穿孔素和颗粒酶B基因对大鼠肝移植急性排斥免疫抑制疗效判断的价值
作者：张绍庚 吴孟超 姚和祥 陈汉 杨甲梅
单位：350001 福州，南京军区福州总医院(张绍庚、姚和祥)，第二军医大学东方肝胆外科医院(吴孟超、陈汉、杨甲梅)
关键词：肝移植；免疫抑制；基因表达调控，酶学
中华医学杂志981124 【摘要】 目的 探讨细胞毒T淋巴细胞两功能基因穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达对大鼠肝移植急性排斥免疫抑制治疗的疗效判断价值。方法 在建立金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥反应模型基础上，应用环孢素A和脾切除对该模型进行免疫抑制治疗，用逆转录聚合酶链反应检测穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达，并以病理检查为对照。结果 环孢素和脾切除联合能抑制免疫排斥，动物生存时间显著延长，平均达37.1天，术后3周移植肝结构完整，仅汇管区有少量炎细胞浸润，并能抑制穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达。结论 穿孔素和颗粒酶B基因具有判断免疫抑制疗效的作用。
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The effect of immunosuppression on the expression of perforin and granzyme B mRNA in hamster to rat liver transplantation Zhang Shaogeng, Wu Mengchao, Yao Hexiang, et al. Fuzhou military general Hospital. Fuzhou 350001
【Abstract 】 Objective To explore the variation on the expression of perforin and granzyme B gene mRNA to judge the effect of immunosuppression in acute rejection of liver transplantation. Methods The expression of perforin and granzyme B gene mRNA was examined by RT-PCR in hamster to rat liver grafts under the immunosuppression of cyclosporine and splenectomy. Histological findings were studied comparatively. Results Cyclosporine and splenectomy could obviously suppress the rejection of liver grafts. The survival time of animals was significantly prolonged (37.1 days). The architecture of hepatic lobule was preserved. There was slight round cell infiltration in the portal tracts and no expression of mRNA of perforin and granzyme B genes could been seen in three weeks after transplantation. Conclusion Perforin and granzyme B genes are of value in judging the effect of immunosuppression.
, 百拇医药
【Key words 】 Liver transplantation perforin Immunosuppression Gene expression regulation, enzymologic
(Natl Med J China, 1998, 78:859-861)
免疫排斥反应是肝移植主要障碍之一，探索特异性的免疫抑制治疗疗效判断指标是十分重要而又急需解决的研究课题。本研究在建立金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥模型的基础上，应用环孢素和脾切除免疫抑制，探讨穿孔素和颗粒酶B基因对肝移植免疫抑制疗效的判断作用。
材料和方法
一、材料
1.实验动物：供体为雌性金黄地鼠，150～180 g；受体为雄性Wistar大鼠，230～260 g。
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2.免疫抑制剂：环孢素A(Cyclosporine A, CsA瑞士产)每天30 mg/kg，移植当天开始，每12小时肌注1次。
二、方法
1.分组：共分4组，每组6～8只大鼠。A组为对照组(8只)，不进行免疫抑制治疗；B组为CsA治疗组(6只每天30 mg/kg)；C组为脾切除组(6只)；D组为CsA加脾切除(7只)。
2.肝移植：各组原位肝移植均采用三袖套法[1，2]。同时施行双重结扎脾蒂，切除脾。术后每日肌注氨苄青霉素50 mg。
3.组织的采集及保存：A、B及C 3组肝移植术后5天活检少量移植肝；而D组于术后5天、14天、21天按同样方法3次活检少量移植肝组织，置液氮中速冻，-80℃保存备用。
4.病理检查：术后排斥或处死时取肝置10%中性甲醛中固定，石蜡包埋，HE染色，光镜观察。
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5.RNA制备：采用Qiagen试剂盒抽提，简述如下：将肝组织切碎，置于含β巯基乙醇的裂解缓冲液350 ml中碾碎裂解5分钟；再置于微量组织碾磨器8 000 g离心3分钟后与等量70%乙醇吹打混匀；进RNA抽提柱，8 000 g离心15秒，加冲洗缓冲液RW1 700 μl离心，再两次加冲洗RPE 500 μl离心；最后用二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理水离心洗脱，收集RNA。用分光光度计在260 nm测定RNA浓度，用260与280之比测定RNA纯度，所有RNA纯度均在1.7以上。阳性对照采用大鼠脾细胞，在植物血凝素(10 μg/ml)、刀豆素A(10 μg/ml)和白细胞介素2(20 μ/ml)刺激培养18小时，收集脾细胞后抽提RNA，而阴性对照则采用正常大鼠肝组织。RNA置-80℃保存备用。
6.cDNA合成：采用GIBCOBRL试剂盒，将2 μgRNA稀释11 μl,加入低核苷酸1 μl(0.5 μg)，70℃水浴10分钟，冰水冷却1分钟以上，加入10×PCR缓冲液2 μl，25 mmol氯化镁2 μl，10 mmol dNTP1 μl，0.1 mmol/L DTT2 μl，短暂离心混匀，42℃水浴5分钟，加入200 μl逆转录酶(Super ScripTⅡRT)，混匀，42℃水浴50分钟，70℃水浴15分钟，冰水冷却，再加RNA酶(RNase H)，37℃水浴20分钟，cDNA -20℃保存备用。
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7.PCR：穿孔素、颗粒酶B和β-actinDNA引物序列根据大鼠穿孔素和β-actin基因外显子DNA序列合成(附表)，2 μl的cDNA溶液加入10 mmol去氧核苷1 μl，25 mmol氯化镁3 μl，引物正反链各2 μl，10×缓冲液5 μl，聚合酶(Taq)1 μl，双蒸水34 μl，共50 μl，石蜡油封顶后进行温度周期循环，最初94℃3分钟，其后95℃15秒，60℃20秒，72℃30秒，共30循环，最后70℃10分钟终止，产物用琼脂糖电泳溴化乙锭染色分析，相应部分出现阳性染色带表明mRNA的存在。
附表 PCR引物序列 基因
引物
碱基对(bp)
β-actin
正链
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5′GCCATCCTGCGTCGTGACCTG3′
599
反链
5′CATTTGCGGTGCACGATGGAG3′
穿孔素
正链
5′TGCTACACTGCCACTCGGTCA3′
566
反链
5′GCATGCTCTGTGGAGCTGTTA3′
颗粒酶B
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正链
5′GACTTTGTGCTGACTGCTGCTCAC3′
465
反链
5′TTGTCCATAGGAGACGATGCCCGC3′
结果
1.生存时间：A、B、C 3组生存时间均在6～9天内，各组间差异无显著意义(P>0.05)。而D组生存时间则显著延长，平均可达37±10天，与其它3组相比，差异均有非常显著意义(P<0.01)。
2.病理学检查：急性排斥对照组(A组)术后7天可见大量的单个核细胞浸润，广泛的肝细胞坏死和出血，CsA治疗组(B组)可见移植肝内浸润细胞数量显著减少，但仍存在严重的肝细胞坏死和间隙出血；而脾切除组(C组)能显著减轻肝细胞坏死和间隙出血，但移植肝内大量的细胞浸润并无改善；联合应用组(D组)既能显著减少细胞浸润又能有效抑制肝细胞坏死和出血，肝组织结构完整，仅在汇管区有少量炎细胞浸润[3，4]。
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3.穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达：在急性排斥对照组术后5天，各受体穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达呈明显阳性；CsA治疗者术后5天仅有一受体(1/6)表达该两基因，而且强度较弱；脾切除治疗者术后5天有5个受体(5/6)明显表达该两基因；而联合治疗者肝移植术后5、14天各受体均不表达穿孔素和颗粒酶B基因，术后21天也基本不表达，仅一受体(1/7)表达穿孔素和颗粒酶B基因。其表达电泳见附图。
附图 肝移植免疫抑制治疗后移植肝中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达
讨论
金黄地鼠至大鼠原位肝移植是协调性异种肝移植，呈急性排斥反应，存在细胞和体液双重免疫排斥机制[5，6]。脾切除能有效抑制抗体的形成，显著减轻肝细胞坏死和出血，但不能改善大量单个核细胞浸润；而CsA能有力地抑制细胞免疫，移植肝内浸润细胞数量显著减少，但仍有广泛肝细胞坏死和出血，两者单独均不能延长动物的生存时间；只有两者联合治疗，既抑制体液免疫又抑制细胞免疫，移植肝组织结构完整，动物生存时间显著延长，可达37.1天。结果优于国外同类报道[3]。
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免疫抑制治疗对器官移植急性排斥中细胞毒T细胞(CTL)穿孔素作用途径的影响是近年研究热点之一，Mueller等[7]应用原位杂交在研究环孢素A对小鼠移植心脏中浸润细胞颗粒酶A和穿孔素基因表达的影响时发现，未经治疗的移植物中穿孔素和颗粒酶A阳性细胞非常明显，10天内移植物被完全排斥，而经CsA治疗者移植物中该两基因表达阳性细胞显著减少，并长期处于极低的表达水平，移植物存活时间显著延长，进一步研究发现，CsA抑制CD+8细胞浸润并不明显，但该两基因表达阳性细胞治疗后显著降低，提示CsA主要是抑制CTL的激活，而不是减少浸润细胞的数量。Rapamycin则完全阻断了移植物中浸润细胞的颗粒酶B基因的表达，也明显延长了移植物的存活时间[8]。
我们的结果显示，在金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥反应模型中，CsA加脾切除治疗能有效抑制排斥反应，术后3周内肝组织结构完整，显著延长动物生存时间，并无穿孔素和颗粒酶B基因的表达，说明该两基因mRNA的表达有可能成为判断免疫抑制疗效的可靠指标，但仍需进一步临床试验验证。
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本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 张绍庚，方石岗，吴孟超，等.改良三袖套法大鼠原位肝移植.中华显微外科杂志，1997，20：54-55.
2 张绍庚，谈景旺，杨甲梅，等.三袖套法金黄地鼠至大鼠原位肝移植模型建立.第二军医大学学报，1998，19：89-90.
3 张绍庚，王义，陈汉，等.金黄地鼠至大鼠肝移植急性排斥的抑制作用.中华实验外科杂志，1997，14：351-352.
4 Valdivia LA, Moden M, Gotoh M, et al. Prolonged survival of hamster-to-rat liver xenografts using plenectomy and cyclosporine administration. Transplant, 1987, 44:759.
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5 Langer A, Valdivia LA, Murase N, et al. Humoral and cellular immunopathology of hepatic and cardiac hamster-to-rat xenograft rejection. Am J Pathol, 1993, 143:85-98.
6 张绍庚，杨甲梅，吴孟超，等.细胞免疫在金黄地鼠至大鼠原位肝移植排斥反应中的作用.中华实验外科杂志，1996，13(增刊)：7-8.
7 Mueller C, Shao Y, Altermatt HJ, et al. The effect of cyclosporine treatment on the expression of genes encoding granzyme A and perforin in the infiltrate of mouse heart transplants. Transplantation, 1993, 55:139-145.
8 Wieder KJ, Hancock WW, Schmidbauer G, et al. Rapamycin treatment depresses intragraft expression of RC/MIP-2, granzyme B and IFN-gamma in rat recipients of cardiac allografts. J Immunol, 1993, 151:1158-1166.
(收稿：1997-12-23 修回：1998-08-12), 百拇医药
单位：350001 福州，南京军区福州总医院(张绍庚、姚和祥)，第二军医大学东方肝胆外科医院(吴孟超、陈汉、杨甲梅)
关键词：肝移植；免疫抑制；基因表达调控，酶学
中华医学杂志981124 【摘要】 目的 探讨细胞毒T淋巴细胞两功能基因穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达对大鼠肝移植急性排斥免疫抑制治疗的疗效判断价值。方法 在建立金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥反应模型基础上，应用环孢素A和脾切除对该模型进行免疫抑制治疗，用逆转录聚合酶链反应检测穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达，并以病理检查为对照。结果 环孢素和脾切除联合能抑制免疫排斥，动物生存时间显著延长，平均达37.1天，术后3周移植肝结构完整，仅汇管区有少量炎细胞浸润，并能抑制穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达。结论 穿孔素和颗粒酶B基因具有判断免疫抑制疗效的作用。
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The effect of immunosuppression on the expression of perforin and granzyme B mRNA in hamster to rat liver transplantation Zhang Shaogeng, Wu Mengchao, Yao Hexiang, et al. Fuzhou military general Hospital. Fuzhou 350001
【Abstract 】 Objective To explore the variation on the expression of perforin and granzyme B gene mRNA to judge the effect of immunosuppression in acute rejection of liver transplantation. Methods The expression of perforin and granzyme B gene mRNA was examined by RT-PCR in hamster to rat liver grafts under the immunosuppression of cyclosporine and splenectomy. Histological findings were studied comparatively. Results Cyclosporine and splenectomy could obviously suppress the rejection of liver grafts. The survival time of animals was significantly prolonged (37.1 days). The architecture of hepatic lobule was preserved. There was slight round cell infiltration in the portal tracts and no expression of mRNA of perforin and granzyme B genes could been seen in three weeks after transplantation. Conclusion Perforin and granzyme B genes are of value in judging the effect of immunosuppression.
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【Key words 】 Liver transplantation perforin Immunosuppression Gene expression regulation, enzymologic
(Natl Med J China, 1998, 78:859-861)
免疫排斥反应是肝移植主要障碍之一，探索特异性的免疫抑制治疗疗效判断指标是十分重要而又急需解决的研究课题。本研究在建立金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥模型的基础上，应用环孢素和脾切除免疫抑制，探讨穿孔素和颗粒酶B基因对肝移植免疫抑制疗效的判断作用。
材料和方法
一、材料
1.实验动物：供体为雌性金黄地鼠，150～180 g；受体为雄性Wistar大鼠，230～260 g。
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2.免疫抑制剂：环孢素A(Cyclosporine A, CsA瑞士产)每天30 mg/kg，移植当天开始，每12小时肌注1次。
二、方法
1.分组：共分4组，每组6～8只大鼠。A组为对照组(8只)，不进行免疫抑制治疗；B组为CsA治疗组(6只每天30 mg/kg)；C组为脾切除组(6只)；D组为CsA加脾切除(7只)。
2.肝移植：各组原位肝移植均采用三袖套法[1，2]。同时施行双重结扎脾蒂，切除脾。术后每日肌注氨苄青霉素50 mg。
3.组织的采集及保存：A、B及C 3组肝移植术后5天活检少量移植肝；而D组于术后5天、14天、21天按同样方法3次活检少量移植肝组织，置液氮中速冻，-80℃保存备用。
4.病理检查：术后排斥或处死时取肝置10%中性甲醛中固定，石蜡包埋，HE染色，光镜观察。
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5.RNA制备：采用Qiagen试剂盒抽提，简述如下：将肝组织切碎，置于含β巯基乙醇的裂解缓冲液350 ml中碾碎裂解5分钟；再置于微量组织碾磨器8 000 g离心3分钟后与等量70%乙醇吹打混匀；进RNA抽提柱，8 000 g离心15秒，加冲洗缓冲液RW1 700 μl离心，再两次加冲洗RPE 500 μl离心；最后用二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理水离心洗脱，收集RNA。用分光光度计在260 nm测定RNA浓度，用260与280之比测定RNA纯度，所有RNA纯度均在1.7以上。阳性对照采用大鼠脾细胞，在植物血凝素(10 μg/ml)、刀豆素A(10 μg/ml)和白细胞介素2(20 μ/ml)刺激培养18小时，收集脾细胞后抽提RNA，而阴性对照则采用正常大鼠肝组织。RNA置-80℃保存备用。
6.cDNA合成：采用GIBCOBRL试剂盒，将2 μgRNA稀释11 μl,加入低核苷酸1 μl(0.5 μg)，70℃水浴10分钟，冰水冷却1分钟以上，加入10×PCR缓冲液2 μl，25 mmol氯化镁2 μl，10 mmol dNTP1 μl，0.1 mmol/L DTT2 μl，短暂离心混匀，42℃水浴5分钟，加入200 μl逆转录酶(Super ScripTⅡRT)，混匀，42℃水浴50分钟，70℃水浴15分钟，冰水冷却，再加RNA酶(RNase H)，37℃水浴20分钟，cDNA -20℃保存备用。
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7.PCR：穿孔素、颗粒酶B和β-actinDNA引物序列根据大鼠穿孔素和β-actin基因外显子DNA序列合成(附表)，2 μl的cDNA溶液加入10 mmol去氧核苷1 μl，25 mmol氯化镁3 μl，引物正反链各2 μl，10×缓冲液5 μl，聚合酶(Taq)1 μl，双蒸水34 μl，共50 μl，石蜡油封顶后进行温度周期循环，最初94℃3分钟，其后95℃15秒，60℃20秒，72℃30秒，共30循环，最后70℃10分钟终止，产物用琼脂糖电泳溴化乙锭染色分析，相应部分出现阳性染色带表明mRNA的存在。
附表 PCR引物序列 基因
引物
碱基对(bp)
β-actin
正链
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5′GCCATCCTGCGTCGTGACCTG3′
599
反链
5′CATTTGCGGTGCACGATGGAG3′
穿孔素
正链
5′TGCTACACTGCCACTCGGTCA3′
566
反链
5′GCATGCTCTGTGGAGCTGTTA3′
颗粒酶B
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5′GACTTTGTGCTGACTGCTGCTCAC3′
465
反链
5′TTGTCCATAGGAGACGATGCCCGC3′
结果
1.生存时间：A、B、C 3组生存时间均在6～9天内，各组间差异无显著意义(P>0.05)。而D组生存时间则显著延长，平均可达37±10天，与其它3组相比，差异均有非常显著意义(P<0.01)。
2.病理学检查：急性排斥对照组(A组)术后7天可见大量的单个核细胞浸润，广泛的肝细胞坏死和出血，CsA治疗组(B组)可见移植肝内浸润细胞数量显著减少，但仍存在严重的肝细胞坏死和间隙出血；而脾切除组(C组)能显著减轻肝细胞坏死和间隙出血，但移植肝内大量的细胞浸润并无改善；联合应用组(D组)既能显著减少细胞浸润又能有效抑制肝细胞坏死和出血，肝组织结构完整，仅在汇管区有少量炎细胞浸润[3，4]。
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3.穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达：在急性排斥对照组术后5天，各受体穿孔素和颗粒酶B基因mRNA表达呈明显阳性；CsA治疗者术后5天仅有一受体(1/6)表达该两基因，而且强度较弱；脾切除治疗者术后5天有5个受体(5/6)明显表达该两基因；而联合治疗者肝移植术后5、14天各受体均不表达穿孔素和颗粒酶B基因，术后21天也基本不表达，仅一受体(1/7)表达穿孔素和颗粒酶B基因。其表达电泳见附图。
附图 肝移植免疫抑制治疗后移植肝中穿孔素和颗粒酶B基因mRNA的表达
讨论
金黄地鼠至大鼠原位肝移植是协调性异种肝移植，呈急性排斥反应，存在细胞和体液双重免疫排斥机制[5，6]。脾切除能有效抑制抗体的形成，显著减轻肝细胞坏死和出血，但不能改善大量单个核细胞浸润；而CsA能有力地抑制细胞免疫，移植肝内浸润细胞数量显著减少，但仍有广泛肝细胞坏死和出血，两者单独均不能延长动物的生存时间；只有两者联合治疗，既抑制体液免疫又抑制细胞免疫，移植肝组织结构完整，动物生存时间显著延长，可达37.1天。结果优于国外同类报道[3]。
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免疫抑制治疗对器官移植急性排斥中细胞毒T细胞(CTL)穿孔素作用途径的影响是近年研究热点之一，Mueller等[7]应用原位杂交在研究环孢素A对小鼠移植心脏中浸润细胞颗粒酶A和穿孔素基因表达的影响时发现，未经治疗的移植物中穿孔素和颗粒酶A阳性细胞非常明显，10天内移植物被完全排斥，而经CsA治疗者移植物中该两基因表达阳性细胞显著减少，并长期处于极低的表达水平，移植物存活时间显著延长，进一步研究发现，CsA抑制CD+8细胞浸润并不明显，但该两基因表达阳性细胞治疗后显著降低，提示CsA主要是抑制CTL的激活，而不是减少浸润细胞的数量。Rapamycin则完全阻断了移植物中浸润细胞的颗粒酶B基因的表达，也明显延长了移植物的存活时间[8]。
我们的结果显示，在金黄地鼠至大鼠原位肝移植急性排斥反应模型中，CsA加脾切除治疗能有效抑制排斥反应，术后3周内肝组织结构完整，显著延长动物生存时间，并无穿孔素和颗粒酶B基因的表达，说明该两基因mRNA的表达有可能成为判断免疫抑制疗效的可靠指标，但仍需进一步临床试验验证。
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本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 张绍庚，方石岗，吴孟超，等.改良三袖套法大鼠原位肝移植.中华显微外科杂志，1997，20：54-55.
2 张绍庚，谈景旺，杨甲梅，等.三袖套法金黄地鼠至大鼠原位肝移植模型建立.第二军医大学学报，1998，19：89-90.
3 张绍庚，王义，陈汉，等.金黄地鼠至大鼠肝移植急性排斥的抑制作用.中华实验外科杂志，1997，14：351-352.
4 Valdivia LA, Moden M, Gotoh M, et al. Prolonged survival of hamster-to-rat liver xenografts using plenectomy and cyclosporine administration. Transplant, 1987, 44:759.
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5 Langer A, Valdivia LA, Murase N, et al. Humoral and cellular immunopathology of hepatic and cardiac hamster-to-rat xenograft rejection. Am J Pathol, 1993, 143:85-98.
6 张绍庚，杨甲梅，吴孟超，等.细胞免疫在金黄地鼠至大鼠原位肝移植排斥反应中的作用.中华实验外科杂志，1996，13(增刊)：7-8.
7 Mueller C, Shao Y, Altermatt HJ, et al. The effect of cyclosporine treatment on the expression of genes encoding granzyme A and perforin in the infiltrate of mouse heart transplants. Transplantation, 1993, 55:139-145.
8 Wieder KJ, Hancock WW, Schmidbauer G, et al. Rapamycin treatment depresses intragraft expression of RC/MIP-2, granzyme B and IFN-gamma in rat recipients of cardiac allografts. J Immunol, 1993, 151:1158-1166.
(收稿：1997-12-23 修回：1998-08-12), 百拇医药