LDH酶释放测定NK细胞活性的几点建议
作者：苏英 庞新民 王宗惠
单位：北京市劳动卫生职业病防治研究所，100020
关键词：
卫生毒理学杂志000127 天然杀伤(NK)细胞的活性与机体抗肿瘤能力关系密切，是机体非特异性防御机能的重要组成部分之一。NK细胞活性的测定方法，多年来一直采用同位素释放法，因此应用上受到限制。近年来乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法，以其测定方法的简便性、灵敏性、可靠性，尤其是无同位素污染，使此项检测指标得到广泛应用。目前已确定LDH酶释放法为检测免疫功能性保健品的标准方法之一。我们用LDH酶释放法对化学性毒物、药品以及保健品等进行了免疫功能测。
1 实验方法 (1)效应细胞(脾细胞)的制备：大鼠或小鼠按常规方法制备脾细胞悬液，离心去上清后，加入1.5 ml 0.89% NH4Cl 3～5 min，再加入3. 5 mlRPMⅠ1640培养液，以去除红细胞。将细胞悬液离心去掉上清，加入5 mlRPMⅠ1640培养液后，细胞悬液置培养皿中，37 ℃ 5% CO2孵箱2h去除贴壁细胞。(2)靶细胞(YAC-1):YAC-1为测定鼠NK杀伤的靶细胞，测定前1 d细胞换液培养。(3)NK细胞活性测定：靶细胞用15%牛血清RPMⅠ1640稀释为2×105细胞/ml，加至96孔圆底培养板中，每孔100 μl，再按所选定的效靶比例加入100 μl淋巴细胞。靶细胞最大释放孔，每孔加100 μl 2% NP40、100 μl靶细胞。每个效应细胞均设自然释放孔。将培养板至37℃ 5%CO2孵箱22 h后，每孔取出100 μl上清，测定LDH酶含量，并计算NK活性。(4)测定LDH酶试剂及方法详见文献，卫生研究.1987(6)：1。(5)仪器：法国SINOFI集团巴斯德研究所LP400型酶标测定仪。
, 百拇医药
2 结果
2.1 正常雄性Wistar大鼠和昆明种小鼠各6只。分别测定脾脏NK细胞对靶细胞的比率为100∶1、50∶1的杀伤率，结果为：小鼠(58.6±2.8)%、(32.9±18.7)%；大鼠(35.7±6.8)%、(19.0±5.5)%。结果提示，实验动物不同批号其NK杀伤率有差异。
2.2 应用上述方法，对同一只动物，使用不同效靶比测定时，NK细胞杀伤活性随着效靶细胞比增高而增高。
2.3 在LDH基质液显色过程中，随着时间的延长，颜色逐渐加深，但在一定的时间范围内(5～7 min)，杀伤率不受影响。
3 注意事项 (1)在用NH4Cl去除红细胞时，要控制NH4Cl的作用时间，如时间过短，红细胞溶解不完全，时间过久，将影响效应细胞杀伤活力。在夏季及气温偏高情况下，脾细胞悬液在处理过程中，应置于冰浴以保证NK细胞活性。(2)靶细胞(YC-C1)应处于良好的生长状态，以保证LDH酶自然释放在最低水平。如果LDH酶自然释放过高，将明显影响NK细胞杀伤率。靶细胞计数要准确，以避免由于靶细胞数量不足而NK杀伤率过高或靶细胞过量而杀伤率低的现象。(3)LDH酶基质液在显色测定结果时，尽可能控制显色的准确时间，由于测定时间不同以减少同批实验中而造成杀伤率的差异。在夏季实验中要控制室温，避免室内温度过高而引起显色过快，尽可能将显色时间控制在5～7 min内，尤其在同一批样品检测中，控制显色温度及时间，对减少实验误差大为有效。(4)由于小牛血清中LDH酶的含量不同，同一批实验最好采用同一批号小牛血清，以减少NK细胞杀伤率的差异。(5)建议同一批实验动物，最好同批测定NK杀伤率。
(收稿日期：1998-10-09), 百拇医药
单位：北京市劳动卫生职业病防治研究所，100020
关键词：
卫生毒理学杂志000127 天然杀伤(NK)细胞的活性与机体抗肿瘤能力关系密切，是机体非特异性防御机能的重要组成部分之一。NK细胞活性的测定方法，多年来一直采用同位素释放法，因此应用上受到限制。近年来乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法，以其测定方法的简便性、灵敏性、可靠性，尤其是无同位素污染，使此项检测指标得到广泛应用。目前已确定LDH酶释放法为检测免疫功能性保健品的标准方法之一。我们用LDH酶释放法对化学性毒物、药品以及保健品等进行了免疫功能测。
1 实验方法 (1)效应细胞(脾细胞)的制备：大鼠或小鼠按常规方法制备脾细胞悬液，离心去上清后，加入1.5 ml 0.89% NH4Cl 3～5 min，再加入3. 5 mlRPMⅠ1640培养液，以去除红细胞。将细胞悬液离心去掉上清，加入5 mlRPMⅠ1640培养液后，细胞悬液置培养皿中，37 ℃ 5% CO2孵箱2h去除贴壁细胞。(2)靶细胞(YAC-1):YAC-1为测定鼠NK杀伤的靶细胞，测定前1 d细胞换液培养。(3)NK细胞活性测定：靶细胞用15%牛血清RPMⅠ1640稀释为2×105细胞/ml，加至96孔圆底培养板中，每孔100 μl，再按所选定的效靶比例加入100 μl淋巴细胞。靶细胞最大释放孔，每孔加100 μl 2% NP40、100 μl靶细胞。每个效应细胞均设自然释放孔。将培养板至37℃ 5%CO2孵箱22 h后，每孔取出100 μl上清，测定LDH酶含量，并计算NK活性。(4)测定LDH酶试剂及方法详见文献，卫生研究.1987(6)：1。(5)仪器：法国SINOFI集团巴斯德研究所LP400型酶标测定仪。
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2 结果
2.1 正常雄性Wistar大鼠和昆明种小鼠各6只。分别测定脾脏NK细胞对靶细胞的比率为100∶1、50∶1的杀伤率，结果为：小鼠(58.6±2.8)%、(32.9±18.7)%；大鼠(35.7±6.8)%、(19.0±5.5)%。结果提示，实验动物不同批号其NK杀伤率有差异。
2.2 应用上述方法，对同一只动物，使用不同效靶比测定时，NK细胞杀伤活性随着效靶细胞比增高而增高。
2.3 在LDH基质液显色过程中，随着时间的延长，颜色逐渐加深，但在一定的时间范围内(5～7 min)，杀伤率不受影响。
3 注意事项 (1)在用NH4Cl去除红细胞时，要控制NH4Cl的作用时间，如时间过短，红细胞溶解不完全，时间过久，将影响效应细胞杀伤活力。在夏季及气温偏高情况下，脾细胞悬液在处理过程中，应置于冰浴以保证NK细胞活性。(2)靶细胞(YC-C1)应处于良好的生长状态，以保证LDH酶自然释放在最低水平。如果LDH酶自然释放过高，将明显影响NK细胞杀伤率。靶细胞计数要准确，以避免由于靶细胞数量不足而NK杀伤率过高或靶细胞过量而杀伤率低的现象。(3)LDH酶基质液在显色测定结果时，尽可能控制显色的准确时间，由于测定时间不同以减少同批实验中而造成杀伤率的差异。在夏季实验中要控制室温，避免室内温度过高而引起显色过快，尽可能将显色时间控制在5～7 min内，尤其在同一批样品检测中，控制显色温度及时间，对减少实验误差大为有效。(4)由于小牛血清中LDH酶的含量不同，同一批实验最好采用同一批号小牛血清，以减少NK细胞杀伤率的差异。(5)建议同一批实验动物，最好同批测定NK杀伤率。
(收稿日期：1998-10-09), 百拇医药