大肠癌患者外周血T细胞亚群、NK细胞活性及可溶性白介素2受体检测的临床意义
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南京医科大学学报 2000年第4期第20卷 论著
作者：沈历宗 吴文溪 华一兵 蒋理 杜青
单位：南京医科大学第一附属医院普外科， 南京 210029
关键词：肠肿瘤；T淋巴细胞亚群；杀伤细胞；天然；可溶性白介素2受体
南京医科大学学报000414
摘 要 目的 研究大肠癌患者免疫状况及其与肿瘤分期的关系。方法 检测57例大肠癌患者外周血中T细胞亚群、NK细胞活性及可溶性白介素2受体(sIL-2R)。结果 大肠癌患者抑制性T细胞(CD8)比例、sIL-2R明显高于对照组，T细胞总数(CD3)、辅助性T细胞(CD4)比例、CD4/CD8及NK细胞活性明显低于对照组；随着Dukes分级的增加，CD3、CD4比例、CD4/CD8及NK细胞活性逐渐降低，CD8比例、sIL-2R逐渐增高。结论 大肠癌患者存在细胞免疫功能的低下，且免疫功能越低，越易发生淋巴结及远处转移，预后越差。在手术、化疗及其他治疗的同时应辅以免疫增强治疗。
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中图号 R392.11；R735.3+4
A Study on T-cell Subgroup, Natural Killer Cell Activity and SIL-2R in Patients with Colorectal Carcinoma
Shen Lizong, Wu Wenxi, Hua Yibing, et al.
(Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To study the immune functions in patients with colorectal carcinoma and the relationship with tumor stages. Methods The levels of T-cell subgroup、 natural killer cell activity and sIL-2R were investigated in 57 patients with colorectal carcinoma. Results In colorectal carcinoma, the blood CD3, CD4 levels, the ratio of CD4/CD8 and the natural killer cell activity were lower than that of control group, but the levels of CD8 and sIL-2R were higher than in control group, which changed with Dukes stages. Conclusion The cyto-immunity functions in patients with primary colorectal carcinoma significantly decrease, and the functions are getting worse with the tumor stages, therefore it is valuable to increase the immune function when operation and chemotherapy are administered in patients with primary colorectal carcinoma.
, 百拇医药
Key words intestinal neoplasms; T-lymphocytes; killer cells, natural; sIL-2R
大肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，在我国大肠癌的发病率有逐年增高的趋势。现代研究证实，肿瘤的发生发展与肿瘤宿主的免疫状态密切相关。我们通过检测大肠癌患者外周血中T细胞亚群、NK细胞活性及可溶性白介素2受体(sIL-2R)，研究大肠癌患者的免疫状况及其与肿瘤分期的关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料
共检测大肠癌患者57例，其中男38例，女19例；年龄31～78岁，平均58岁；结肠癌29例，直肠癌28例；所有病例检测前均未经化疗或其他治疗，均经手术及病理证实为腺癌，其中Dukes B期30例、C期16例、D期11例。
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18名健康人群作为正常对照，其中男12名，女6名，年龄18～49岁，体检均正常。
1.2 方法
所有病例均于术前空腹采集外周静脉血，按不同要求抗凝处理。
T细胞亚群的检测采用单抗致敏红细胞花环法；sIL-2R的检测采用双抗体夹心法。
NK细胞活性的检测方法：外周静脉血2 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液梯度离心获得淋巴细胞；将靶细胞K562(日本名古屋东二赤十字病院提供)调至2×105/ml，外周血淋巴细胞调至2×106/ml，用96孔细胞培养板，每孔加入分离的外周血淋巴细胞液100 μl及K562细胞100 μl，使靶效比为5～10∶1，同时设置靶效对照培养。用含15%小牛血清的RPMI 1640全培液，37℃、5% CO2无菌培养24 h后，加入5 mg/L的甲基噻唑基四唑(MTT)溶液10 μl，继续培养4 h。终止培养后加入十二烷基硫酸钠破膜液50 μl, 30 min后用酶标仪以570 nm波长测出每孔A值，并按以下公式计算，NK活性=[1-(E/T)-E)/(T-CL)]×100%，E：效应细胞，T：靶细胞，CL：培养液对照孔。
, 百拇医药
所有数据均采用
±s表示，统计学分析采用方差分析及t检验。
2 结 果
(1)大肠癌患者及对照组T细胞亚群检测结果(表1)提示，T淋巴细胞总数(CD3)及辅助性T细胞(CD4)比例在3组大肠癌患者中均分别低于对照组，Dukes B期组及C期组大肠癌患者抑制性T细胞(CD8)比例明显高于对照组，大肠癌组中CD4/CD8均低于对照组。大肠癌组间CD3、CD4比例、CD8比例及CD4/CD8均存在显著性差异(P<0.05)。
表1 各组外周血中T细胞亚群检测结果(±s) 组 别
, 百拇医药
CD3(%)
CD4(%)
CD8(%)
CD4/CD8
Dukes B组
58.11±5.38*
44.00±2.23*
32.76±2.13*
1.36±0.11*
Dukes C组
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52.57±7.15*
41.00±2.95*
36.57±1.31*
1.12±0.16*
Dukes D组
49.03±4.61**
40.41±3.05*
37.59±1.97*
1.08±0.21**
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对 照 组
70.54±2.83
49.16±1.74
22.34±2.42
2.18±0.19
与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。
(2)大肠癌患者及对照组NK细胞活性与sIL-2R检测结果表明，大肠癌各组NK细胞活性均明显低于对照组，而sIL-2R则显著高于对照组。大肠癌各组间NK细胞活性及sIL-2R比较也有显著性差异(P<0.05，表2)。
表2 各组外周血中NK细胞活性、sIL-2R检测结果(±s) 组别
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NK(%)
sIL-2R(c/U*ml-1)
Dukes B组
43.26±4.36*
134.64±4.89*
Dukes C组
40.10±2.77*
151.00±6.30*
Dukes D组
38.62±5.41*
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176.39±8.83*
对 照 组
65.26±4.51
89.57±11.16
与对照组比较，P<0.05。
3 讨 论
恶性肿瘤患者普遍存在免疫抑制，主要是免疫系统不能有效识别、排斥和消灭肿瘤细胞。本研究结果显示，大肠癌患者外周血CD3明显低于正常对照组，说明大肠癌患者细胞免疫功能处于抑制状态。T细胞亚群是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群，在正常机体内各T细胞亚群相互作用，维持着机体正常的免疫功能。现已证实，机体以T细胞为中心的细胞免疫功能的状态直接影响肿瘤的发生、发展及其预后[1]。T细胞的免疫调节作用主要由CD4、CD8完成，CD4协调B细胞分化产生抗体，CD8则抑制抗体的合成、分泌及T细胞的增殖，两者的稳态维持着机体正常的免疫应答。本研究结果显示，大肠癌患者外周血T细胞中CD8比例高于对照组，而CD4比例则低于对照组，使大肠癌患者的CD4/CD8明显低于对照组，进一步说明大肠癌患者术前细胞免疫功能低下。本研究还提示大肠癌患者中，随着Dukes分期的增加，CD4比例及CD4/CD8逐渐减少，而CD8比例逐渐增加，说明细胞免疫功能越差，越易发生淋巴结及远处转移，预后越差。
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如上所述，尽管T淋巴细胞介导的细胞免疫被认为在人类抗肿瘤发生的免疫监视功能中起主要作用，但实验发现在原发性免疫缺陷综合征患者中恶性肿瘤发病率并没有增加。文献认为，NK细胞在人体抗肿瘤免疫中起重要作用：Chediak-Higashi综合征患者NK细胞极低，而其他免疫功能正常，易患淋巴组织肿瘤；接受免疫抑制治疗的患者，NK细胞活性降低，恶性肿瘤发病率增加[2]。NK细胞具有以下免疫学特征：无须致敏，即可直接溶解靶细胞；富含免疫球蛋白碎片受体；出现在单核细胞周围；细胞质内含有大量嗜苯胺蓝颗粒。这些特点使其具备重要的免疫监视功能，可以防止肿瘤的发生。本研究结果显示，大肠癌患者术前NK细胞活性明显低于对照组，且在大肠癌患者中随着Dukes分期的增加，NK细胞活性逐级降低，提示大肠癌发生过程中存在NK细胞功能的抑制，继而促进肿瘤的发展。这与在肺癌[2]、食管癌等肿瘤中的发现是一致的。文献推测肿瘤患者NK细胞活性的降低可能与以下因素有关：在杀伤肿瘤细胞的过程中消耗大量NK细胞；肿瘤细胞分泌某种抑制或封闭因子使NK细胞活性降低；NK细胞在血液循环中再分布等。
, 百拇医药
IL-2是由辅助性T细胞产生的一种重要的免疫调节因子，具有促进CD8和NK细胞增殖、促进B细胞分化增殖和抗体生成、诱导生成淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)等功能。IL-2R有两种形式，一种位于细胞膜即细胞膜IL-2R(mIL-2R)，另一种出现于血液和培养上清液中即可溶性IL-2R(sIL-2R)，sIL-2R是活化的mIL-2Rα链成分，由细胞膜脱落进入血液循环中。本研究显示大肠癌患者术前外周血中sIL-2R显著升高，这与文献报道的其他肿瘤的结果一致。Theze等[3]认为，恶性肿瘤患者sIL-2R升高可能是肿瘤诱导的免疫反应所致，激活T淋巴细胞，使mIL-2R高度表达，同时释放sIL-2R进入血液循环。本研究还显示大肠癌的sIL-2R升高与肿瘤的Dukes分期有关，Dukes B、C、D期的sIL-2R水平逐渐增高，这与Murakami等[4]的报告完全符合。
现在认为sIL-2R升高可以增加与IL-2的结合，加速IL-2的廓清，使活化的T淋巴细胞恢复成休止细胞；sIL-2R与mIL-2R竞争结合IL-2，抑制T细胞增殖，同时抑制淋巴细胞浸润肿瘤组织；血清中sIL-2R增高说明大量IL-2R从膜上脱落，使活化的淋巴细胞处于衰竭状态；血清中sIL-2R水平升高常伴有CD4/CD8比值降低及NK细胞活性降低，影响B细胞功能和血中IgE浓度，导致机体免疫功能严重降低，使肿瘤逃脱宿主的免疫反应[5]。可见，本研究所揭示的大肠癌患者术前外周血中T细胞亚群、NK细胞活性及sIL-2R的变化是相互联系，相互制约的，究竟哪一个是始动因素，尚待进一步研究。总之，大肠癌患者术前细胞免疫功能明显低下，因此，在进行手术、化疗等治疗的同时，应辅以免疫增强治疗。至于围术期或化疗后以上各指标如何变化，正在研究之中。
, 百拇医药
参考文献
1，Lotze MT, Finn OJ. Recent advance in cellular immunology: implications for immunity to cancer. Immunol Today, 1990,11(6):190
2，孙灵菲，侯立新，刘德云.肺癌病人外周血T淋巴细胞亚群、NK活性和IL-2水平的研究.中国肿瘤临床与康复，1998，5(1)：8
3，Theze J, Alzari PM, Berroglio J. Interleukin 2 and its receptors: recent advances and new immunological functions. Immunol Today, 1996,17(10):481
4，Murakami S, Satomi A, Ishida K, et al. Serum soluble interleukin-2 receptor in colorectal cancer. Acta Oncologica, 1994,33(1):19
5，雷 雯，周锡庚.可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)与大肠癌.国外医学*外科学分册，1997，24(6)：322
(1999-12-01收稿), http://www.100md.com
单位：南京医科大学第一附属医院普外科， 南京 210029
关键词：肠肿瘤；T淋巴细胞亚群；杀伤细胞；天然；可溶性白介素2受体
南京医科大学学报000414
摘 要 目的 研究大肠癌患者免疫状况及其与肿瘤分期的关系。方法 检测57例大肠癌患者外周血中T细胞亚群、NK细胞活性及可溶性白介素2受体(sIL-2R)。结果 大肠癌患者抑制性T细胞(CD8)比例、sIL-2R明显高于对照组，T细胞总数(CD3)、辅助性T细胞(CD4)比例、CD4/CD8及NK细胞活性明显低于对照组；随着Dukes分级的增加，CD3、CD4比例、CD4/CD8及NK细胞活性逐渐降低，CD8比例、sIL-2R逐渐增高。结论 大肠癌患者存在细胞免疫功能的低下，且免疫功能越低，越易发生淋巴结及远处转移，预后越差。在手术、化疗及其他治疗的同时应辅以免疫增强治疗。
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中图号 R392.11；R735.3+4
A Study on T-cell Subgroup, Natural Killer Cell Activity and SIL-2R in Patients with Colorectal Carcinoma
Shen Lizong, Wu Wenxi, Hua Yibing, et al.
(Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To study the immune functions in patients with colorectal carcinoma and the relationship with tumor stages. Methods The levels of T-cell subgroup、 natural killer cell activity and sIL-2R were investigated in 57 patients with colorectal carcinoma. Results In colorectal carcinoma, the blood CD3, CD4 levels, the ratio of CD4/CD8 and the natural killer cell activity were lower than that of control group, but the levels of CD8 and sIL-2R were higher than in control group, which changed with Dukes stages. Conclusion The cyto-immunity functions in patients with primary colorectal carcinoma significantly decrease, and the functions are getting worse with the tumor stages, therefore it is valuable to increase the immune function when operation and chemotherapy are administered in patients with primary colorectal carcinoma.
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Key words intestinal neoplasms; T-lymphocytes; killer cells, natural; sIL-2R
大肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，在我国大肠癌的发病率有逐年增高的趋势。现代研究证实，肿瘤的发生发展与肿瘤宿主的免疫状态密切相关。我们通过检测大肠癌患者外周血中T细胞亚群、NK细胞活性及可溶性白介素2受体(sIL-2R)，研究大肠癌患者的免疫状况及其与肿瘤分期的关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料
共检测大肠癌患者57例，其中男38例，女19例；年龄31～78岁，平均58岁；结肠癌29例，直肠癌28例；所有病例检测前均未经化疗或其他治疗，均经手术及病理证实为腺癌，其中Dukes B期30例、C期16例、D期11例。
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18名健康人群作为正常对照，其中男12名，女6名，年龄18～49岁，体检均正常。
1.2 方法
所有病例均于术前空腹采集外周静脉血，按不同要求抗凝处理。
T细胞亚群的检测采用单抗致敏红细胞花环法；sIL-2R的检测采用双抗体夹心法。
NK细胞活性的检测方法：外周静脉血2 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液梯度离心获得淋巴细胞；将靶细胞K562(日本名古屋东二赤十字病院提供)调至2×105/ml，外周血淋巴细胞调至2×106/ml，用96孔细胞培养板，每孔加入分离的外周血淋巴细胞液100 μl及K562细胞100 μl，使靶效比为5～10∶1，同时设置靶效对照培养。用含15%小牛血清的RPMI 1640全培液，37℃、5% CO2无菌培养24 h后，加入5 mg/L的甲基噻唑基四唑(MTT)溶液10 μl，继续培养4 h。终止培养后加入十二烷基硫酸钠破膜液50 μl, 30 min后用酶标仪以570 nm波长测出每孔A值，并按以下公式计算，NK活性=[1-(E/T)-E)/(T-CL)]×100%，E：效应细胞，T：靶细胞，CL：培养液对照孔。
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所有数据均采用
±s表示，统计学分析采用方差分析及t检验。2 结 果
(1)大肠癌患者及对照组T细胞亚群检测结果(表1)提示，T淋巴细胞总数(CD3)及辅助性T细胞(CD4)比例在3组大肠癌患者中均分别低于对照组，Dukes B期组及C期组大肠癌患者抑制性T细胞(CD8)比例明显高于对照组，大肠癌组中CD4/CD8均低于对照组。大肠癌组间CD3、CD4比例、CD8比例及CD4/CD8均存在显著性差异(P<0.05)。
表1 各组外周血中T细胞亚群检测结果(
±s) 组 别, 百拇医药
CD3(%)
CD4(%)
CD8(%)
CD4/CD8
Dukes B组
58.11±5.38*
44.00±2.23*
32.76±2.13*
1.36±0.11*
Dukes C组
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52.57±7.15*
41.00±2.95*
36.57±1.31*
1.12±0.16*
Dukes D组
49.03±4.61**
40.41±3.05*
37.59±1.97*
1.08±0.21**
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对 照 组
70.54±2.83
49.16±1.74
22.34±2.42
2.18±0.19
与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。
(2)大肠癌患者及对照组NK细胞活性与sIL-2R检测结果表明，大肠癌各组NK细胞活性均明显低于对照组，而sIL-2R则显著高于对照组。大肠癌各组间NK细胞活性及sIL-2R比较也有显著性差异(P<0.05，表2)。
表2 各组外周血中NK细胞活性、sIL-2R检测结果(
±s) 组别, http://www.100md.com
NK(%)
sIL-2R(c/U*ml-1)
Dukes B组
43.26±4.36*
134.64±4.89*
Dukes C组
40.10±2.77*
151.00±6.30*
Dukes D组
38.62±5.41*
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176.39±8.83*
对 照 组
65.26±4.51
89.57±11.16
与对照组比较，P<0.05。
3 讨 论
恶性肿瘤患者普遍存在免疫抑制，主要是免疫系统不能有效识别、排斥和消灭肿瘤细胞。本研究结果显示，大肠癌患者外周血CD3明显低于正常对照组，说明大肠癌患者细胞免疫功能处于抑制状态。T细胞亚群是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群，在正常机体内各T细胞亚群相互作用，维持着机体正常的免疫功能。现已证实，机体以T细胞为中心的细胞免疫功能的状态直接影响肿瘤的发生、发展及其预后[1]。T细胞的免疫调节作用主要由CD4、CD8完成，CD4协调B细胞分化产生抗体，CD8则抑制抗体的合成、分泌及T细胞的增殖，两者的稳态维持着机体正常的免疫应答。本研究结果显示，大肠癌患者外周血T细胞中CD8比例高于对照组，而CD4比例则低于对照组，使大肠癌患者的CD4/CD8明显低于对照组，进一步说明大肠癌患者术前细胞免疫功能低下。本研究还提示大肠癌患者中，随着Dukes分期的增加，CD4比例及CD4/CD8逐渐减少，而CD8比例逐渐增加，说明细胞免疫功能越差，越易发生淋巴结及远处转移，预后越差。
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如上所述，尽管T淋巴细胞介导的细胞免疫被认为在人类抗肿瘤发生的免疫监视功能中起主要作用，但实验发现在原发性免疫缺陷综合征患者中恶性肿瘤发病率并没有增加。文献认为，NK细胞在人体抗肿瘤免疫中起重要作用：Chediak-Higashi综合征患者NK细胞极低，而其他免疫功能正常，易患淋巴组织肿瘤；接受免疫抑制治疗的患者，NK细胞活性降低，恶性肿瘤发病率增加[2]。NK细胞具有以下免疫学特征：无须致敏，即可直接溶解靶细胞；富含免疫球蛋白碎片受体；出现在单核细胞周围；细胞质内含有大量嗜苯胺蓝颗粒。这些特点使其具备重要的免疫监视功能，可以防止肿瘤的发生。本研究结果显示，大肠癌患者术前NK细胞活性明显低于对照组，且在大肠癌患者中随着Dukes分期的增加，NK细胞活性逐级降低，提示大肠癌发生过程中存在NK细胞功能的抑制，继而促进肿瘤的发展。这与在肺癌[2]、食管癌等肿瘤中的发现是一致的。文献推测肿瘤患者NK细胞活性的降低可能与以下因素有关：在杀伤肿瘤细胞的过程中消耗大量NK细胞；肿瘤细胞分泌某种抑制或封闭因子使NK细胞活性降低；NK细胞在血液循环中再分布等。
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IL-2是由辅助性T细胞产生的一种重要的免疫调节因子，具有促进CD8和NK细胞增殖、促进B细胞分化增殖和抗体生成、诱导生成淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)等功能。IL-2R有两种形式，一种位于细胞膜即细胞膜IL-2R(mIL-2R)，另一种出现于血液和培养上清液中即可溶性IL-2R(sIL-2R)，sIL-2R是活化的mIL-2Rα链成分，由细胞膜脱落进入血液循环中。本研究显示大肠癌患者术前外周血中sIL-2R显著升高，这与文献报道的其他肿瘤的结果一致。Theze等[3]认为，恶性肿瘤患者sIL-2R升高可能是肿瘤诱导的免疫反应所致，激活T淋巴细胞，使mIL-2R高度表达，同时释放sIL-2R进入血液循环。本研究还显示大肠癌的sIL-2R升高与肿瘤的Dukes分期有关，Dukes B、C、D期的sIL-2R水平逐渐增高，这与Murakami等[4]的报告完全符合。
现在认为sIL-2R升高可以增加与IL-2的结合，加速IL-2的廓清，使活化的T淋巴细胞恢复成休止细胞；sIL-2R与mIL-2R竞争结合IL-2，抑制T细胞增殖，同时抑制淋巴细胞浸润肿瘤组织；血清中sIL-2R增高说明大量IL-2R从膜上脱落，使活化的淋巴细胞处于衰竭状态；血清中sIL-2R水平升高常伴有CD4/CD8比值降低及NK细胞活性降低，影响B细胞功能和血中IgE浓度，导致机体免疫功能严重降低，使肿瘤逃脱宿主的免疫反应[5]。可见，本研究所揭示的大肠癌患者术前外周血中T细胞亚群、NK细胞活性及sIL-2R的变化是相互联系，相互制约的，究竟哪一个是始动因素，尚待进一步研究。总之，大肠癌患者术前细胞免疫功能明显低下，因此，在进行手术、化疗等治疗的同时，应辅以免疫增强治疗。至于围术期或化疗后以上各指标如何变化，正在研究之中。
, 百拇医药
参考文献
1，Lotze MT, Finn OJ. Recent advance in cellular immunology: implications for immunity to cancer. Immunol Today, 1990,11(6):190
2，孙灵菲，侯立新，刘德云.肺癌病人外周血T淋巴细胞亚群、NK活性和IL-2水平的研究.中国肿瘤临床与康复，1998，5(1)：8
3，Theze J, Alzari PM, Berroglio J. Interleukin 2 and its receptors: recent advances and new immunological functions. Immunol Today, 1996,17(10):481
4，Murakami S, Satomi A, Ishida K, et al. Serum soluble interleukin-2 receptor in colorectal cancer. Acta Oncologica, 1994,33(1):19
5，雷 雯，周锡庚.可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)与大肠癌.国外医学*外科学分册，1997，24(6)：322
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