增产物斑点杂交法不仅在HPV检测中，而且在其他病原的检测中应予以推广应用。
, 百拇医药
参考文献
1 林万明主编.临床基因探针诊断实验技术.上海：上海科学技术出版社，1992.7～10
2 林万明主编.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993.7～8
3 Shibata DK,Arnheim N,Martin WJ.Detection of human papilloma virus in paraffin-embedded tissue using the polymerase chain reaction.J Exp Med,1988,167(1)∶225～230
(收稿：1999-08-23), 百拇医药