超速离心法分离泡相胆汁
作者：马保金 蔡端 莫汉庆 张延龄
单位：上海医科大学附属华山医院外科教研组(200040)
关键词：
肝胆胰外科杂志9903 胆汁中的磷酯泡是胆固醇的主要携带者，在一般情况下，泡处于稳定状态，一旦存有影响其稳定性的因素，则单层泡趋于集聚成复层泡，进而胆固醇结晶成核乃至成石[1]。上述因素可能是泡相胆汁中的蛋白质[2]，后者仅占胆汁蛋白的2%[4]。本实验的目的在于通过超速离心法大量分离泡相胆汁，以获得足够的泡相蛋白并对其进行研究。
1 材料和方法
1.1 胆汁标本 胆囊结石或胆总管结石患者，无其他疾病史，行胆囊切除和胆总管切开引流术，结石经傅氏法判定为胆固醇结石(胆固醇含量>70%)。术后第9天清晨取T管胆汁200ml(胆汁常规和培养均阴性)置于无菌瓶，加入胆汁保存液(含0.05%氯霉素、3mM NaN3、1mM Leupeptin-蛋白酶抑制剂和5mmol/L EDTA—依地酸)，置于4℃备用。
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1.2 泡相胆汁的分离 150ml胆汁以10000rpm高速离心10分钟(RPR20-20，HIMAC Centrifuge,HITACH)，去沉淀物，1.2μm滤纸过滤，加入13%W/V Metrizamide(Sigma Chemical Co)用于形成密度梯度，10℃下以45000rpm超速离心(VTi50 BECKMAN)3.5小时，离心后可见胆汁分为三层，上层为泡相胆汁[4]，分别以针吸法收集。
1.3 电镜检测 三种收集液各取一滴负染处理后电镜下检测(JEM-1200Ex)，24小时后再次电镜观察。48小时后在偏光显微镜下观察样本。
1.4 三种收集液行SDS-PAGE蛋白电泳观测其蛋白分布及纯度。以上步骤均在48小时内完成。
2 结果
2.1 超速离心后，离心管中胆汁呈三层，上层半透明液为泡相胆汁(16ml)，中层半透明液20ml。三种成份电镜检测结果如下：上层泡相胆汁，可见胆汁泡分布较为均匀、丰富，大小为50～200nm，中层半透明液每个电镜视野仅见1～2个400nm左右的磷酯泡。底层胆汁在电镜下(仔细寻找10分钟)很难找到磷酯泡。24小时后再次电镜观察泡相胆汁可见集聚的泡和复层泡，48小时后偏显微镜下可见胆固醇结晶形成。
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2.2 三种收集液行SDS-PAGE蛋白电泳，第2、3、4条带分别显示泡相胆汁、中层半透明胆汁及剩余胆汁的蛋白，可见泡相胆汁中蛋白含量很少，但纯度相对较高。
3 讨论
本文采用Metrizamide密度梯度超速离心法，分离所得的泡相胆汁量相对较多，泡的含量丰富，泡相蛋白纯度也相对较高、但要符合如下要求：(1)胆汁中加入适当保存液，以免胆汁细菌污染，氧化还原反应和蛋白酶分解等；(2)泡相胆汁的分离应尽可能在短时间内完成，以免发生胆汁生化反应等。
本实验已提示在泡相胆汁中存在一种促成核因子(可能是一种蛋白质)。第一次电镜结果示泡相胆汁中泡的大小较为均匀，24小时后即可见到泡的集聚和复层泡形成，48小时后偏光显微镜下可见到胆固醇结晶，而其余样本未见此现象，我们对此将做进一步研究。
通过本实验结果，我们认为单纯Meitrizamide密度梯度超速离心法是一种简便、有效的泡相胆汁分离法，可广泛在实验中应用。
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4 参考文献
1 Schriever CE,Jungst D.Association between cholesterol-phospholipid vesicles and cholesterol crystals in human gallbladder bile.Hapotology,1989,9∶541～546
2 Pattinson NR,Willis KE.Effect of phospholipase C on cholesterol solubillization in model bile.Gastroenterology,1991,101∶1339～1344
3 Pattinson,NR.solubilzation of cholesterol in human bile.FEBS Lett,1985,181∶339～342
4 Juan Francisco MIQUEL,Attilio RIGOTTI,Eduardo ROJAS,et al.Isolation and purification of human bilianry vesicles with potent cholesterol-nucleation-promoting activity.Clinical Science,1992,82∶175～180
收稿：1998-11-27，修回：1999-04-10, 百拇医药
单位：上海医科大学附属华山医院外科教研组(200040)
关键词：
肝胆胰外科杂志9903 胆汁中的磷酯泡是胆固醇的主要携带者，在一般情况下，泡处于稳定状态，一旦存有影响其稳定性的因素，则单层泡趋于集聚成复层泡，进而胆固醇结晶成核乃至成石[1]。上述因素可能是泡相胆汁中的蛋白质[2]，后者仅占胆汁蛋白的2%[4]。本实验的目的在于通过超速离心法大量分离泡相胆汁，以获得足够的泡相蛋白并对其进行研究。
1 材料和方法
1.1 胆汁标本 胆囊结石或胆总管结石患者，无其他疾病史，行胆囊切除和胆总管切开引流术，结石经傅氏法判定为胆固醇结石(胆固醇含量>70%)。术后第9天清晨取T管胆汁200ml(胆汁常规和培养均阴性)置于无菌瓶，加入胆汁保存液(含0.05%氯霉素、3mM NaN3、1mM Leupeptin-蛋白酶抑制剂和5mmol/L EDTA—依地酸)，置于4℃备用。
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1.2 泡相胆汁的分离 150ml胆汁以10000rpm高速离心10分钟(RPR20-20，HIMAC Centrifuge,HITACH)，去沉淀物，1.2μm滤纸过滤，加入13%W/V Metrizamide(Sigma Chemical Co)用于形成密度梯度，10℃下以45000rpm超速离心(VTi50 BECKMAN)3.5小时，离心后可见胆汁分为三层，上层为泡相胆汁[4]，分别以针吸法收集。
1.3 电镜检测 三种收集液各取一滴负染处理后电镜下检测(JEM-1200Ex)，24小时后再次电镜观察。48小时后在偏光显微镜下观察样本。
1.4 三种收集液行SDS-PAGE蛋白电泳观测其蛋白分布及纯度。以上步骤均在48小时内完成。
2 结果
2.1 超速离心后，离心管中胆汁呈三层，上层半透明液为泡相胆汁(16ml)，中层半透明液20ml。三种成份电镜检测结果如下：上层泡相胆汁，可见胆汁泡分布较为均匀、丰富，大小为50～200nm，中层半透明液每个电镜视野仅见1～2个400nm左右的磷酯泡。底层胆汁在电镜下(仔细寻找10分钟)很难找到磷酯泡。24小时后再次电镜观察泡相胆汁可见集聚的泡和复层泡，48小时后偏显微镜下可见胆固醇结晶形成。
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2.2 三种收集液行SDS-PAGE蛋白电泳，第2、3、4条带分别显示泡相胆汁、中层半透明胆汁及剩余胆汁的蛋白，可见泡相胆汁中蛋白含量很少，但纯度相对较高。
3 讨论
本文采用Metrizamide密度梯度超速离心法，分离所得的泡相胆汁量相对较多，泡的含量丰富，泡相蛋白纯度也相对较高、但要符合如下要求：(1)胆汁中加入适当保存液，以免胆汁细菌污染，氧化还原反应和蛋白酶分解等；(2)泡相胆汁的分离应尽可能在短时间内完成，以免发生胆汁生化反应等。
本实验已提示在泡相胆汁中存在一种促成核因子(可能是一种蛋白质)。第一次电镜结果示泡相胆汁中泡的大小较为均匀，24小时后即可见到泡的集聚和复层泡形成，48小时后偏光显微镜下可见到胆固醇结晶，而其余样本未见此现象，我们对此将做进一步研究。
通过本实验结果，我们认为单纯Meitrizamide密度梯度超速离心法是一种简便、有效的泡相胆汁分离法，可广泛在实验中应用。
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4 参考文献
1 Schriever CE,Jungst D.Association between cholesterol-phospholipid vesicles and cholesterol crystals in human gallbladder bile.Hapotology,1989,9∶541～546
2 Pattinson NR,Willis KE.Effect of phospholipase C on cholesterol solubillization in model bile.Gastroenterology,1991,101∶1339～1344
3 Pattinson,NR.solubilzation of cholesterol in human bile.FEBS Lett,1985,181∶339～342
4 Juan Francisco MIQUEL,Attilio RIGOTTI,Eduardo ROJAS,et al.Isolation and purification of human bilianry vesicles with potent cholesterol-nucleation-promoting activity.Clinical Science,1992,82∶175～180
收稿：1998-11-27，修回：1999-04-10, 百拇医药