二磷酸盐对一水草酸钙晶体体外生长与聚集的影响
作者：赵军 肖亚军 庞自力 S. E. Papapoulos D. J. Kok I. Que
单位：赵军 庞自力(同济医科大学附属协和医院泌尿外科, 武汉 430022)；肖亚军 S. E. Papapoulos D. J. Kok I. Que(Clinical Investigation Unit, Department of Endocrinology, University Hospit al Leiden, The Netherlands)
关键词：一水草酸钙；晶体聚集；晶体生长；二磷酸盐
同济医科大学学报000218 摘要：应用Blomen建立的体外一水草酸钙结晶动力学 研究方法，研究了新近合成的二磷酸盐PPD和PPC对一水草酸钙晶体生长与聚集的影响。实验 结果表明：低浓度PPD、PPC (≤10 μmol/L)对草酸钙晶体生长的抑制程度分别为95.4%和6 8.6%，显著高于EHDP(51.7%)和PPI(21.6%) (P<0.01)，并具有抑制一水草酸钙晶 体聚集的作用(Tmi/Tmc>1)，而EHDP促进晶体聚集(Tmi/Tmc<1)。据此推测：PPD、PPC有可 能成为一类更有效防治结石复发的药物。
, 百拇医药
中图法分类号：R364.2
Effects of Diphosphates on COM Crystal Growth and Agglomeration in vitro
Zhao Jun, Xiao Yajun, Pang Zili et al
Department of Urology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract：The effects of PPD and PPC on COM crystal growth and a gglomeration were studied in vitro by using the crystal growth system establishe d by Blomen. It was found that inhibitory effect of PPD and PPC at a low concent ration of ≤10 μmol/L on COM crystal growth by PPD and PPC was stronger than by EHDP and PPI, (PPD: 95.4 %, PPC: 68.6 %, EHDP: 51.7 % and PPI: 21.6 % respect ively, P≤0.01). Both PPD and PPC could also inhibit the COM crystal agglome ration (Tmi/Tmc>1), but EHDP could not (Tmi/Tmc<1). It was suggested that PPD a nd PPC might become effective drugs in the prevention of urinary stone recurrenc e in vivo.
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Key words：diphosphates; crystal agglomeration; crystal growth ; COM
二磷酸盐是根据焦磷酸盐分子结构,人工合成的一类化合物。早在70年代，Pak等[1 ]就发现:二磷酸盐(EHDP)具有抑制草酸钙晶体形成，防治结石复发的作用。但因其 毒副作用未能在临床广泛应用。为寻找更有效防治结石复发的药物，我们应用Blomen建立的 体外草酸钙结晶动力学研究方法[2]，于1998年3～6月，研究了新合成的二磷酸盐 PPD和PPC对一水草酸钙(COM)晶体生长与聚集的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
氯化钠、氯化钙、草酸钾、焦磷酸盐(PPI)、HEPES,均为Sigma公司产品。草酸钙晶体(BDH ，Chem,Ltd,UK)，PPD：1，1-diphosphonopropan-2,3-dicarbon acid monohydrate，PP C: 3,3-diphosphonopentan-1,5dicarnon acid, EHDP: 1-hydroxyethylidene -1,1-d iphosphonate (HENKEL & CIE公司合成，Leiden大学Kok 博士提供)。
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1.2 方法
按Blomen建立的草酸钙体外结晶动力学研究方法[2]。
1.2.1 草酸钙溶解度：在一系列不同浓度的草酸钙溶液中(OX=Ca, 0.12～0.25 mmo l/L, I=0.15 mol/L)，以45Ca为示踪剂，加入草酸钙籽晶，20 min后，检测溶液中45 Ca，作图计算COM晶体开始生长的草酸钙溶液浓度。
1.2.2 COM晶体生长与聚集： A.草酸钙亚稳过饱和储备液：以双蒸水配制含0.15 mol/L NaCl, 10 mmol/L Hepes, Ca=OX=0.372 mmol/L, pH 6.0的储备液。 B.草酸钙籽晶：草酸钙晶体在37℃去离子水中持续搅拌2个月，经0.45 μm滤纸过滤 ，烤干备用。实验前在37℃去离子水中持续搅拌3.5 h，配制成浓度为0.139 mg/ml的草酸 钙籽晶匀浆。 C.晶体生长实验：在30 ml三角烧瓶(硅化)中分别加入Ca和OX储备液10 ml，45 Ca(0.2 ci) 0.1 ml，在37℃水浴箱保温30 min，对照组加 0.15 mol/L NaCl溶液1 ml， 实验组加1 ml不同浓度抑制剂(PPI、EHDP、PPC、PPD)，其终浓度分别为1～100 μmol/L， 然后加入0.4 ml 草酸钙籽晶。 水浴箱以150 r/min振荡。在不同时间(15,30,45,60,75 min )经0.45 μm滤纸过滤，收集 草酸钙晶体，经液体闪烁计数器检测草酸钙晶体对45Ca的摄取量，每组实验重复6次 ，按Blomen等人编写的计算机程序计算晶体生长抑制百分比与聚集指数。
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①晶体生长抑制百分比: GI(%)=Ka.inh/Ka.com。
Ka：晶体生长常数，Ka.inh：抑制因子存在时，晶体生长常数，Ka. com:对照组晶体生长 常数。
②晶体聚集指数[Tm]： 达到1/2最大晶体生长量的时间。
[Tm]i/[Tm]c<1：促进晶体聚集。
[Tm]i/[Tm]c>1：抑制晶体聚集。
2 结果
2.1 焦磷酸盐和二磷酸盐对一水草酸钙溶解度的影响
PPI、EHDP、PPD、PPC 在1～10 μmol/L(pH6.0,6.5,7.0,I=0.15 mol/L,37℃)， 对草酸钙溶解度无影响；大于10 μmol/L时，显著增加COM溶解度。在相同条件下，4种化合 物对COM溶解度的影响无差异。
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2.2 对一水草酸钙晶体生长的影响
4种化合物对草酸钙晶体生长均有显著的抑制作用，并且其抑制作用随浓度增高而增强。 在低浓度不影响草酸钙溶解度(≤10 μmol/L)时，其晶体生长抑制百分比分别为：PP D(95.4%)>PPC(68.6%)>EHDP(51.7%)>PPI(21.6%)(P<0.01)；在0.5 μmol/L 时，EHDP 、PPI对草酸钙晶体生长无抑制作用，但PPD、PPC的抑制作用分别为68.5%和17.2%(P <0.01)。
2.3 对草酸钙晶体聚集的影响
PPI 对草酸钙晶体聚集的影响与其浓度相关。PPI≥10 μmol/L时，抑制晶体聚集(Tmi/T mc>1)；二磷酸盐对晶体聚集的影响各不相同：①EHDP在所测浓度范围内(1～100 μmol /L)，均为促进作用(Tmi/Tmc<1)；②PPD≤20 μmol/L时，抑制聚集；>20 μmol/L时，促 进聚集；③PPC在1～80 μmol/L时，抑制聚集；≥100 μmol/L时，促进聚集。
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3 讨论
尿石形成被认为是一种病理性生物矿化，其中：成核、晶体生长、晶体聚集是结石形成最基 本的物理化学过程。晶体尿是一种常见的生理现象，提示成核在体内是经常发生的。结石患 者术后或ESWL后残留的微小结石，是结石生长、复发的核心。KOK等[3]亦发 现：结石病患者尿液抑制晶体聚集的能力显著降低，提高尿液抑制晶体聚集的活性对防治结 石复发有重要作用。为此, 我们重点研究了二磷酸盐对草酸钙晶体生长和聚集的影响。
实验结果表明：PPI和二磷酸盐对草酸钙晶体生长有明显的抑制作用，并且随浓度的增加 而加强。由于PPI、EHDP、PPC、PPD≥10 μmol/L时，能显著增加草酸钙溶解度，显然，PPI 、EHDP、PPC、PPD对草酸钙晶体生长的抑制作用与其降低草酸钙过饱和度密切相关。但在 低浓度(<10 μmol/L)时，上述4种化合物对草酸钙溶解度均无明显影响，但仍有强烈的抑 制作用，尤其是在≤5 μmol/L时，PPD和PPC对草酸钙晶体生长的抑制程度分别为95%和58% ，显 著高于EHDP(24%)和 PPI(10%)。Pak[1]曾在体外证实：EHDP具有抑制草酸钙晶体 生长的作用。我们的实验结果与之相符，并发现新近合成的二磷酸盐PPC、PPD对一水草酸钙 晶体生长的抑制作用显著高于EHDP。
, 百拇医药
PPI对草酸钙晶体聚集的抑制作用已得到众多学者的证实。Scurr[4]采用经典 的Zeta电位法证实：PPI对草酸钙晶体聚集的抑制作用呈浓度依赖性，低浓度PPI对草酸钙晶 体聚集无抑制作用。采用Blomen等建立的方法，我们在体外亦证实：低浓度PPI 对草酸钙 晶体聚集无影响，而较高浓度(≥10 μmol/L)对草酸钙晶体聚集有抑制作用(Tmi/Tm c>1)。EHDP在所测试浓度范围内(1～100 μmol/L)，促进晶体聚集(Tmi/Tmc< 1)。只有新近合成的二磷酸盐PPD、PPC在低浓度时，具有抑制草酸钙晶体聚集的作用。
在二磷酸盐P-C-P分子结构中，碳原子上有二个侧链基团，不同基团的二磷酸盐其物理 化学与生物学活性不尽相同，某些新合成的二磷酸盐抑制骨吸收的作用比EHDP强1000倍。Sh inoda[5]发现二磷酸盐分子结构与其抑制磷酸钙晶体生长作用有关。我们的结果显 示，不同二磷酸盐对草酸钙晶体生长、聚集的影响不尽相同。由于研究的二磷酸盐种类有 限，尚难总结其分子结构与其对草酸钙晶体生长、聚集的影响的关系，但现有结果提示：研 究二磷酸盐不同分子结构对草酸钙晶体生长、聚集的作用，有可能为指导合成更有效抑制草 酸钙晶体生长、聚集的二磷酸盐化合物提供依据。
, 百拇医药
药物动力学资料表明，二磷酸盐是以原型经肾脏排泄。Baumann[6]曾报道：口服 EHDP 4.4 mmol/d，尿浓度可达到10 μmol/L，平均每个病人结石形成数由2.4/年降低到0 .2/年，但长期服用可影响骨质代谢及矿化。我们的实验结果表明：新合成的二磷酸盐PPD 和PPC在<10 μmol/L时，不仅对草酸钙晶体生长有强烈抑制作用(显著大于EHDP)，并且有 抑制晶体聚集的作用(EHDP促进晶体聚集)。因此，我们推测：PPD和PPC有可能在不影响骨代 谢的剂量下有效防治结石复发。
赵军，男，1962年生，医学硕士， 副教授
参考文献
1，Pak C Y C, Ohata M, Holt K. Effect of diphosphonate on crystallizati on of calcium oxalate in vitro. Kidney Int, 1975, 7: 154
, 百拇医药
2，Will E J, Bijvoet O L M, Blomen L J M J. Growth kinetics of calciu m oxalate monohydrate. J Crystal Growth, 1983, 64:297
3，Kok D J, Papapoulos S E, Bijvoet O L M. Crystal agglomeration is a major element in calcium oxalate urinary stone formation. Kidney Int, 1990, 3 9:51
4，Scurr D S, Robertson W G. Studies on the mode of action of polynaion ic inhibitors of calcium oxalate crystallization in urine. In: Schwille P O, Sm ith L H, Robertson W G et al. eds. Urolithiasis and related clinical researc h. New York: 1985. 835～836
, http://www.100md.com
5，Shinoda H, Adamek G, Felix R et al: Structure-activity relation ships of various bisphosphonates. Calcif Tissue Int, 1983, 35: 87
6，Baumann J M, Bisaz S, Fleisch H. Biochemical and clinical eff ects of ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate in calcium nephrolithiasis. Clin Sci Molec Med, 1978, 54: 509
(收稿：1999-05-28), 百拇医药
单位：赵军 庞自力(同济医科大学附属协和医院泌尿外科, 武汉 430022)；肖亚军 S. E. Papapoulos D. J. Kok I. Que(Clinical Investigation Unit, Department of Endocrinology, University Hospit al Leiden, The Netherlands)
关键词：一水草酸钙；晶体聚集；晶体生长；二磷酸盐
同济医科大学学报000218 摘要：应用Blomen建立的体外一水草酸钙结晶动力学 研究方法，研究了新近合成的二磷酸盐PPD和PPC对一水草酸钙晶体生长与聚集的影响。实验 结果表明：低浓度PPD、PPC (≤10 μmol/L)对草酸钙晶体生长的抑制程度分别为95.4%和6 8.6%，显著高于EHDP(51.7%)和PPI(21.6%) (P<0.01)，并具有抑制一水草酸钙晶 体聚集的作用(Tmi/Tmc>1)，而EHDP促进晶体聚集(Tmi/Tmc<1)。据此推测：PPD、PPC有可 能成为一类更有效防治结石复发的药物。
, 百拇医药
中图法分类号：R364.2
Effects of Diphosphates on COM Crystal Growth and Agglomeration in vitro
Zhao Jun, Xiao Yajun, Pang Zili et al
Department of Urology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract：The effects of PPD and PPC on COM crystal growth and a gglomeration were studied in vitro by using the crystal growth system establishe d by Blomen. It was found that inhibitory effect of PPD and PPC at a low concent ration of ≤10 μmol/L on COM crystal growth by PPD and PPC was stronger than by EHDP and PPI, (PPD: 95.4 %, PPC: 68.6 %, EHDP: 51.7 % and PPI: 21.6 % respect ively, P≤0.01). Both PPD and PPC could also inhibit the COM crystal agglome ration (Tmi/Tmc>1), but EHDP could not (Tmi/Tmc<1). It was suggested that PPD a nd PPC might become effective drugs in the prevention of urinary stone recurrenc e in vivo.
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Key words：diphosphates; crystal agglomeration; crystal growth ; COM
二磷酸盐是根据焦磷酸盐分子结构,人工合成的一类化合物。早在70年代，Pak等[1 ]就发现:二磷酸盐(EHDP)具有抑制草酸钙晶体形成，防治结石复发的作用。但因其 毒副作用未能在临床广泛应用。为寻找更有效防治结石复发的药物，我们应用Blomen建立的 体外草酸钙结晶动力学研究方法[2]，于1998年3～6月，研究了新合成的二磷酸盐 PPD和PPC对一水草酸钙(COM)晶体生长与聚集的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
氯化钠、氯化钙、草酸钾、焦磷酸盐(PPI)、HEPES,均为Sigma公司产品。草酸钙晶体(BDH ，Chem,Ltd,UK)，PPD：1，1-diphosphonopropan-2,3-dicarbon acid monohydrate，PP C: 3,3-diphosphonopentan-1,5dicarnon acid, EHDP: 1-hydroxyethylidene -1,1-d iphosphonate (HENKEL & CIE公司合成，Leiden大学Kok 博士提供)。
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1.2 方法
按Blomen建立的草酸钙体外结晶动力学研究方法[2]。
1.2.1 草酸钙溶解度：在一系列不同浓度的草酸钙溶液中(OX=Ca, 0.12～0.25 mmo l/L, I=0.15 mol/L)，以45Ca为示踪剂，加入草酸钙籽晶，20 min后，检测溶液中45 Ca，作图计算COM晶体开始生长的草酸钙溶液浓度。
1.2.2 COM晶体生长与聚集： A.草酸钙亚稳过饱和储备液：以双蒸水配制含0.15 mol/L NaCl, 10 mmol/L Hepes, Ca=OX=0.372 mmol/L, pH 6.0的储备液。 B.草酸钙籽晶：草酸钙晶体在37℃去离子水中持续搅拌2个月，经0.45 μm滤纸过滤 ，烤干备用。实验前在37℃去离子水中持续搅拌3.5 h，配制成浓度为0.139 mg/ml的草酸 钙籽晶匀浆。 C.晶体生长实验：在30 ml三角烧瓶(硅化)中分别加入Ca和OX储备液10 ml，45 Ca(0.2 ci) 0.1 ml，在37℃水浴箱保温30 min，对照组加 0.15 mol/L NaCl溶液1 ml， 实验组加1 ml不同浓度抑制剂(PPI、EHDP、PPC、PPD)，其终浓度分别为1～100 μmol/L， 然后加入0.4 ml 草酸钙籽晶。 水浴箱以150 r/min振荡。在不同时间(15,30,45,60,75 min )经0.45 μm滤纸过滤，收集 草酸钙晶体，经液体闪烁计数器检测草酸钙晶体对45Ca的摄取量，每组实验重复6次 ，按Blomen等人编写的计算机程序计算晶体生长抑制百分比与聚集指数。
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①晶体生长抑制百分比: GI(%)=Ka.inh/Ka.com。
Ka：晶体生长常数，Ka.inh：抑制因子存在时，晶体生长常数，Ka. com:对照组晶体生长 常数。
②晶体聚集指数[Tm]： 达到1/2最大晶体生长量的时间。
[Tm]i/[Tm]c<1：促进晶体聚集。
[Tm]i/[Tm]c>1：抑制晶体聚集。
2 结果
2.1 焦磷酸盐和二磷酸盐对一水草酸钙溶解度的影响
PPI、EHDP、PPD、PPC 在1～10 μmol/L(pH6.0,6.5,7.0,I=0.15 mol/L,37℃)， 对草酸钙溶解度无影响；大于10 μmol/L时，显著增加COM溶解度。在相同条件下，4种化合 物对COM溶解度的影响无差异。
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2.2 对一水草酸钙晶体生长的影响
4种化合物对草酸钙晶体生长均有显著的抑制作用，并且其抑制作用随浓度增高而增强。 在低浓度不影响草酸钙溶解度(≤10 μmol/L)时，其晶体生长抑制百分比分别为：PP D(95.4%)>PPC(68.6%)>EHDP(51.7%)>PPI(21.6%)(P<0.01)；在0.5 μmol/L 时，EHDP 、PPI对草酸钙晶体生长无抑制作用，但PPD、PPC的抑制作用分别为68.5%和17.2%(P <0.01)。
2.3 对草酸钙晶体聚集的影响
PPI 对草酸钙晶体聚集的影响与其浓度相关。PPI≥10 μmol/L时，抑制晶体聚集(Tmi/T mc>1)；二磷酸盐对晶体聚集的影响各不相同：①EHDP在所测浓度范围内(1～100 μmol /L)，均为促进作用(Tmi/Tmc<1)；②PPD≤20 μmol/L时，抑制聚集；>20 μmol/L时，促 进聚集；③PPC在1～80 μmol/L时，抑制聚集；≥100 μmol/L时，促进聚集。
, 百拇医药
3 讨论
尿石形成被认为是一种病理性生物矿化，其中：成核、晶体生长、晶体聚集是结石形成最基 本的物理化学过程。晶体尿是一种常见的生理现象，提示成核在体内是经常发生的。结石患 者术后或ESWL后残留的微小结石，是结石生长、复发的核心。KOK等[3]亦发 现：结石病患者尿液抑制晶体聚集的能力显著降低，提高尿液抑制晶体聚集的活性对防治结 石复发有重要作用。为此, 我们重点研究了二磷酸盐对草酸钙晶体生长和聚集的影响。
实验结果表明：PPI和二磷酸盐对草酸钙晶体生长有明显的抑制作用，并且随浓度的增加 而加强。由于PPI、EHDP、PPC、PPD≥10 μmol/L时，能显著增加草酸钙溶解度，显然，PPI 、EHDP、PPC、PPD对草酸钙晶体生长的抑制作用与其降低草酸钙过饱和度密切相关。但在 低浓度(<10 μmol/L)时，上述4种化合物对草酸钙溶解度均无明显影响，但仍有强烈的抑 制作用，尤其是在≤5 μmol/L时，PPD和PPC对草酸钙晶体生长的抑制程度分别为95%和58% ，显 著高于EHDP(24%)和 PPI(10%)。Pak[1]曾在体外证实：EHDP具有抑制草酸钙晶体 生长的作用。我们的实验结果与之相符，并发现新近合成的二磷酸盐PPC、PPD对一水草酸钙 晶体生长的抑制作用显著高于EHDP。
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PPI对草酸钙晶体聚集的抑制作用已得到众多学者的证实。Scurr[4]采用经典 的Zeta电位法证实：PPI对草酸钙晶体聚集的抑制作用呈浓度依赖性，低浓度PPI对草酸钙晶 体聚集无抑制作用。采用Blomen等建立的方法，我们在体外亦证实：低浓度PPI 对草酸钙 晶体聚集无影响，而较高浓度(≥10 μmol/L)对草酸钙晶体聚集有抑制作用(Tmi/Tm c>1)。EHDP在所测试浓度范围内(1～100 μmol/L)，促进晶体聚集(Tmi/Tmc< 1)。只有新近合成的二磷酸盐PPD、PPC在低浓度时，具有抑制草酸钙晶体聚集的作用。
在二磷酸盐P-C-P分子结构中，碳原子上有二个侧链基团，不同基团的二磷酸盐其物理 化学与生物学活性不尽相同，某些新合成的二磷酸盐抑制骨吸收的作用比EHDP强1000倍。Sh inoda[5]发现二磷酸盐分子结构与其抑制磷酸钙晶体生长作用有关。我们的结果显 示，不同二磷酸盐对草酸钙晶体生长、聚集的影响不尽相同。由于研究的二磷酸盐种类有 限，尚难总结其分子结构与其对草酸钙晶体生长、聚集的影响的关系，但现有结果提示：研 究二磷酸盐不同分子结构对草酸钙晶体生长、聚集的作用，有可能为指导合成更有效抑制草 酸钙晶体生长、聚集的二磷酸盐化合物提供依据。
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药物动力学资料表明，二磷酸盐是以原型经肾脏排泄。Baumann[6]曾报道：口服 EHDP 4.4 mmol/d，尿浓度可达到10 μmol/L，平均每个病人结石形成数由2.4/年降低到0 .2/年，但长期服用可影响骨质代谢及矿化。我们的实验结果表明：新合成的二磷酸盐PPD 和PPC在<10 μmol/L时，不仅对草酸钙晶体生长有强烈抑制作用(显著大于EHDP)，并且有 抑制晶体聚集的作用(EHDP促进晶体聚集)。因此，我们推测：PPD和PPC有可能在不影响骨代 谢的剂量下有效防治结石复发。
赵军，男，1962年生，医学硕士， 副教授
参考文献
1，Pak C Y C, Ohata M, Holt K. Effect of diphosphonate on crystallizati on of calcium oxalate in vitro. Kidney Int, 1975, 7: 154
, 百拇医药
2，Will E J, Bijvoet O L M, Blomen L J M J. Growth kinetics of calciu m oxalate monohydrate. J Crystal Growth, 1983, 64:297
3，Kok D J, Papapoulos S E, Bijvoet O L M. Crystal agglomeration is a major element in calcium oxalate urinary stone formation. Kidney Int, 1990, 3 9:51
4，Scurr D S, Robertson W G. Studies on the mode of action of polynaion ic inhibitors of calcium oxalate crystallization in urine. In: Schwille P O, Sm ith L H, Robertson W G et al. eds. Urolithiasis and related clinical researc h. New York: 1985. 835～836
, http://www.100md.com
5，Shinoda H, Adamek G, Felix R et al: Structure-activity relation ships of various bisphosphonates. Calcif Tissue Int, 1983, 35: 87
6，Baumann J M, Bisaz S, Fleisch H. Biochemical and clinical eff ects of ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate in calcium nephrolithiasis. Clin Sci Molec Med, 1978, 54: 509
(收稿：1999-05-28), 百拇医药