瘢痕疙瘩成纤维细胞对干扰素α-2b作用的反应
作者：何威 刘荣卿 钟白玉
单位：何威 刘荣卿 钟白玉(重庆第三军医大学西南医院皮肤科，400038)；何威(现在 第三军医大学新桥医院皮肤科，400037)
关键词：瘢痕疙瘩；成纤维细胞；胶原合成干扰素α-2b
临床皮肤科杂志000105
摘要 为探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞对干扰素α-2b(IFNα-2b)作用的反应性，用IFNα-2b分别处理体外培养正常皮肤与瘢痕疙瘩中的成纤维细胞，采用3H-脯氨酸掺入、胃蛋白酶消化法检测成纤维细胞胶原合成量。结果发现，瘢痕疙瘩成纤维细胞经103U/mL的IFNα-2b作用后的胶原合成量显著降低
Response of keloid fibroblasts to down-regulation on collagen synthesis by interferon alpha-2b
, http://www.100md.com
He Wei Liu Rongqing Zhong Baiyu
(Department of Dermatology,Southwest Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing,400038)
Abstract To investigate the biologic behavior of keloid fibroblasts, human dermal fibroblasts cultured from normal skin and keloids were treated with IFN α-2b for 48h at 103U/mL and 104U/mL.Collagen production by fibroblasts was assessed by 3H-proline incorporation into pepsin-resistant, precipitated extracellular collagenous protein. The results showed that treatment with IFN α-2b at 103U/mL significantly reduced the collagen synthesis in keloid fibroblasts(P<0.01). However,the collagen synthesis in keloid fibroblasts did not reduce further after exposure to IFN α-2b at 104U/mL.The results suggest that keloid fibroblasts characterized by the hyperproduction of collagen may be less sensitive to the inhibitory effects of IFN α-2b on collagen synthesis to a certain extent.
, 百拇医药
Key words Keloid Fibroblasts Collagen synthesis IFNα-2b
干扰素(IFN)因能抑制正常皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成，显示了在纤维化疾病治疗方面的可能前景[1]。瘢痕疙瘩是在创伤异常愈合过程中形成的一种特殊类型的瘢痕，属于真皮纤维化疾病的范畴，以胶原为主的细胞外基质成分在真皮内过度积聚为特征[2]。我们观察了瘢痕疙瘩成纤维细胞对IFNα-2b调节胶原合成作用的反应，以增进对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学特性的理解，并进一步探讨IFNα-2b治疗瘢痕疙瘩的可能性。
1材料和方法
1.1标本选择标准及来源：设正常对照组(无瘢痕疙瘩及其形成倾向个体)和瘢痕疙瘩组。取材对象限定为16～40岁、无结缔组织疾病、未系统应用皮质类固醇及其它可能影响结缔组织代谢药物的汉族人。由本科瘢痕疙瘩专病门诊选择1年内未接受局部外用或注射药物、放射治疗,并处于活跃增生阶段的胸部瘢痕疙瘩，在局麻下手术切取。正常对照组胸部正常皮肤标本由胸心外科和肾外科提供。
, 百拇医药
1.2主要试剂：DMEM干粉(Sigma公司)、胎牛血清(第三军医大学烧伤研究所)、胰蛋白酶(Difco公司)、胃蛋白酶(华美生物工程公司)、3H-L-脯氨酸(中国原子能研究院同位素研究所)、IFNα-2b(美国Schering-Plough药厂惠赠)。
1.3成纤维细胞培养：原代培养以组织块法实施[3]。用内含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、含5%CO2的二氧化碳孵箱(美国SHEL-LAB1815TC型)中培养，每周更换培养液2次。待原代培养长出的成纤维细胞接近或达到融合，用0.25%胰蛋白酶消化并传代。
1.4成纤维细胞胶原合成的检测：用无血清DMEM培养液稀释IFNα-2b，其最终作用浓度分别为103U/mL和104U/mL，作用时间48h，另设未经IFNα-2b作用的空白对照组，第2～4代的成纤维细胞用于研究。每一标本来源成纤维细胞设3个复孔，细胞接种于96孔培养板中，每孔加培养液200μL。采用24h标记期3H-脯氨酸掺入(掺入量0.5μCi/孔)、胃蛋白酶消化法检测培养液中胶原量[4]，用液闪测量仪(瑞典LKB-1217型)测定放射活性，结果以dpm/1000细胞表示。
, 百拇医药
表1 IFNα-2b作用前后瘢痕疙瘩组与政党对照组的成纤维细胞胶原合成量(
±s) 成纤维细胞
IFNα2b
空白对照组
103U/mL
104U/mL
瘢痕疙瘩组(n=6)
171.07±31.35
111.12±19.34*
94.04±15.67*★
正常对照组(n=5)
, http://www.100md.com
113.54±17.64
80.62±23.44△
49.24±13.64▲
t
2.88
2.47
6.78
P
<0.01
<0.05
<0.01
注:*与空折对照组相比P<0.01,★与103U/ml,IFNα-2b作用组相比P>0.05
, http://www.100md.com
△与空折对照组相比P<0.05.▲与空白对照组和103U/ml,IFNα-2b作用组相比P<0.01
1.5统计学处理：用本校数学教研室SPMR统计程序包PDA-2程序行单因素方差分析和均数比较。
2结果
瘢痕疙瘩组与正常对照组的成纤维细胞在体外培养时的生长过程相似，在形态学上也无明显差别。它们经IFNα-2b作用后的形态与各自的空白对照组相比也无明显差别。
瘢痕疙瘩组与正常对照组的成纤维细胞对IFNα-2b调节胶原合成作用的反应见表1。在未经IFNα-2b作用时，瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量显著高于正常对照组。经103U/mL的IFNα-2b作用后，正常对照组与瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量较各自的空白对照组均显著降低。经104U/mLIFNα-2b作用后，正常对照组成纤维细胞胶原合成量较其低浓度IFNα-2b作用后的胶原合成量仍有显著降低；然而，与正常对照组成纤维细胞的反应性有所不同，此时瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量与其低浓度IFNα-2b作用后的胶原合成量相比并无进一步显著降低。此外，经IFNα-2b作用后的瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量仍显著高于经相同浓度IFNα-2b作用的正常对照组的成纤维细胞胶原合成量。
, 百拇医药
3讨论
就细胞因子对成纤维细胞的作用而言，既有促进细胞增殖和(或)合成细胞外基质成分的刺激性细胞因子，如转化生长因子β在纤维化形成过程中起重要作用。另有与之作用相反的抑制性细胞因子，如干扰素能抑制正常皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成，凭藉其抑制性作用可用于纤维化疾病的治疗[1]。
除黑人外，亚州人也是瘢痕疙瘩的好发人群。瘢痕疙瘩在临床上较常见，迄今为止其发病机理尚不完全清楚，也无特效疗法。Berman于1989年首先报告，局部注射IFNα-2b治疗1例瘢痕疙瘩取得良效[5]。以后陆续又有应用IFN治疗肥厚性瘢痕和硬皮病等真皮纤维化疾病取得一定效果的报告[6,7]。然而，近些年来，也有人报告，局部注射IFNα-2b治疗瘢痕疙瘩并无明显疗效[8]。
我们的研究结果显示，在未经IFNα-2b作用时，瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量显著高于正常对照组成纤维细胞，提示瘢痕疙瘩中成纤维细胞胶原合成功能处于活化状态，胶原合成增加是瘢痕疙瘩中胶原过度聚集的重要原因。就对IFNα-2b的反应性而言，我们发现，在一定浓度IFNα-2b作用下，瘢痕疙瘩组成纤维细胞并未丧失对IFNα-2b下向调节胶原合成作用的反应，IFNα-2b可使瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量降低。既往研究发现，经IFNα-2b作用后，成纤维细胞胶原合成减少伴有其I型胶原mRNA表达降低[9]。我们推测，瘢痕疙瘩成纤维细胞经IFNα-2b作用后的胶原合成量降低可能与IFNα-2b抑制I型胶原mRNA表达有关。然而，与正常对照组成纤维细胞有所不同，随着IFNα-2b浓度的增加，瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量并无进一步下降，提示瘢痕疙瘩成纤维细胞对IFNα-2b下向调节胶原合成作用的反应敏感性在一定程度上低于正常皮肤成纤维细胞。其确切机理尚不清楚，是否与瘢痕疙瘩成纤维细胞的IFNα-2b受体表达及其调节的改变有关，尚待今后进一步深入探讨。临床应用IFNα-2b治疗瘢痕疙瘩时，应考虑到瘢痕疙瘩组织学特点(细胞数量和微血管密度的差异)、IFNα-2b的活性、剂量和疗程等因素对疗效的可能影响。要确切评价局部注射IFNα-2b治疗瘢痕疙瘩的疗效，还应积累更多的临床病例。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Tredget EE. The molecular biology of fibroproliferative disorders of the skin: potential cytokine therapeutics. Ann Plast Surg, 1994, 33(2):152～154
2，何威，刘荣卿.真皮纤维化疾病及其成纤维细胞研究.中国皮肤性病学杂志，1996，10(3)：168～169
3， Kischer CW, Pindur J. Effects of platelet derived growth factor (PDGF) on fibronectin(FN) production by human skin and scar fibroblasts. Cytotechnology, 1990, 3(2):231～238
, http://www.100md.com
4，李玉瑞.细胞外间质的生化及研究方法.北京：人民卫生出版社，1988.222～2235 Berman B, Duncan MR. Short-term keloid treatment in vivo with human interferon alpha-2b results in a selective and persistent normalization of keloidal fibroblast collagen, glycosaminoglycan, and collagenase production in vitro. J Am Acad Dermatol, 1989, 21(4):694～702
6，Stevens W, Vancheeswaran R, Black CM, et al. Alpha interferon-2α in the treatment of diffuse cutaneous systemic sclerosis: a pilot study. Br J Rheumatol, 1992, 31(10):683～689
, 百拇医药
7，Pittet B, Rubbia-Brandt L, Desmouliere A, et al. Effect of γ -interferon on the clinical and biologic evolution of hypertrophic scars and Dupuytren's disease: an open pilot study. Plast Reconstr Surg, 1994, 93(6):1224～1235
8，al Khawajah MM. Failure of interferon-alpha 2b in the treatment of mature keloids. Int J Dermatol, 1996, 35(7):515～517
9，Tredget EE, Shen YJ, Forsyth N, et al. Regulation of collagen synthesis and messenger RNA levels in normal and hypertrophic scar fibroblasts in vitro by interferon alpha-2b. Wound Rep Reg, 1993, 1(3):156～165
收稿 1999-05-04
修回 1999-08-09, 百拇医药
单位：何威 刘荣卿 钟白玉(重庆第三军医大学西南医院皮肤科，400038)；何威(现在 第三军医大学新桥医院皮肤科，400037)
关键词：瘢痕疙瘩；成纤维细胞；胶原合成干扰素α-2b
临床皮肤科杂志000105
摘要 为探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞对干扰素α-2b(IFNα-2b)作用的反应性，用IFNα-2b分别处理体外培养正常皮肤与瘢痕疙瘩中的成纤维细胞，采用3H-脯氨酸掺入、胃蛋白酶消化法检测成纤维细胞胶原合成量。结果发现，瘢痕疙瘩成纤维细胞经103U/mL的IFNα-2b作用后的胶原合成量显著降低
Response of keloid fibroblasts to down-regulation on collagen synthesis by interferon alpha-2b
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He Wei Liu Rongqing Zhong Baiyu
(Department of Dermatology,Southwest Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing,400038)
Abstract To investigate the biologic behavior of keloid fibroblasts, human dermal fibroblasts cultured from normal skin and keloids were treated with IFN α-2b for 48h at 103U/mL and 104U/mL.Collagen production by fibroblasts was assessed by 3H-proline incorporation into pepsin-resistant, precipitated extracellular collagenous protein. The results showed that treatment with IFN α-2b at 103U/mL significantly reduced the collagen synthesis in keloid fibroblasts(P<0.01). However,the collagen synthesis in keloid fibroblasts did not reduce further after exposure to IFN α-2b at 104U/mL.The results suggest that keloid fibroblasts characterized by the hyperproduction of collagen may be less sensitive to the inhibitory effects of IFN α-2b on collagen synthesis to a certain extent.
, 百拇医药
Key words Keloid Fibroblasts Collagen synthesis IFNα-2b
干扰素(IFN)因能抑制正常皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成，显示了在纤维化疾病治疗方面的可能前景[1]。瘢痕疙瘩是在创伤异常愈合过程中形成的一种特殊类型的瘢痕，属于真皮纤维化疾病的范畴，以胶原为主的细胞外基质成分在真皮内过度积聚为特征[2]。我们观察了瘢痕疙瘩成纤维细胞对IFNα-2b调节胶原合成作用的反应，以增进对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学特性的理解，并进一步探讨IFNα-2b治疗瘢痕疙瘩的可能性。
1材料和方法
1.1标本选择标准及来源：设正常对照组(无瘢痕疙瘩及其形成倾向个体)和瘢痕疙瘩组。取材对象限定为16～40岁、无结缔组织疾病、未系统应用皮质类固醇及其它可能影响结缔组织代谢药物的汉族人。由本科瘢痕疙瘩专病门诊选择1年内未接受局部外用或注射药物、放射治疗,并处于活跃增生阶段的胸部瘢痕疙瘩，在局麻下手术切取。正常对照组胸部正常皮肤标本由胸心外科和肾外科提供。
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1.2主要试剂：DMEM干粉(Sigma公司)、胎牛血清(第三军医大学烧伤研究所)、胰蛋白酶(Difco公司)、胃蛋白酶(华美生物工程公司)、3H-L-脯氨酸(中国原子能研究院同位素研究所)、IFNα-2b(美国Schering-Plough药厂惠赠)。
1.3成纤维细胞培养：原代培养以组织块法实施[3]。用内含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、含5%CO2的二氧化碳孵箱(美国SHEL-LAB1815TC型)中培养，每周更换培养液2次。待原代培养长出的成纤维细胞接近或达到融合，用0.25%胰蛋白酶消化并传代。
1.4成纤维细胞胶原合成的检测：用无血清DMEM培养液稀释IFNα-2b，其最终作用浓度分别为103U/mL和104U/mL，作用时间48h，另设未经IFNα-2b作用的空白对照组，第2～4代的成纤维细胞用于研究。每一标本来源成纤维细胞设3个复孔，细胞接种于96孔培养板中，每孔加培养液200μL。采用24h标记期3H-脯氨酸掺入(掺入量0.5μCi/孔)、胃蛋白酶消化法检测培养液中胶原量[4]，用液闪测量仪(瑞典LKB-1217型)测定放射活性，结果以dpm/1000细胞表示。
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表1 IFNα-2b作用前后瘢痕疙瘩组与政党对照组的成纤维细胞胶原合成量(
±s) 成纤维细胞IFNα2b
空白对照组
103U/mL
104U/mL
瘢痕疙瘩组(n=6)
171.07±31.35
111.12±19.34*
94.04±15.67*★
正常对照组(n=5)
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113.54±17.64
80.62±23.44△
49.24±13.64▲
t
2.88
2.47
6.78
P
<0.01
<0.05
<0.01
注:*与空折对照组相比P<0.01,★与103U/ml,IFNα-2b作用组相比P>0.05
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△与空折对照组相比P<0.05.▲与空白对照组和103U/ml,IFNα-2b作用组相比P<0.01
1.5统计学处理：用本校数学教研室SPMR统计程序包PDA-2程序行单因素方差分析和均数比较。
2结果
瘢痕疙瘩组与正常对照组的成纤维细胞在体外培养时的生长过程相似，在形态学上也无明显差别。它们经IFNα-2b作用后的形态与各自的空白对照组相比也无明显差别。
瘢痕疙瘩组与正常对照组的成纤维细胞对IFNα-2b调节胶原合成作用的反应见表1。在未经IFNα-2b作用时，瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量显著高于正常对照组。经103U/mL的IFNα-2b作用后，正常对照组与瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量较各自的空白对照组均显著降低。经104U/mLIFNα-2b作用后，正常对照组成纤维细胞胶原合成量较其低浓度IFNα-2b作用后的胶原合成量仍有显著降低；然而，与正常对照组成纤维细胞的反应性有所不同，此时瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量与其低浓度IFNα-2b作用后的胶原合成量相比并无进一步显著降低。此外，经IFNα-2b作用后的瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量仍显著高于经相同浓度IFNα-2b作用的正常对照组的成纤维细胞胶原合成量。
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3讨论
就细胞因子对成纤维细胞的作用而言，既有促进细胞增殖和(或)合成细胞外基质成分的刺激性细胞因子，如转化生长因子β在纤维化形成过程中起重要作用。另有与之作用相反的抑制性细胞因子，如干扰素能抑制正常皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成，凭藉其抑制性作用可用于纤维化疾病的治疗[1]。
除黑人外，亚州人也是瘢痕疙瘩的好发人群。瘢痕疙瘩在临床上较常见，迄今为止其发病机理尚不完全清楚，也无特效疗法。Berman于1989年首先报告，局部注射IFNα-2b治疗1例瘢痕疙瘩取得良效[5]。以后陆续又有应用IFN治疗肥厚性瘢痕和硬皮病等真皮纤维化疾病取得一定效果的报告[6,7]。然而，近些年来，也有人报告，局部注射IFNα-2b治疗瘢痕疙瘩并无明显疗效[8]。
我们的研究结果显示，在未经IFNα-2b作用时，瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量显著高于正常对照组成纤维细胞，提示瘢痕疙瘩中成纤维细胞胶原合成功能处于活化状态，胶原合成增加是瘢痕疙瘩中胶原过度聚集的重要原因。就对IFNα-2b的反应性而言，我们发现，在一定浓度IFNα-2b作用下，瘢痕疙瘩组成纤维细胞并未丧失对IFNα-2b下向调节胶原合成作用的反应，IFNα-2b可使瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量降低。既往研究发现，经IFNα-2b作用后，成纤维细胞胶原合成减少伴有其I型胶原mRNA表达降低[9]。我们推测，瘢痕疙瘩成纤维细胞经IFNα-2b作用后的胶原合成量降低可能与IFNα-2b抑制I型胶原mRNA表达有关。然而，与正常对照组成纤维细胞有所不同，随着IFNα-2b浓度的增加，瘢痕疙瘩组的成纤维细胞胶原合成量并无进一步下降，提示瘢痕疙瘩成纤维细胞对IFNα-2b下向调节胶原合成作用的反应敏感性在一定程度上低于正常皮肤成纤维细胞。其确切机理尚不清楚，是否与瘢痕疙瘩成纤维细胞的IFNα-2b受体表达及其调节的改变有关，尚待今后进一步深入探讨。临床应用IFNα-2b治疗瘢痕疙瘩时，应考虑到瘢痕疙瘩组织学特点(细胞数量和微血管密度的差异)、IFNα-2b的活性、剂量和疗程等因素对疗效的可能影响。要确切评价局部注射IFNα-2b治疗瘢痕疙瘩的疗效，还应积累更多的临床病例。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Tredget EE. The molecular biology of fibroproliferative disorders of the skin: potential cytokine therapeutics. Ann Plast Surg, 1994, 33(2):152～154
2，何威，刘荣卿.真皮纤维化疾病及其成纤维细胞研究.中国皮肤性病学杂志，1996，10(3)：168～169
3， Kischer CW, Pindur J. Effects of platelet derived growth factor (PDGF) on fibronectin(FN) production by human skin and scar fibroblasts. Cytotechnology, 1990, 3(2):231～238
, http://www.100md.com
4，李玉瑞.细胞外间质的生化及研究方法.北京：人民卫生出版社，1988.222～2235 Berman B, Duncan MR. Short-term keloid treatment in vivo with human interferon alpha-2b results in a selective and persistent normalization of keloidal fibroblast collagen, glycosaminoglycan, and collagenase production in vitro. J Am Acad Dermatol, 1989, 21(4):694～702
6，Stevens W, Vancheeswaran R, Black CM, et al. Alpha interferon-2α in the treatment of diffuse cutaneous systemic sclerosis: a pilot study. Br J Rheumatol, 1992, 31(10):683～689
, 百拇医药
7，Pittet B, Rubbia-Brandt L, Desmouliere A, et al. Effect of γ -interferon on the clinical and biologic evolution of hypertrophic scars and Dupuytren's disease: an open pilot study. Plast Reconstr Surg, 1994, 93(6):1224～1235
8，al Khawajah MM. Failure of interferon-alpha 2b in the treatment of mature keloids. Int J Dermatol, 1996, 35(7):515～517
9，Tredget EE, Shen YJ, Forsyth N, et al. Regulation of collagen synthesis and messenger RNA levels in normal and hypertrophic scar fibroblasts in vitro by interferon alpha-2b. Wound Rep Reg, 1993, 1(3):156～165
收稿 1999-05-04
修回 1999-08-09, 百拇医药