脑活素诱导大鼠小脑颗粒神经元死亡的研究
作者：李晓瑜 欧阳颖 林穗珍 万翔 颜光美 邱鹏新
单位：李晓瑜 欧阳颖 林穗珍(510080 广州, 中山医科大学附属第一医院儿科)；翔 颜光美 邱鹏新(药理教研室)
关键词：
中华医学杂志000208 脑活素是一种由猪大脑中提取的多种氨基酸和低分子肽的混合物水溶液，不含蛋白质。在我国临床上广泛用于治疗脑血管疾病、新生儿缺血缺氧性脑病和儿童脑瘫等。随着其临床应用的日趋广泛，近年来不良反应的报道亦日趋增加[1]。不少文献报道临床使用有效，也有人认为无效。我们曾报道，胆红素可选择性地诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡[2]，实验中我们试图应用脑活素保护胆红素的神经毒性，结果发现脑活素本身具有很强的神经毒性。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.材料：(1)主要试剂： 脑活素(cere.)为奥地利依比威大药厂产品。谷氨酸、MK-801购于美国RBI公司； 神经细胞基础培养液(BME)购于美国GIBGO公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、胆红素(Bilirubin, BR)、阿糖胞苷(Ara-c)等药物购于美国Sigma公司。胞二磷胆碱(广州市桥制药厂)、单唾液酸四己糖神经糖甙脂(GM-1)，巴西TRB PHARMA药厂产品。(2)动物来源： 新生SD大鼠出生后8 d，体重12～16 g，雌雄不拘，中山医科大学实验动物中心提供。
2.方法：(1)大鼠小脑颗粒神经元的培养：参照文献[2]，取第8 d SD大鼠的小脑，经过0.05%胰酶消化后，加入0.05%胰酶抑制剂和50 μg/ml DNA酶以终止消化，离心后将细胞加入含有10%胎牛血清和25 mmol/L KCl的BME中，以1.8×106 cell/ml接种于用多聚赖氨酸包备的24孔板的培养皿中。细胞生长在含5% CO2、37℃的培养箱中。24 h后加入10 μmol/L Ara-C以抑制胶质细胞的生长,使神经元的纯化率为95%以上。(2)神经元存活率的测定：参照文献[3，4]，取培养后8 d或给药24 h后的神经元，在培养液中加入 MTT(250 μg/ml)，置5% CO2、37℃的培养箱中4～6 h，去掉培养液，加入二甲基亚砜溶解后，酶标仪(Elx 800 universal microplate reader，USA)上测定570 nm和630 nm双波的吸光度。酶标仪测得的吸光度(A值)与细胞存活率呈正相关(r2=0.992)。
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3.统计学处理：测量数据为
±s， 显著性检验用ANOVA随后SNK-q检验或配对t检验(spss 7.0 统计软件包)。
二、结果
1.脑活素剂量和时间依赖性地诱导大鼠小脑颗粒神经元死亡：用培养8 d的小脑颗粒神经元，分别加入不同浓度的脑活素(0、0.5、1、5、10、20、、40 μl/ml)，24 h后测定神经元的存活率分别为100%、92.32%、90.40%、90.22%、79.59%、74.22%、27.93%。处理过的神经元均剂量依赖性地出现细胞肿胀、胞体膨大、神经突触网络逐渐断裂和消失、细胞数减少。同样条件加入10 μl/ml脑活素，在4、12、24、48 h测定细胞存活率，分别为91.48%、83.49%、70.35%及70.19%。
2.兴奋性氨基酸受体拮抗剂MK-801对脑活素毒性的影响：用上述神经元 加入兴奋性氨基酸受体拮抗剂MK-801(1 μmol/L)预处理10 min后，再加入不同剂量的脑活素(0～500 μl/ml)及兴奋性氨基酸递质谷氨酸(0～500 μmol /L)，发现谷氨酸+MK-801组细胞存活率明显高于单独谷氨酸组，2组配对比较差异具有显著意义；而脑活素在<50 μl/ml浓度时， MK-801+脑活素组细胞存活率高于脑活素组(P<0.05)，脑活素浓度≥50 μl/ml时，2组比较差异无显著意义(图1)。
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图1 MK-801对脑活素神经毒性的影响
3.胞二磷胆碱、GM-1对小脑颗粒神经元的影响：用上述神经元，分别加入不同浓度的胞二磷胆碱、GM-1，观察其对小脑颗粒神经元的影响。结果胞二磷胆碱在0、0.5、1、5、10 mg/ml浓度下，GM-1在0、0.1、1、5、10、20 μg/ml浓度时，细胞存活率与正常对照组比较，差异均无显著意义(P>0.05)。
4.脑活素对胆红素神经毒性的影响：用同样的方法在细胞中加入胆红素3 μmol/L后，再加入20 μl/ml的脑活素，发现脑活素+胆红素组与胆红素组、单独脑活素组比较，细胞存活率均明显降低，差异具有显著意义(P<0.01，图2)。
各组8只，分别与脑活素、BR组比较*P<0.001
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图2 脑活素对胆红素神经毒性的影响
二、讨论
脑活素(又称脑蛋白水解物)，内含约85%的所有必需
游离氨基酸和约15%由氨基酸结合组成的低分子肽，可通过血脑屏障。目前认为具有改善脑代谢，活化神经细胞，促进记忆，改善思维障碍的作用。我们在实验中试图以脑活素保护胆红素神经毒性，结果发现脑活素除可加重BR毒性外，并呈剂量时间依赖性地诱导大鼠小脑颗粒细胞死亡。邹清雁等[5]观察乳猪脑提取物和脑活素对培养中胎鼠大脑皮质神经元的影响，发现脑活素对皮质神经元促突起生长及支持存活作用不理想。王春艳等[4]将脑活素用于脑胶质瘤体外细胞系培养，结果细胞增殖受抑制，形态退变；随脑活素剂量的增大，细胞存活率降低，上述发现与本实验结果相似。新近俄国学者报道脑活素可加重大鼠脑缺血缺氧[6]。
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高娃等[7]用高效液相色谱法测定脑活素中氨基酸含量，证实其含有16种必需及非必需氨基酸，其中谷氨基酸含量最高为3.47 mg/ml，而小脑颗粒细胞含丰富的兴奋性氨基酸受体，因此推测脑活素的神经毒性是否是通过兴奋性氨基酸所介导呢？在上述细胞模型上用NMDA型受体拮抗剂MK-801预处理后，加入脑活素，在<50 μl/ml剂量下MK-801有明显保护作用，而≥50 μl/ml剂量下 ，MK-801对脑活素的毒性无保护作用，说明脑活素的神经毒性部分是通过兴奋氨基酸介导的。由于大剂量下MK-801不能保护脑活素的毒性，说明还存在其他途径的可能。为排除加药对神经细胞生存的影响，同时观察了广泛用于临床的另2种营养神经、促进中枢神经系统功能恢复的药物胞二磷胆碱和GM-1对小脑颗粒神经元的影响，发现在0～10 mg/ml及0～20 μg/ml浓度下胞二磷胆碱和GM-1对小脑颗粒元无明显毒性作用。吴永佩等[8]认为，脑活素的临床疗效尚未得到国际医学界公认，美国、日本、英国药典均未收载此药。即使是脑活素的生产国奥地利有关此药的研究报道也甚少。除俄国少数国家外，国外应用很少，我国则应用广泛。临床应用中报道的副作用有诱发癫痫和神经精神症状等[1]，是否与脑活素所含有的兴奋性氨基酸有关有待进一步证明。鉴于脑活素对原代培养大鼠小脑颗粒神经元的毒性作用(对大鼠皮质神经元亦具有同样的毒性作用，资料未显示)，而新生儿中枢神经系统发育不完善，尤其是小脑的发育成熟主要在生后，因此对新生儿应用脑活素应慎重。另一值得考虑的问题是当婴儿脑病使用脑活素，此后留下的后遗症，究竟是疾病本身导致的呢？还是使用脑活素的副作用呢？
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基金项目：国家自然科学基金资助项目 ( 39770782); 广东省自然科学基金资助项目 (970052)
通信作者：林穗珍,510080 广州市,中山医科大学附属第一医院儿科
参考文献
[1]张恒，陈保东. 脑活素的不良反应 .中国药事, 1998，12：247.
[2]林穗珍,李晓瑜,颜光美. 胆红素诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的研究. 中华医学杂志，1999,79:125-128.
[3]Sladowski D,Steer S J.,Clothier RH,et al. An improved MTT assay. J Immunol Methods, 1993,157:203-207.
, 百拇医药
[4]王春艳，王广秀. 脑活素对体外培养脑胶质瘤细胞的作用. 天津医科大学学报, 1997, 3：22-23.
[5]邹清雁, 孔祥平, 张宜俊, 等. 乳猪脑提取物各脑活素对培养中胎鼠大脑皮质神经元的影响.天津医药, 1994，22：661-664.
[6]Gannushkina IV，Antelava AL，Baranchikova MV. Effect of the nootropic agent cerebrolysin in cerebral ischemia in rats with varying behavioral reactions in the open field test. Patol Fiziol Eksp Ter , 1998,2: 3-8.
[7]高娃, 孔祥螺, 韩增华,等. 高压液相色谱法测定脑活素中氨基酸含量. 生物技术, 1995,6：36-37.
[8]吴永佩, 许冀陕, 刘渊, 等. 脑活素临床疗效评价. 中国新药杂志, 1995, 4：35-38.
收稿日期:1999-06-02, 百拇医药
单位：李晓瑜 欧阳颖 林穗珍(510080 广州, 中山医科大学附属第一医院儿科)；翔 颜光美 邱鹏新(药理教研室)
关键词：
中华医学杂志000208 脑活素是一种由猪大脑中提取的多种氨基酸和低分子肽的混合物水溶液，不含蛋白质。在我国临床上广泛用于治疗脑血管疾病、新生儿缺血缺氧性脑病和儿童脑瘫等。随着其临床应用的日趋广泛，近年来不良反应的报道亦日趋增加[1]。不少文献报道临床使用有效，也有人认为无效。我们曾报道，胆红素可选择性地诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡[2]，实验中我们试图应用脑活素保护胆红素的神经毒性，结果发现脑活素本身具有很强的神经毒性。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.材料：(1)主要试剂： 脑活素(cere.)为奥地利依比威大药厂产品。谷氨酸、MK-801购于美国RBI公司； 神经细胞基础培养液(BME)购于美国GIBGO公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、胆红素(Bilirubin, BR)、阿糖胞苷(Ara-c)等药物购于美国Sigma公司。胞二磷胆碱(广州市桥制药厂)、单唾液酸四己糖神经糖甙脂(GM-1)，巴西TRB PHARMA药厂产品。(2)动物来源： 新生SD大鼠出生后8 d，体重12～16 g，雌雄不拘，中山医科大学实验动物中心提供。
2.方法：(1)大鼠小脑颗粒神经元的培养：参照文献[2]，取第8 d SD大鼠的小脑，经过0.05%胰酶消化后，加入0.05%胰酶抑制剂和50 μg/ml DNA酶以终止消化，离心后将细胞加入含有10%胎牛血清和25 mmol/L KCl的BME中，以1.8×106 cell/ml接种于用多聚赖氨酸包备的24孔板的培养皿中。细胞生长在含5% CO2、37℃的培养箱中。24 h后加入10 μmol/L Ara-C以抑制胶质细胞的生长,使神经元的纯化率为95%以上。(2)神经元存活率的测定：参照文献[3，4]，取培养后8 d或给药24 h后的神经元，在培养液中加入 MTT(250 μg/ml)，置5% CO2、37℃的培养箱中4～6 h，去掉培养液，加入二甲基亚砜溶解后，酶标仪(Elx 800 universal microplate reader，USA)上测定570 nm和630 nm双波的吸光度。酶标仪测得的吸光度(A值)与细胞存活率呈正相关(r2=0.992)。
, http://www.100md.com
3.统计学处理：测量数据为
±s， 显著性检验用ANOVA随后SNK-q检验或配对t检验(spss 7.0 统计软件包)。二、结果
1.脑活素剂量和时间依赖性地诱导大鼠小脑颗粒神经元死亡：用培养8 d的小脑颗粒神经元，分别加入不同浓度的脑活素(0、0.5、1、5、10、20、、40 μl/ml)，24 h后测定神经元的存活率分别为100%、92.32%、90.40%、90.22%、79.59%、74.22%、27.93%。处理过的神经元均剂量依赖性地出现细胞肿胀、胞体膨大、神经突触网络逐渐断裂和消失、细胞数减少。同样条件加入10 μl/ml脑活素，在4、12、24、48 h测定细胞存活率，分别为91.48%、83.49%、70.35%及70.19%。
2.兴奋性氨基酸受体拮抗剂MK-801对脑活素毒性的影响：用上述神经元 加入兴奋性氨基酸受体拮抗剂MK-801(1 μmol/L)预处理10 min后，再加入不同剂量的脑活素(0～500 μl/ml)及兴奋性氨基酸递质谷氨酸(0～500 μmol /L)，发现谷氨酸+MK-801组细胞存活率明显高于单独谷氨酸组，2组配对比较差异具有显著意义；而脑活素在<50 μl/ml浓度时， MK-801+脑活素组细胞存活率高于脑活素组(P<0.05)，脑活素浓度≥50 μl/ml时，2组比较差异无显著意义(图1)。
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图1 MK-801对脑活素神经毒性的影响
3.胞二磷胆碱、GM-1对小脑颗粒神经元的影响：用上述神经元，分别加入不同浓度的胞二磷胆碱、GM-1，观察其对小脑颗粒神经元的影响。结果胞二磷胆碱在0、0.5、1、5、10 mg/ml浓度下，GM-1在0、0.1、1、5、10、20 μg/ml浓度时，细胞存活率与正常对照组比较，差异均无显著意义(P>0.05)。
4.脑活素对胆红素神经毒性的影响：用同样的方法在细胞中加入胆红素3 μmol/L后，再加入20 μl/ml的脑活素，发现脑活素+胆红素组与胆红素组、单独脑活素组比较，细胞存活率均明显降低，差异具有显著意义(P<0.01，图2)。
各组8只，分别与脑活素、BR组比较*P<0.001
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图2 脑活素对胆红素神经毒性的影响
二、讨论
脑活素(又称脑蛋白水解物)，内含约85%的所有必需
游离氨基酸和约15%由氨基酸结合组成的低分子肽，可通过血脑屏障。目前认为具有改善脑代谢，活化神经细胞，促进记忆，改善思维障碍的作用。我们在实验中试图以脑活素保护胆红素神经毒性，结果发现脑活素除可加重BR毒性外，并呈剂量时间依赖性地诱导大鼠小脑颗粒细胞死亡。邹清雁等[5]观察乳猪脑提取物和脑活素对培养中胎鼠大脑皮质神经元的影响，发现脑活素对皮质神经元促突起生长及支持存活作用不理想。王春艳等[4]将脑活素用于脑胶质瘤体外细胞系培养，结果细胞增殖受抑制，形态退变；随脑活素剂量的增大，细胞存活率降低，上述发现与本实验结果相似。新近俄国学者报道脑活素可加重大鼠脑缺血缺氧[6]。
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高娃等[7]用高效液相色谱法测定脑活素中氨基酸含量，证实其含有16种必需及非必需氨基酸，其中谷氨基酸含量最高为3.47 mg/ml，而小脑颗粒细胞含丰富的兴奋性氨基酸受体，因此推测脑活素的神经毒性是否是通过兴奋性氨基酸所介导呢？在上述细胞模型上用NMDA型受体拮抗剂MK-801预处理后，加入脑活素，在<50 μl/ml剂量下MK-801有明显保护作用，而≥50 μl/ml剂量下 ，MK-801对脑活素的毒性无保护作用，说明脑活素的神经毒性部分是通过兴奋氨基酸介导的。由于大剂量下MK-801不能保护脑活素的毒性，说明还存在其他途径的可能。为排除加药对神经细胞生存的影响，同时观察了广泛用于临床的另2种营养神经、促进中枢神经系统功能恢复的药物胞二磷胆碱和GM-1对小脑颗粒神经元的影响，发现在0～10 mg/ml及0～20 μg/ml浓度下胞二磷胆碱和GM-1对小脑颗粒元无明显毒性作用。吴永佩等[8]认为，脑活素的临床疗效尚未得到国际医学界公认，美国、日本、英国药典均未收载此药。即使是脑活素的生产国奥地利有关此药的研究报道也甚少。除俄国少数国家外，国外应用很少，我国则应用广泛。临床应用中报道的副作用有诱发癫痫和神经精神症状等[1]，是否与脑活素所含有的兴奋性氨基酸有关有待进一步证明。鉴于脑活素对原代培养大鼠小脑颗粒神经元的毒性作用(对大鼠皮质神经元亦具有同样的毒性作用，资料未显示)，而新生儿中枢神经系统发育不完善，尤其是小脑的发育成熟主要在生后，因此对新生儿应用脑活素应慎重。另一值得考虑的问题是当婴儿脑病使用脑活素，此后留下的后遗症，究竟是疾病本身导致的呢？还是使用脑活素的副作用呢？
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目 ( 39770782); 广东省自然科学基金资助项目 (970052)
通信作者：林穗珍,510080 广州市,中山医科大学附属第一医院儿科
参考文献
[1]张恒，陈保东. 脑活素的不良反应 .中国药事, 1998，12：247.
[2]林穗珍,李晓瑜,颜光美. 胆红素诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的研究. 中华医学杂志，1999,79:125-128.
[3]Sladowski D,Steer S J.,Clothier RH,et al. An improved MTT assay. J Immunol Methods, 1993,157:203-207.
, 百拇医药
[4]王春艳，王广秀. 脑活素对体外培养脑胶质瘤细胞的作用. 天津医科大学学报, 1997, 3：22-23.
[5]邹清雁, 孔祥平, 张宜俊, 等. 乳猪脑提取物各脑活素对培养中胎鼠大脑皮质神经元的影响.天津医药, 1994，22：661-664.
[6]Gannushkina IV，Antelava AL，Baranchikova MV. Effect of the nootropic agent cerebrolysin in cerebral ischemia in rats with varying behavioral reactions in the open field test. Patol Fiziol Eksp Ter , 1998,2: 3-8.
[7]高娃, 孔祥螺, 韩增华,等. 高压液相色谱法测定脑活素中氨基酸含量. 生物技术, 1995,6：36-37.
[8]吴永佩, 许冀陕, 刘渊, 等. 脑活素临床疗效评价. 中国新药杂志, 1995, 4：35-38.
收稿日期:1999-06-02, 百拇医药