人牙乳头细胞内Smad4表达的免疫组化研究
作者：何文喜 牛忠英 陈健 包柳郁 王景杰
单位：何文喜(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；牛忠英(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；陈健(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；包柳郁(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；王景杰(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：人牙乳头细胞；Smad4；转化生长因子-β1；重组人 骨形成蛋白-2
牙体牙髓牙周病学杂志000211 【摘 要】 目的：观察转化生长因子-β超家族的 细胞内信号转导分子Smad4在人牙乳头细胞内的表达及信号转位过程。从细胞内信号转 导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法：原代 培养人牙乳头细胞，用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和 骨形成蛋白-2(recombinant human bone morphogenntic protein,rhBMP-2)刺激培养的细胞 ，免疫组化观察。结果：TGF-β1和rhBMP-2实验组胞核内均可见S mad4蛋白强阳性表达，但胞浆 内未见Smad4蛋白阳性表达；对照组胞浆内可见Smad4蛋白阳性表达，核内未见阳性 表达。结论：观察到Smad4在人牙乳头细胞内的表达并参与信号 转位过程，提示Smad4可能同时参与TGF-βs和BMPs的细胞内信号转导过程。TGF-βs和B MPs 在牙齿发育中信号传递可能都是通过Smad4的信号传导途径实现的。
, http://www.100md.com
【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)02-0084-03
Immunohistochemical localization of Smad4 in human dental papillae c ells
HE Wen-xi，NIU Zhong-ying, CHEN Jian，et al
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of Sm ad4 in human dental papillae cells (HDPC)and the transduction process to e xplo re the molecular mechanism of odontoblast differentiation during tooth developme n t process in signalling transduction level. METHODS: Immun ohistochemical staining of HDPC derived from primary culture on stimulation from TGF-β1 or rhBMP-2. RESULTS: The expression of protein o f Smad4 was localized in cytoplasm of HDPC in control group. The expre ssion of protein of Smad4 was localized in nucleus of HDPC on sti mula tio n from TGF-β1 and rhBMP-2. CONCLUSION: The expression and translocation accumulation of the protein of Smad4 in HDPC were detected .It suggests Smad4 maybe participate in TGF-βs and BMPs signaling pathway.T he signalling transduction of TGF-βs and BMPs in tooth development maybe media ted by Smad4 signal pathway.
, 百拇医药
【Key words】 Human dental papillae cell;Smad4;transf orming growth factor-β1;bone morphogenetic protein-2
在牙胚发育过程中，上皮-间充质之间的相互作用调控其形态的发 生和细胞的分化。其相互作用是通过釉上皮分泌的信号分子通过基底膜 活化后诱导间充质细胞 凝聚，凝聚的间充质细胞表达并分泌细胞因子和基质蛋白，细胞和细胞、细胞和基质蛋白之 间的相互作用导致成牙本质细胞分化完成。文献[1～5]表明，TGF-βs和BMPs 是主要的信号分子，参与早期的牙胚发育、成牙本质细胞分化和第三期牙本质形成。一般认 为，TGF-βs和BMPs以自分泌和旁分泌的方式调控自身在牙齿发育和牙本质形成中的作用。 但TGF-βs和BMPs如何调控自身在细胞内的表达和分泌，以及如何调控胞外基质的分泌？目 前 仍不清楚。Smad4是转导TGF-βs和BMPs细胞内信号的共同中介分子，本实验观察体外培 养的人牙乳头细胞内是否存在Smad4的表达，以及Smad4是否参与TGF-βs和BMP s细胞内信号传导，探讨成牙本质细胞分化和第三期牙本质形成机理。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 人牙乳头细胞原代培养和实验分组
选择合法引产的4～5月龄胎儿，取其牙乳头，组织块法[6]原代培养人牙乳头细胞 。 培养液为含150ml/L胎牛血清(FCS)的DMEM培养液(Gibco,USA)。取生长良好的第5代牙 乳头 细胞，用2.5g/L胰酶消化后，以2×104/L细胞浓度接种到24孔板中，将处理好的盖玻片预 先 放到24孔板中，待细胞基本爬满盖玻片后，换用含100pmol/L TGF-β1(Promega)和10nmol /L rhBMP-2(本校生化教研室刘新平教授惠赠)的2ml/L FCS的DMEM培养液培养，对照组继 续用 2ml/L FCS的DMEM培养液培养，不加任何刺激。培养1h后取出盖玻片，40g/L多聚甲醛 固定30 min ,备用。
1.2 免疫组化染色
, 百拇医药
采用SABC法(武汉博士德公司提供试剂盒)，常规免疫组化染色。
2 结果
TGF-β1实验组，可见人牙乳头细胞胞核Smad4强阳性，胞浆内弱阳性(图1)；rhBMP-2 实验组，亦可见细胞胞核Smad4强阳性表达，胞浆内未见Smad4表达(图2)；对照 组，牙乳头细胞胞浆内可见Smad4 阳性表达，胞核内未见表达(图3)。
图1 TGF-β1组：人牙乳头细胞胞核Smad4强阳性表达，胞浆弱阳性表达 (SABC法，40 ×)
图2 rhBMP-2组：人牙乳头细胞核Smad4强阳性表达，胞浆弱阳性表达 (SABC法，40 ×)
, 百拇医药
图3 对照组：人牙乳头细胞胞浆Smad4强阳性表达，胞核未见表达 (SABC法，40×)
3 讨论
TGF-βs和BMPs在牙齿胚胎发育过程中上皮-间充质相互作用所发生的一系列信号传导过 程中发挥重要的调控作用。近来研究[5]发现，在鼠牙胚发育早期，未来牙板形成 处 增厚的原口腔上皮中先出现BMP4的表达，随后出现BMP2的表达，BMP2的表达一直持续到帽状 期，之后BMP2的表达转入牙乳头间充质中。认为BMP2很可能是决定牙胚间充质细胞发育方向 的上皮-间充质相互作用中的信号分子。TGF-βs则在牙板上皮和牙胚发育的各期均见表达 [2]，表明TGF-βs在牙齿发育中发挥重要的作用。TGF-βs和BMPs成功地诱导体外 培养的人牙乳头细胞和牙髓细胞分化[1,3]，表明TGF-βs和BMPs在成牙本质细胞 分化和第三期牙本质形成中发挥重要的作用。
, 百拇医药
TGF-βs和BMPs的作用都是通过细胞膜表面特异的受体介导发生的，起信号转导作用的是T GF-βs和BMPs各自特异的I型和Ⅱ型受体,Ⅰ、Ⅱ型受体均是单次跨膜的丝/ 苏氨酸蛋白 激酶受体。两者结构类似，但 Ⅰ型受体的胞浆区蛋白激酶结构域N端与细胞膜之间，存在一 个富含甘氨酸和丝氨酸的结构域，称为GS 结构域。TGF-β或BMPs首先与细胞膜表面Ⅱ型受 体结合，形成二元复合物。Ⅰ型受体不能单独与TGF-β结合，当TGF-β与Ⅱ型受体形成二元 复合物后，Ⅰ型受体识别这个二元复合物，并与之结合形成三元复合物，在此过程中Ⅱ型受 体的丝/苏氨酸激酶使Ⅰ型受体GS结构域的丝/苏氨酸磷酸化，使Ⅰ型受体活化。活化的 Ⅰ型受体则使其下游细胞内途径限制型Smads(Pathway-restricted Smads,R-Sm ads)信号 转导分子磷酸化，TGF-β为Smad2和Smad3，BMPs为Smad1和Smad5，磷酸化 的R-Smad与共同中 介型Smad(Common-mediator Smads,C-Smads)即Smad4结合形成异源寡聚合 物，转位至核内聚集，作用于靶基因，引起其表达[7]。
, 百拇医药
Smad4在转化生长因子β超家族各个细胞因子的信号转导途径中都是必不可少的，是其 家族细 胞因子信号转导的共同中介分子；而且在脊椎动物细胞内它的作用是唯一的。关于Smad 4在 牙乳头细胞的表达及其作用的报道甚少，研究Smad4在牙乳头细胞的表达和作用，有利 于进一步研究牙乳头细胞的分化机理。
本实验观察到Smad4在人牙乳头细胞胞浆内的表达。同时观察到Smad4转位聚集于核 内，这 种现象只发生在TGF-β1和rhBMP-2实验组，对照组未见Smad4的转位聚集。此现象证实 Smad4 能传导TGF-βs和BMPs信号，并将信号转导至核内，同时也证实Smad4的作用不具有特异 性， 表明Smad4可能是TGF-βs和BMPs信号传导共同中介分子。这与Hahn等[8]报道 一致。
本实验发现牙乳头细胞内存在Smad4基因表达，而且Smad4能将TGF-βs和BMPs的信 号转 导至核内，提示TGF-βs和BMPs在成牙本质细胞分化和牙本质形成中的重要作用可能是通过 Smad4信号转导而实现的。关于R-Smads和Smad4如何结合?转导至核内是起转录 因子的作用，还是直接与靶基因结合？尚须进一步深入研究。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(39870789)
【参考文献】
[1] Ruch JV, Lesot H, Begue-kirn C. Odontoblast differentiation. Int J Dev Biol,1995,39:51
[2] Thesleff I, Vaahtokari A, Kettunen P, et al. Epithelial-mesen chymal signaling during tooth development. Connect Tissue Res, 1995,32:9
[3] Begue-Kirn C, Smith AJ, Ruch JV, et al. Effect of dentin prot eins, transforming growth factor-β, and bone morphogenetic protein-2 on the dif ferentiation of odontoblasts in vitro. Int J Dev Biol, 1992,36:491
, http://www.100md.com
[4] Begue-Kirn C, Smith A, Loriot M, et al. Comparative analysis of TGF-βs, BMPs, IGF, msxs,fibronectin, osteonectin and bone sialoprotein gene expressions during normal and in vitro induced odontoblast differentiation. Int J Dev Biol, 1994,38:405
[5] Heikinmo K.Stage-specific expression of decapentaplegic-Vg-relate d genes2,4,and 6(bone morphogenetic proteins2,4and 6)during human tooth morphoge nesis.J Dent Res,1994,73:590
[6] 吴军正，司徒镇强，陈建元，等. 体外培养的人牙龈牙周牙髓成纤维细 胞生长曲线及形态特点. 实用口腔医学杂志，1993，9(4)：227
[7] Heldin CH, Miyazono K,ten Dijke P. TGF-β signalling from cell m embrane to nucleus through Smad proteins.Nature,1997,390(6659):465
[8] Hahn SA, Schutte M,Hoque AT, et al. DPC4,a candidate tumor su ppressor gene at human chromosome 18q21.1. Science,1996,271:350
收稿日期：1999-11-19, http://www.100md.com
单位：何文喜(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；牛忠英(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；陈健(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；包柳郁(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；王景杰(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：人牙乳头细胞；Smad4；转化生长因子-β1；重组人 骨形成蛋白-2
牙体牙髓牙周病学杂志000211 【摘 要】 目的：观察转化生长因子-β超家族的 细胞内信号转导分子Smad4在人牙乳头细胞内的表达及信号转位过程。从细胞内信号转 导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法：原代 培养人牙乳头细胞，用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和 骨形成蛋白-2(recombinant human bone morphogenntic protein,rhBMP-2)刺激培养的细胞 ，免疫组化观察。结果：TGF-β1和rhBMP-2实验组胞核内均可见S mad4蛋白强阳性表达，但胞浆 内未见Smad4蛋白阳性表达；对照组胞浆内可见Smad4蛋白阳性表达，核内未见阳性 表达。结论：观察到Smad4在人牙乳头细胞内的表达并参与信号 转位过程，提示Smad4可能同时参与TGF-βs和BMPs的细胞内信号转导过程。TGF-βs和B MPs 在牙齿发育中信号传递可能都是通过Smad4的信号传导途径实现的。
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【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)02-0084-03
Immunohistochemical localization of Smad4 in human dental papillae c ells
HE Wen-xi，NIU Zhong-ying, CHEN Jian，et al
(School of Stomatology, The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of Sm ad4 in human dental papillae cells (HDPC)and the transduction process to e xplo re the molecular mechanism of odontoblast differentiation during tooth developme n t process in signalling transduction level. METHODS: Immun ohistochemical staining of HDPC derived from primary culture on stimulation from TGF-β1 or rhBMP-2. RESULTS: The expression of protein o f Smad4 was localized in cytoplasm of HDPC in control group. The expre ssion of protein of Smad4 was localized in nucleus of HDPC on sti mula tio n from TGF-β1 and rhBMP-2. CONCLUSION: The expression and translocation accumulation of the protein of Smad4 in HDPC were detected .It suggests Smad4 maybe participate in TGF-βs and BMPs signaling pathway.T he signalling transduction of TGF-βs and BMPs in tooth development maybe media ted by Smad4 signal pathway.
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【Key words】 Human dental papillae cell;Smad4;transf orming growth factor-β1;bone morphogenetic protein-2
在牙胚发育过程中，上皮-间充质之间的相互作用调控其形态的发 生和细胞的分化。其相互作用是通过釉上皮分泌的信号分子通过基底膜 活化后诱导间充质细胞 凝聚，凝聚的间充质细胞表达并分泌细胞因子和基质蛋白，细胞和细胞、细胞和基质蛋白之 间的相互作用导致成牙本质细胞分化完成。文献[1～5]表明，TGF-βs和BMPs 是主要的信号分子，参与早期的牙胚发育、成牙本质细胞分化和第三期牙本质形成。一般认 为，TGF-βs和BMPs以自分泌和旁分泌的方式调控自身在牙齿发育和牙本质形成中的作用。 但TGF-βs和BMPs如何调控自身在细胞内的表达和分泌，以及如何调控胞外基质的分泌？目 前 仍不清楚。Smad4是转导TGF-βs和BMPs细胞内信号的共同中介分子，本实验观察体外培 养的人牙乳头细胞内是否存在Smad4的表达，以及Smad4是否参与TGF-βs和BMP s细胞内信号传导，探讨成牙本质细胞分化和第三期牙本质形成机理。
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1 材料和方法
1.1 人牙乳头细胞原代培养和实验分组
选择合法引产的4～5月龄胎儿，取其牙乳头，组织块法[6]原代培养人牙乳头细胞 。 培养液为含150ml/L胎牛血清(FCS)的DMEM培养液(Gibco,USA)。取生长良好的第5代牙 乳头 细胞，用2.5g/L胰酶消化后，以2×104/L细胞浓度接种到24孔板中，将处理好的盖玻片预 先 放到24孔板中，待细胞基本爬满盖玻片后，换用含100pmol/L TGF-β1(Promega)和10nmol /L rhBMP-2(本校生化教研室刘新平教授惠赠)的2ml/L FCS的DMEM培养液培养，对照组继 续用 2ml/L FCS的DMEM培养液培养，不加任何刺激。培养1h后取出盖玻片，40g/L多聚甲醛 固定30 min ,备用。
1.2 免疫组化染色
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采用SABC法(武汉博士德公司提供试剂盒)，常规免疫组化染色。
2 结果
TGF-β1实验组，可见人牙乳头细胞胞核Smad4强阳性，胞浆内弱阳性(图1)；rhBMP-2 实验组，亦可见细胞胞核Smad4强阳性表达，胞浆内未见Smad4表达(图2)；对照 组，牙乳头细胞胞浆内可见Smad4 阳性表达，胞核内未见表达(图3)。
图1 TGF-β1组：人牙乳头细胞胞核Smad4强阳性表达，胞浆弱阳性表达 (SABC法，40 ×)
图2 rhBMP-2组：人牙乳头细胞核Smad4强阳性表达，胞浆弱阳性表达 (SABC法，40 ×)
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图3 对照组：人牙乳头细胞胞浆Smad4强阳性表达，胞核未见表达 (SABC法，40×)
3 讨论
TGF-βs和BMPs在牙齿胚胎发育过程中上皮-间充质相互作用所发生的一系列信号传导过 程中发挥重要的调控作用。近来研究[5]发现，在鼠牙胚发育早期，未来牙板形成 处 增厚的原口腔上皮中先出现BMP4的表达，随后出现BMP2的表达，BMP2的表达一直持续到帽状 期，之后BMP2的表达转入牙乳头间充质中。认为BMP2很可能是决定牙胚间充质细胞发育方向 的上皮-间充质相互作用中的信号分子。TGF-βs则在牙板上皮和牙胚发育的各期均见表达 [2]，表明TGF-βs在牙齿发育中发挥重要的作用。TGF-βs和BMPs成功地诱导体外 培养的人牙乳头细胞和牙髓细胞分化[1,3]，表明TGF-βs和BMPs在成牙本质细胞 分化和第三期牙本质形成中发挥重要的作用。
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TGF-βs和BMPs的作用都是通过细胞膜表面特异的受体介导发生的，起信号转导作用的是T GF-βs和BMPs各自特异的I型和Ⅱ型受体,Ⅰ、Ⅱ型受体均是单次跨膜的丝/ 苏氨酸蛋白 激酶受体。两者结构类似，但 Ⅰ型受体的胞浆区蛋白激酶结构域N端与细胞膜之间，存在一 个富含甘氨酸和丝氨酸的结构域，称为GS 结构域。TGF-β或BMPs首先与细胞膜表面Ⅱ型受 体结合，形成二元复合物。Ⅰ型受体不能单独与TGF-β结合，当TGF-β与Ⅱ型受体形成二元 复合物后，Ⅰ型受体识别这个二元复合物，并与之结合形成三元复合物，在此过程中Ⅱ型受 体的丝/苏氨酸激酶使Ⅰ型受体GS结构域的丝/苏氨酸磷酸化，使Ⅰ型受体活化。活化的 Ⅰ型受体则使其下游细胞内途径限制型Smads(Pathway-restricted Smads,R-Sm ads)信号 转导分子磷酸化，TGF-β为Smad2和Smad3，BMPs为Smad1和Smad5，磷酸化 的R-Smad与共同中 介型Smad(Common-mediator Smads,C-Smads)即Smad4结合形成异源寡聚合 物，转位至核内聚集，作用于靶基因，引起其表达[7]。
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Smad4在转化生长因子β超家族各个细胞因子的信号转导途径中都是必不可少的，是其 家族细 胞因子信号转导的共同中介分子；而且在脊椎动物细胞内它的作用是唯一的。关于Smad 4在 牙乳头细胞的表达及其作用的报道甚少，研究Smad4在牙乳头细胞的表达和作用，有利 于进一步研究牙乳头细胞的分化机理。
本实验观察到Smad4在人牙乳头细胞胞浆内的表达。同时观察到Smad4转位聚集于核 内，这 种现象只发生在TGF-β1和rhBMP-2实验组，对照组未见Smad4的转位聚集。此现象证实 Smad4 能传导TGF-βs和BMPs信号，并将信号转导至核内，同时也证实Smad4的作用不具有特异 性， 表明Smad4可能是TGF-βs和BMPs信号传导共同中介分子。这与Hahn等[8]报道 一致。
本实验发现牙乳头细胞内存在Smad4基因表达，而且Smad4能将TGF-βs和BMPs的信 号转 导至核内，提示TGF-βs和BMPs在成牙本质细胞分化和牙本质形成中的重要作用可能是通过 Smad4信号转导而实现的。关于R-Smads和Smad4如何结合?转导至核内是起转录 因子的作用，还是直接与靶基因结合？尚须进一步深入研究。
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国家自然科学基金资助项目(39870789)
【参考文献】
[1] Ruch JV, Lesot H, Begue-kirn C. Odontoblast differentiation. Int J Dev Biol,1995,39:51
[2] Thesleff I, Vaahtokari A, Kettunen P, et al. Epithelial-mesen chymal signaling during tooth development. Connect Tissue Res, 1995,32:9
[3] Begue-Kirn C, Smith AJ, Ruch JV, et al. Effect of dentin prot eins, transforming growth factor-β, and bone morphogenetic protein-2 on the dif ferentiation of odontoblasts in vitro. Int J Dev Biol, 1992,36:491
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[4] Begue-Kirn C, Smith A, Loriot M, et al. Comparative analysis of TGF-βs, BMPs, IGF, msxs,fibronectin, osteonectin and bone sialoprotein gene expressions during normal and in vitro induced odontoblast differentiation. Int J Dev Biol, 1994,38:405
[5] Heikinmo K.Stage-specific expression of decapentaplegic-Vg-relate d genes2,4,and 6(bone morphogenetic proteins2,4and 6)during human tooth morphoge nesis.J Dent Res,1994,73:590
[6] 吴军正，司徒镇强，陈建元，等. 体外培养的人牙龈牙周牙髓成纤维细 胞生长曲线及形态特点. 实用口腔医学杂志，1993，9(4)：227
[7] Heldin CH, Miyazono K,ten Dijke P. TGF-β signalling from cell m embrane to nucleus through Smad proteins.Nature,1997,390(6659):465
[8] Hahn SA, Schutte M,Hoque AT, et al. DPC4,a candidate tumor su ppressor gene at human chromosome 18q21.1. Science,1996,271:350
收稿日期：1999-11-19, http://www.100md.com