汉坦病毒H8205部分核壳蛋白基因在E.coli中的表达
作者：沈昌贤 李钟铎 杨瑞馥 祝庆余
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，北京100850
关键词：汉坦病毒；基因工程核衣壳蛋白；酶联免疫吸附试验(ELISA)
中国病毒学990204 摘 要 根据汉坦病毒H8205株NP基因的序列，设计一对引物，扩增NP前292个氨基酸多肽基因片段，克隆于表达载体pGEX-3X，与载体中26kD的谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达。SDS-PAGE显示表达产物(GST-NP)主要以包涵体形式存在。Western-blotting表明此融合蛋白有抗原性。包涵体经分离、洗涤、溶解后，Sepharose 6B层析纯化，用此融合蛋白作抗原，进行ELISA法检测临床HFRS病人标本的IgG和IgM，有很好的特异性和敏感性。有生物活性的汉坦病毒H8205 NP的体外表达成功，为汉坦病毒基因工程抗原的大量制备奠定了基础，也为汉坦病毒的临床检测和流行病学调查提供了一种廉价、安全、可靠的抗原。
, 百拇医药
Expression of the S genome segment of Hantavirus H8205 and
Application of the Expressed Polypeptide for Diagnosis of HFRS
Shen Changxian Li Zhongduo Yang Ruifu Zhu Qingyu
(Institue of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100850)
Abstract The S genome segment encoding the nucleocapsid protein (truncated) of Hantavirus H8205 was amplified by PCR and cloned into the expression vector pGEX-3X and expressed in E coli. SDS-PAGE showed that the expressed fusion protein (GST-NP) was mainly in the form of inclusion body. The expressed protein was used as diagnostic antigen in solid-phase enzyme immunoassay. The assay was used to detect IgG-and IgM-antibody in sera of HFRS patients originated from different geographic regions of China. The results revealed highly sensitive and specific. The successful expression and application of recombinant nucleocapsid protein of Hantavirus provides cheap, safe and sensitive antigen for the diagnosis of HFRS in China.
, 百拇医药
Key words Hantavirus, Recombinant nucleocapsid protein, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
汉坦病毒是负链、单股、RNA病毒，基因组由L、M、S三个片段组成，分别编码多聚酶(Polymerase)，胞膜糖蛋白(G1，G2)和核衣壳蛋白(NP)。S基因在汉坦病毒属中保守性高，其编码产物NP在病毒颗粒中含量高，免疫原性强，是用作HFRS的理想诊断抗原[1]。肾综合征出血热(HFRS)是一种病情急、病死率高的急性传染病，病人的早期确诊是治疗的关键。国外已用重组NP做抗原检测病人血清特异性抗体[2～5]，国内对S基因已分别在原核系统、杆状病毒系统和痘苗病毒中进行了表达和初步应用[6，7]。本研究对人源汉坦病毒H8205株的S基因部分片段进行表达，以便用于汉坦病毒的血清学诊断。
汉坦病毒H8205株是1982年李钟铎自我国东北一HFRS病人血清中用Vero E6细胞直接分离的毒株，同国内大部分省市的HFRS病人血清都可发生很强的免疫学反应，采用该株的NP做抗原，能较好地诊断流行于中国的汉坦病毒[8，9]。本研究根据H8205株病毒的S基因的序列，把NP前292氨基酸的片段克隆于表达载体pGEX-3X，Western-blotting和ELISA试验证明表达产物的抗原性好和特异性强，对汉坦病毒抗原性研究及用于HFRS血清学诊断具有一定的理论与实用价值。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 含汉坦病毒H8205株S基因NP编码区的克隆质粒pUC19/HTNS由本室构建，表达质粒pGEX-3X为本室保存。内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase(连接酶)、CIP(去磷酸化酶)均购自Promega公司，HFRS病人血清分别从山东、河北、陕西和浙江等地肾综合征出血热病人采集，HFRS阴性血清由解放军307医院提供，抗人IgG-McAb-HRP及抗人IgM-McAb-HRP由本室自制。
1.2 目的基因的扩增 根据汉坦病毒H8205株S基因NP编码区的序列，设计一对引物(引物序列见结果)扩增H8205株S基因前876bp片段。提取质粒pUC19/HTNS，然后PCR扩增：95℃3min，94℃ 1min，60℃1min，72℃2min，进行30个循环。最后72℃延伸10min[2，4]。
1.3 表达质粒pGEX-3X/HTNS的构建 PCR产物纯化后EcoRⅠ酶切，连接于表达质粒pGEX-3X的EcoRⅠ位点，与载体中26kD的谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达[10]。此质粒命名为pGEX-
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3X/HTNS。
1.4 融合蛋白GST-NP诱导表达 质粒pGEX-3X/HTNS转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳确定融合蛋白GST-NP的表达形式，Western-blotting测定表达产物的抗原性[3，4，10]。
1.5 融合蛋白GST-NP纯化及复性 融合蛋白GST-NP的诱导表达后，对包涵体进行提取、洗涤和溶解，Sepharose 6B凝胶层析纯化。
1.6 ELISA检测HFRS病人血清标本抗体IgG和IgM 纯化后的GST-NP蛋白适当稀释后4℃包被过夜，1%小牛血清封闭，依此加病人血清和抗人-IgG-McAb-HRP或抗人IgM-McAb-HRP，以空白对照调零，测波长495nm处OD值[1，3]。
2 结果
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2.1 汉坦病毒H8205株核衣壳蛋白基因的亚克隆
汉坦病毒H8205株NP基因序列的计算机分析，发现其抗原决定簇主要位于NP的N端(33～42)(待发表)，据此我们合成一对引物PH03-PH04，扩增H8205株NP前292个氨基酸的核苷酸片段，引物PH03：5′GCGAATTCGATGGCAACTATGGAGGAATTA 3′，引物PH04：5′GCGAATTCTGCATGCTGGCGTA 3′，5′端都含EcoRⅠ酶切位点，扩增的核苷酸片段为876bp(图1)。以克隆质粒pUC19/HTNS为模板进行PCR扩增，1.0%琼脂糖回收876bp的特异带，EcoRⅠ酶切后连接到相同酶切的表达质粒pGEX-3X的EcoRⅠ克隆位点。转化受体菌DH5α，挑选平板上生长的菌落作PCR及BamHⅠ酶切鉴定(图2)。此克隆质粒命名为pGEX-3X/HTNS，其构建过程见图3。
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图1 H8205株NP基因PCR扩增结果
Fig. 1 Amplification of the S genome segment of Hantavirus H8205 by PCR with the primers PH03-PH04
1. Amplified product 2. DNA markers: PCR marker
图2 表达质粒pGEX-3X/HTNS的酶切鉴定
Fig.2 Restriction endonuclease analysis of pGEX-3X/HTNS
1. Vector pGEX-3X 2. Negative direction pGEX-3X/HTNS/BamHI
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3. Positive direction pGEX-3X/HTNS/BamHI 4. DNA markers: λ DNA/BstEII
图3 表达质粒pGEX-3X/HTNS的构建
Fig.3 Construction of expression plasmid pGEX-3X/HTNS
2.2 融合蛋白的表达
表达质粒pGEX-3X/HTNS转化E.coli DH5α，工程菌经IPTG诱导后，取1mL表达菌体，以及含pGEX-3X载体经IPTG诱导和未经诱导的菌体各1mL，加入100μL SDS加样缓冲液煮沸3min，离心后进行SDS-PAGE。SDS-PAGE显示，工程菌在分子量58kD处出现一条新增蛋白带(GST-NP)，与预期的结果相符。经IPTG诱导的空载体菌则出现一条分子量为26kD的GST蛋白带，取菌体破碎离心后的沉淀和上清进行SDS-PAGE显示，表达蛋白以可溶性蛋白和不可溶性蛋白两种形式存在，但大部分以包涵体形式存在(图4)。
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图4 表达产物GST-NP融合蛋白SDS-PAGE电泳
Fig.4 SDS-PAGE of fusion protein GST-NP
1.DH5a-pellet 2.DH5a-supernatant 3.7.pGEX-3XHTNS-pellet 4.8.pGEX-3X/HTNS-supernatant 5.pGEX-3X-pellet 6.pGEX-3X-supernatant 10.proterin markers
2.3 Western-blotting测定表达产物的的抗原性
诱导后的工程菌菌体出现一条带，空载体菌则未出现特异带(图5)。
图5 表达产物GST-NP融合蛋白Western-blotting
, 百拇医药
Fig.5 Western-blotting of fusion protein GST-NP 1.2. GST-NP 3.4. GST
2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
以融合蛋白GST-NP和GST分别作抗原，ELISA检测HFRS、森林脑炎和正常人血清的抗体IgG。结果表明，以GST作抗原，其OD值都为阴性；以融合蛋白GST-NP作抗原，HFRS为阳性，而森林脑炎和正常人都为阴性(表1)。
表1 融合蛋白GST-NP检测HFRS、森林脑炎和正常人血清中IgG
Table 1 Detection of anti-HV IgG in the sera of HFRS, TBE patients and normal sera by ELISA with antigen GST-NP 标本 Specimen
, http://www.100md.com
出血热 HFRS
森脑 TB
对照 NC
GST-NP
GST
GST-NP
GST
GST-NP
GST
1
1.18
0.00
0.40
, 百拇医药
0.29
0.17
0.00
2
1.18
0.00
0.43
0.32
0.14
0.03
3
1.18
0.01
, http://www.100md.com
0.46
0.30
0.15
0.03
4
1.13
0.00
0.42
0.33
0.24
0.00
我们选用84份HFRS病人血清和10份正常人血清，以GST-NP做抗原进行ELISA检测抗汉坦病毒抗体IgM和IgG，同时以免疫荧光法(IFA)做对照。ELISA检出结果与IFA检出结果完全符合(表2)。 表2 ELISA检测HFRS病人血清IgM和IgG
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Table 2 Detection of anti-HV IgM and IgG in the sera of HFRS patients by ELISA with antigen GST-NP OD
IgM
IgG
HFRS
对照
NC
HFRS
对照
NC
0.0～
0
, 百拇医药
1
16
6
0.1～
13
8
18
4
0.2～
25
1
25
0
0.8～
, http://www.100md.com
5
3
1.0～
10
7
1.2～
31
15
合计 Total
84
10
84
10
, 百拇医药 阳性率
77.4%
57%
Positive rate
3 讨论
汉坦病毒的S基因在汉坦病毒属中高度保守，是体液免疫的主要识别抗原，能刺激机体产生大量的抗体，同时参与细胞介导的保护性免疫，其编码产物核衣壳蛋白是用作HFRS诊断的理想抗原[1]。
汉坦病毒H8205株属于汉滩型(HTN)汉坦病毒，其NP的亲水性结构图与标准株76-118株基本相似，但H8205NP的N端有一个高度亲水性结构中心，预测此区为H8205NP的主要抗原决定簇，主要集中于N端的33～42位氨基酸(待发表)。SEO型汉坦病毒NP的亲水性结构图与H8205的相似，文献报道用76-118NP的全段或N端部分片段可同时用来检测HTN型和SEO型汉坦病毒，故推测H8205的NP可检测流行于中国的HTN型和SEO型汉坦病毒[3]。我们的实验证实了这一点。H8205株病毒与中国的绝大部分省市的HFRS病人血清发生强烈反应，且H8205株已显示比76-118更强的抗原性[8，9]。H8205株的NP和76-118株的NP的计算机分析，也发现NP预测的抗原性H8205比76-118强。所以我们选用H8205的S基因进行体外重组，于大肠杆菌中表达NP。由于H8205株NP的主要抗原决定簇位于N端，我们选择NP的前292个氨基酸的编码序列进行体外表达，此段包含两个计算机预测的主要抗原决定簇。表达载体pGEX-3X是含26kD谷胱苷肽转移酶(GST)的融合表达载体，我们把NP基因克隆于pGEX-3X的EcoRⅠ酶切位点，与GST进行融合表达，融合蛋白质(GST-NP)的分子量为58.2kD。菌体的SDS-PAGE表明融合蛋白GST-NP为不可溶性表达，即以包涵体的形式存在。Western-blotting染色表明表达产物有抗原性。Sepharose 6B层析纯化后的融合蛋白GST-NP作抗原进行ELISA检测HFRS病人血清中的IgG和IgM，结果表现很高的特异性和敏感性，说明表达产物可用来进行HFRS的血清学诊断，未纯化的融合蛋白GST-NP也可检出特异性抗汉坦病毒抗体，虽有一定的本底，但足以用作ELISA法对HFRS的临床诊断。在我们所检测的84份送检血清中，IgM的阳性率高于IgG的阳性率，这可能与血清标本多数是在发病初期采集有关。
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我们首先把S基因的全NP编码区序列插入表达载体pBV220的PLPR启动子下游，对影响原核表达系统的诸因素如温度、诱导时间、培养基的配方、菌量等进行了一系列的优化，但未见预期多肽的表达；把全NP编码区序列BamHI酶切片段插入表达载体pET-20b(+)和pET-17xb中进行融合表达，优化各种条件后，也未见表达；后来我们进一步缩短插入片段的长度，经SDS-PAGE还是检测不到特异多肽的表达。这一系列繁琐的探索表明病毒基因在原核系统中表达，病毒基因与原核表达载体存在的匹配关系非常重要，特定的病毒基因要在与特定的原核表达载体顺反调控基因匹配的情况下才能高效表达。
有生物活性的汉坦病毒H8205NP的体外表达成功，为汉坦病毒基因工程抗原的大量制备打下了基础，为汉坦病毒的临床诊断和流行病学调查提供了一种廉价、安全、可靠的抗原。至于NP上是否有中和抗原决定簇，有不同报道，H8205株NP是否能刺激机体产生中和活性抗体有待进一步研究[11]。
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参考文献
[1] Zoller L, Yang S, Gott P et al. Use of recombinant nucleocapsid proteins of the hantaan and nephropathia epidemica serotypes of Hantaviruses as immunodiagnostic antigens. Journal of Medical Virology, 1993, 39:200～207
[2] Feldmann H, Sanchez A, Morzunov S et al. Utilization of autopsy RNA for the synthesis of the nucleocapsid antigen of a newly recognized virus associated with hantavirus pulmonary syndrome. Virus Research, 1993, 30:351～367
, 百拇医药
[3] Gott P, Zoller P, Yang S et al. Antigenicity of hantavirus nucleocapsid proteins expressed in E. coli. Virus Research, 1991,19:1～16
[4] Yang M, Rossi C, Schmaljohn CS. Expression of non-conserved regions of the S genome segments of three hantaviruses:evaluation of the exprssed polypeptides for diagnosis of haemorrhagic fever with renal sydrome. Journal of General Virology, 1993,74:1115～1124
[5] Yoshimatsu K, Arikawa J, Kariwa H. Application of a recombinant baculovirus expressing hantavirus nucleocapsid protein as a diagnostic antigen in IFA test: cross reactivities among 3 serotypes of hantavirus which causes hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS). J Vet Med Sci, 1993,55(6):1047～1050
, 百拇医药
[6] 石晓宏，杭长寿，宋干.汉坦病毒核壳蛋白(NP)在杆状病毒系统的表达及其免疫原性研究.病毒学报.1995，11(2)：124～129
[7] 梁米芳，李德新，杭长寿.汉坦病毒S基因在大肠肝菌中的表达及其初步应用.中华实验和临床病毒学杂志.1993，7(3)：225～228
[8] 李钟铎，宋光昌，李德荣等.用Vero E6细胞从病人血中分离肾综合征出血热病毒的研究.中华流行病学杂志，1983，4(4)：198～201
[9] 李钟铎，宋光昌，蒋豫图.用免疫荧光法对我国流行性出血热患者的血清学研究.中华预防医学杂志.1982，16(2)：48～52
[10] Vapalahti O, Kallio-Kokko H, Salonen Eeva-Marjatta et al. Cloning and sequencing of puumala virus sotkamo strain S and M RNA segments: evidence for strain variation in hantaviruses and expression of the nucleocapsid protein. Journal of General Virology, 1992,73:829～838
[11] Yoshimatsu K, Yoo YC, Yoshida R et al. Protective immunity of hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studied using baculovirus-expressed proteins. Arch Virol, 1993,130:365～376
收稿日期： 1998-03-24，修回日期：1998-08-03, http://www.100md.com
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，北京100850
关键词：汉坦病毒；基因工程核衣壳蛋白；酶联免疫吸附试验(ELISA)
中国病毒学990204 摘 要 根据汉坦病毒H8205株NP基因的序列，设计一对引物，扩增NP前292个氨基酸多肽基因片段，克隆于表达载体pGEX-3X，与载体中26kD的谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达。SDS-PAGE显示表达产物(GST-NP)主要以包涵体形式存在。Western-blotting表明此融合蛋白有抗原性。包涵体经分离、洗涤、溶解后，Sepharose 6B层析纯化，用此融合蛋白作抗原，进行ELISA法检测临床HFRS病人标本的IgG和IgM，有很好的特异性和敏感性。有生物活性的汉坦病毒H8205 NP的体外表达成功，为汉坦病毒基因工程抗原的大量制备奠定了基础，也为汉坦病毒的临床检测和流行病学调查提供了一种廉价、安全、可靠的抗原。
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Expression of the S genome segment of Hantavirus H8205 and
Application of the Expressed Polypeptide for Diagnosis of HFRS
Shen Changxian Li Zhongduo Yang Ruifu Zhu Qingyu
(Institue of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100850)
Abstract The S genome segment encoding the nucleocapsid protein (truncated) of Hantavirus H8205 was amplified by PCR and cloned into the expression vector pGEX-3X and expressed in E coli. SDS-PAGE showed that the expressed fusion protein (GST-NP) was mainly in the form of inclusion body. The expressed protein was used as diagnostic antigen in solid-phase enzyme immunoassay. The assay was used to detect IgG-and IgM-antibody in sera of HFRS patients originated from different geographic regions of China. The results revealed highly sensitive and specific. The successful expression and application of recombinant nucleocapsid protein of Hantavirus provides cheap, safe and sensitive antigen for the diagnosis of HFRS in China.
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Key words Hantavirus, Recombinant nucleocapsid protein, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
汉坦病毒是负链、单股、RNA病毒，基因组由L、M、S三个片段组成，分别编码多聚酶(Polymerase)，胞膜糖蛋白(G1，G2)和核衣壳蛋白(NP)。S基因在汉坦病毒属中保守性高，其编码产物NP在病毒颗粒中含量高，免疫原性强，是用作HFRS的理想诊断抗原[1]。肾综合征出血热(HFRS)是一种病情急、病死率高的急性传染病，病人的早期确诊是治疗的关键。国外已用重组NP做抗原检测病人血清特异性抗体[2～5]，国内对S基因已分别在原核系统、杆状病毒系统和痘苗病毒中进行了表达和初步应用[6，7]。本研究对人源汉坦病毒H8205株的S基因部分片段进行表达，以便用于汉坦病毒的血清学诊断。
汉坦病毒H8205株是1982年李钟铎自我国东北一HFRS病人血清中用Vero E6细胞直接分离的毒株，同国内大部分省市的HFRS病人血清都可发生很强的免疫学反应，采用该株的NP做抗原，能较好地诊断流行于中国的汉坦病毒[8，9]。本研究根据H8205株病毒的S基因的序列，把NP前292氨基酸的片段克隆于表达载体pGEX-3X，Western-blotting和ELISA试验证明表达产物的抗原性好和特异性强，对汉坦病毒抗原性研究及用于HFRS血清学诊断具有一定的理论与实用价值。
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1 材料与方法
1.1 材料 含汉坦病毒H8205株S基因NP编码区的克隆质粒pUC19/HTNS由本室构建，表达质粒pGEX-3X为本室保存。内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase(连接酶)、CIP(去磷酸化酶)均购自Promega公司，HFRS病人血清分别从山东、河北、陕西和浙江等地肾综合征出血热病人采集，HFRS阴性血清由解放军307医院提供，抗人IgG-McAb-HRP及抗人IgM-McAb-HRP由本室自制。
1.2 目的基因的扩增 根据汉坦病毒H8205株S基因NP编码区的序列，设计一对引物(引物序列见结果)扩增H8205株S基因前876bp片段。提取质粒pUC19/HTNS，然后PCR扩增：95℃3min，94℃ 1min，60℃1min，72℃2min，进行30个循环。最后72℃延伸10min[2，4]。
1.3 表达质粒pGEX-3X/HTNS的构建 PCR产物纯化后EcoRⅠ酶切，连接于表达质粒pGEX-3X的EcoRⅠ位点，与载体中26kD的谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达[10]。此质粒命名为pGEX-
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3X/HTNS。
1.4 融合蛋白GST-NP诱导表达 质粒pGEX-3X/HTNS转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳确定融合蛋白GST-NP的表达形式，Western-blotting测定表达产物的抗原性[3，4，10]。
1.5 融合蛋白GST-NP纯化及复性 融合蛋白GST-NP的诱导表达后，对包涵体进行提取、洗涤和溶解，Sepharose 6B凝胶层析纯化。
1.6 ELISA检测HFRS病人血清标本抗体IgG和IgM 纯化后的GST-NP蛋白适当稀释后4℃包被过夜，1%小牛血清封闭，依此加病人血清和抗人-IgG-McAb-HRP或抗人IgM-McAb-HRP，以空白对照调零，测波长495nm处OD值[1，3]。
2 结果
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2.1 汉坦病毒H8205株核衣壳蛋白基因的亚克隆
汉坦病毒H8205株NP基因序列的计算机分析，发现其抗原决定簇主要位于NP的N端(33～42)(待发表)，据此我们合成一对引物PH03-PH04，扩增H8205株NP前292个氨基酸的核苷酸片段，引物PH03：5′GCGAATTCGATGGCAACTATGGAGGAATTA 3′，引物PH04：5′GCGAATTCTGCATGCTGGCGTA 3′，5′端都含EcoRⅠ酶切位点，扩增的核苷酸片段为876bp(图1)。以克隆质粒pUC19/HTNS为模板进行PCR扩增，1.0%琼脂糖回收876bp的特异带，EcoRⅠ酶切后连接到相同酶切的表达质粒pGEX-3X的EcoRⅠ克隆位点。转化受体菌DH5α，挑选平板上生长的菌落作PCR及BamHⅠ酶切鉴定(图2)。此克隆质粒命名为pGEX-3X/HTNS，其构建过程见图3。
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图1 H8205株NP基因PCR扩增结果
Fig. 1 Amplification of the S genome segment of Hantavirus H8205 by PCR with the primers PH03-PH04
1. Amplified product 2. DNA markers: PCR marker
图2 表达质粒pGEX-3X/HTNS的酶切鉴定
Fig.2 Restriction endonuclease analysis of pGEX-3X/HTNS
1. Vector pGEX-3X 2. Negative direction pGEX-3X/HTNS/BamHI
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3. Positive direction pGEX-3X/HTNS/BamHI 4. DNA markers: λ DNA/BstEII
图3 表达质粒pGEX-3X/HTNS的构建
Fig.3 Construction of expression plasmid pGEX-3X/HTNS
2.2 融合蛋白的表达
表达质粒pGEX-3X/HTNS转化E.coli DH5α，工程菌经IPTG诱导后，取1mL表达菌体，以及含pGEX-3X载体经IPTG诱导和未经诱导的菌体各1mL，加入100μL SDS加样缓冲液煮沸3min，离心后进行SDS-PAGE。SDS-PAGE显示，工程菌在分子量58kD处出现一条新增蛋白带(GST-NP)，与预期的结果相符。经IPTG诱导的空载体菌则出现一条分子量为26kD的GST蛋白带，取菌体破碎离心后的沉淀和上清进行SDS-PAGE显示，表达蛋白以可溶性蛋白和不可溶性蛋白两种形式存在，但大部分以包涵体形式存在(图4)。
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图4 表达产物GST-NP融合蛋白SDS-PAGE电泳
Fig.4 SDS-PAGE of fusion protein GST-NP
1.DH5a-pellet 2.DH5a-supernatant 3.7.pGEX-3XHTNS-pellet 4.8.pGEX-3X/HTNS-supernatant 5.pGEX-3X-pellet 6.pGEX-3X-supernatant 10.proterin markers
2.3 Western-blotting测定表达产物的的抗原性
诱导后的工程菌菌体出现一条带，空载体菌则未出现特异带(图5)。
图5 表达产物GST-NP融合蛋白Western-blotting
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Fig.5 Western-blotting of fusion protein GST-NP 1.2. GST-NP 3.4. GST
2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
以融合蛋白GST-NP和GST分别作抗原，ELISA检测HFRS、森林脑炎和正常人血清的抗体IgG。结果表明，以GST作抗原，其OD值都为阴性；以融合蛋白GST-NP作抗原，HFRS为阳性，而森林脑炎和正常人都为阴性(表1)。
表1 融合蛋白GST-NP检测HFRS、森林脑炎和正常人血清中IgG
Table 1 Detection of anti-HV IgG in the sera of HFRS, TBE patients and normal sera by ELISA with antigen GST-NP 标本 Specimen
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出血热 HFRS
森脑 TB
对照 NC
GST-NP
GST
GST-NP
GST
GST-NP
GST
1
1.18
0.00
0.40
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0.29
0.17
0.00
2
1.18
0.00
0.43
0.32
0.14
0.03
3
1.18
0.01
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0.46
0.30
0.15
0.03
4
1.13
0.00
0.42
0.33
0.24
0.00
我们选用84份HFRS病人血清和10份正常人血清，以GST-NP做抗原进行ELISA检测抗汉坦病毒抗体IgM和IgG，同时以免疫荧光法(IFA)做对照。ELISA检出结果与IFA检出结果完全符合(表2)。 表2 ELISA检测HFRS病人血清IgM和IgG
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Table 2 Detection of anti-HV IgM and IgG in the sera of HFRS patients by ELISA with antigen GST-NP OD
IgM
IgG
HFRS
对照
NC
HFRS
对照
NC
0.0～
0
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1
16
6
0.1～
13
8
18
4
0.2～
25
1
25
0
0.8～
, http://www.100md.com
5
3
1.0～
10
7
1.2～
31
15
合计 Total
84
10
84
10
, 百拇医药 阳性率
77.4%
57%
Positive rate
3 讨论
汉坦病毒的S基因在汉坦病毒属中高度保守，是体液免疫的主要识别抗原，能刺激机体产生大量的抗体，同时参与细胞介导的保护性免疫，其编码产物核衣壳蛋白是用作HFRS诊断的理想抗原[1]。
汉坦病毒H8205株属于汉滩型(HTN)汉坦病毒，其NP的亲水性结构图与标准株76-118株基本相似，但H8205NP的N端有一个高度亲水性结构中心，预测此区为H8205NP的主要抗原决定簇，主要集中于N端的33～42位氨基酸(待发表)。SEO型汉坦病毒NP的亲水性结构图与H8205的相似，文献报道用76-118NP的全段或N端部分片段可同时用来检测HTN型和SEO型汉坦病毒，故推测H8205的NP可检测流行于中国的HTN型和SEO型汉坦病毒[3]。我们的实验证实了这一点。H8205株病毒与中国的绝大部分省市的HFRS病人血清发生强烈反应，且H8205株已显示比76-118更强的抗原性[8，9]。H8205株的NP和76-118株的NP的计算机分析，也发现NP预测的抗原性H8205比76-118强。所以我们选用H8205的S基因进行体外重组，于大肠杆菌中表达NP。由于H8205株NP的主要抗原决定簇位于N端，我们选择NP的前292个氨基酸的编码序列进行体外表达，此段包含两个计算机预测的主要抗原决定簇。表达载体pGEX-3X是含26kD谷胱苷肽转移酶(GST)的融合表达载体，我们把NP基因克隆于pGEX-3X的EcoRⅠ酶切位点，与GST进行融合表达，融合蛋白质(GST-NP)的分子量为58.2kD。菌体的SDS-PAGE表明融合蛋白GST-NP为不可溶性表达，即以包涵体的形式存在。Western-blotting染色表明表达产物有抗原性。Sepharose 6B层析纯化后的融合蛋白GST-NP作抗原进行ELISA检测HFRS病人血清中的IgG和IgM，结果表现很高的特异性和敏感性，说明表达产物可用来进行HFRS的血清学诊断，未纯化的融合蛋白GST-NP也可检出特异性抗汉坦病毒抗体，虽有一定的本底，但足以用作ELISA法对HFRS的临床诊断。在我们所检测的84份送检血清中，IgM的阳性率高于IgG的阳性率，这可能与血清标本多数是在发病初期采集有关。
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我们首先把S基因的全NP编码区序列插入表达载体pBV220的PLPR启动子下游，对影响原核表达系统的诸因素如温度、诱导时间、培养基的配方、菌量等进行了一系列的优化，但未见预期多肽的表达；把全NP编码区序列BamHI酶切片段插入表达载体pET-20b(+)和pET-17xb中进行融合表达，优化各种条件后，也未见表达；后来我们进一步缩短插入片段的长度，经SDS-PAGE还是检测不到特异多肽的表达。这一系列繁琐的探索表明病毒基因在原核系统中表达，病毒基因与原核表达载体存在的匹配关系非常重要，特定的病毒基因要在与特定的原核表达载体顺反调控基因匹配的情况下才能高效表达。
有生物活性的汉坦病毒H8205NP的体外表达成功，为汉坦病毒基因工程抗原的大量制备打下了基础，为汉坦病毒的临床诊断和流行病学调查提供了一种廉价、安全、可靠的抗原。至于NP上是否有中和抗原决定簇，有不同报道，H8205株NP是否能刺激机体产生中和活性抗体有待进一步研究[11]。
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参考文献
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[8] 李钟铎，宋光昌，李德荣等.用Vero E6细胞从病人血中分离肾综合征出血热病毒的研究.中华流行病学杂志，1983，4(4)：198～201
[9] 李钟铎，宋光昌，蒋豫图.用免疫荧光法对我国流行性出血热患者的血清学研究.中华预防医学杂志.1982，16(2)：48～52
[10] Vapalahti O, Kallio-Kokko H, Salonen Eeva-Marjatta et al. Cloning and sequencing of puumala virus sotkamo strain S and M RNA segments: evidence for strain variation in hantaviruses and expression of the nucleocapsid protein. Journal of General Virology, 1992,73:829～838
[11] Yoshimatsu K, Yoo YC, Yoshida R et al. Protective immunity of hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studied using baculovirus-expressed proteins. Arch Virol, 1993,130:365～376
收稿日期： 1998-03-24，修回日期：1998-08-03, http://www.100md.com