大鼠MHC-Ⅰ类基因cDNA的克隆
作者：夏仁品 沈文律 罗义刚j*wl, 百拇医药
单位：夏仁品 罗义刚 华西医科大学附一院普外科 成都610041；沈文律 汕头大学医学院附二院 汕头515031j*wl, 百拇医药
关键词：词 分子克隆；MHC-Ⅰ；逆转录聚合酶链反应j*wl, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990304摘 要 采用逆转录PCR技术自SD大鼠脾细胞中克隆出全长1125个bp的编码主要组织相容性抗原Ⅰ类分子(MHC-Ⅰ)cDNA，经限制性内切酶图谱分析证实后，定向插入表达载体pBV220，并筛选出带有插入片断的阳性克隆，为研究在原核或真核表达系统中表达及其在抗原识别、免疫应答中的作用奠定了基础。j*wl, 百拇医药
中图号 R392.11j*wl, 百拇医药
MOLECULAR CLONING OF CLASS I GENES IN THE MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX OF RATj*wl, 百拇医药
Xia Renpin， Sheng Wenlu， Lo Yigangj*wl, 百拇医药
(Department of General Surgery， First University Hospital， West China University of Medical Sciences， Chengdu 610041)j*wl, 百拇医药
Abstract The total RNA was extracted from the Rat Spleen cells. According to the published sequence of Rat MHC-Ⅰ(rMHC-Ⅰ)， a couple of primers for rMHC-Ⅰ was designed and synthesized.Through reverse trans-cription and Polymerase chain reaction， obtained a specific band of rMHC-ⅠcDNA fragment from Rat spleen cells. The obtained fragment was inserted to pBV220 plasmid and transformed to E. coli DH5a. Restriction enzyme digestion and PCR identified it as Rat MHC-Ⅰ with the whole reading frame of 1125 base pairs.
Key words Molecular cloning， Rat MHC-Ⅰ， RT-PCRte[u, 百拇医药
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex， MHC)分子通过与经加工后的抗原肽结合，形成MHC/抗原肽复合物，供T细胞受体(TCR)识别，在免疫应答和免疫调节中起着关键性的作用，是免疫细胞间沟通信息、相互协作的基础。为此，90年代初Cristina等[1]从大鼠cDNA文库中克隆到大鼠MHC-Ⅰ cDNA，引起广泛注意。为了进一步探讨其在免疫应答及免疫调节中的作用，我们通过逆转录PCR技术从大鼠脾细胞中也克隆获得了MHC-Ⅰ cDNA。te[u, 百拇医药
1 材料与方法te[u, 百拇医药
1.1 材料 E.coli DH5a和质粒pBV220为华西医科大学钩体研究室伍卫华教授惠赠。总RNA提取试剂盒(QIAGen公司)，RT-PCR及PCR试剂盒(GibcoBRL)，EcoR I，BamH I，Pru I，Ssp I，Pst I内切酶及DNA Marker(华美公司)，RNA酶(Promega)，低溶点琼脂糖(Sigma)，T4连接酶(GibcoBRL)。te[u, 百拇医药
1.2 引物设计合成 根据Cristina发表的MHC-Ⅰ cDNA序列，设计跨跃整个阅读框的一对引物。上游引物：5′-TTGAATTCCAGATGGAGGCGATG-3′，含起始密码子、EcoR I识别位点及保护碱基。下游引物：5′-CTGGATCCTTCTTTCATGCTTTAC-3′，含终止密码子和BamH I酶切位点，由Cybersyn公司合成。te[u, 百拇医药
1.3 总RNA的提取 SD大鼠麻醉后摘取脾脏，以100mg脾组织用QIAGEN公司的总RNA提取系统提取总RNA。脾组织经细胞裂解液变性、碾磨及离心后，将上清液转移到特定的旋转柱子中，加冲洗液离心冲洗3次，再以DEPC处理的双蒸水收集总RNA。以OD260/OD280比值检测纯度(大于1.8)。变性凝胶电泳检测RNA的完整性。te[u, 百拇医药
1.4 反转录PCR 以脾组织总RNA为模板，加入MHC-Ⅰ基因的下游引物，采用GibcoBRL公司的反转录系统行反转录，合成MHC-Ⅰ cDNA第一链，反应体积为20μl。取5～10μl逆转录产物为底物，加上游引物，用PCR试剂盒进行扩增，反应体积为50μl，引物浓度为50pmol/L。反应条件：94°C 1min，58°C 1min，72°C 1min，35循环。低溶点琼脂糖凝胶电泳回收扩增片断。
1.5 cDNA克隆扩增 回收反转录PCR产物，经EcoR I和BamH I酶切后，与相应酶切的pBV220质粒DNA连接，转化感受态大肠杆菌DH5a，涂板培养。利用pBV220中LacZ基因插入失活显色反应[2]，筛选出插入有MHC-Ⅰ类基因片断的白色阳性菌落。挑取白色菌落，小量扩增。以碱裂解法提取质粒，酶切鉴定。5p8e, 百拇医药
2 结果5p8e, 百拇医药
2.1 MHC-Ⅰ cDNA的RT-PCR产物分析 将RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，可见一清晰的特异扩增带，其大小与理论预期(1.1kb)一致。
5p8e, 百拇医药
图 1 大鼠MHC-Ⅰ cDNA产物的凝胶电泳5p8e, 百拇医药
Fig 1 Gel electrophoresis of RT-PCR product of5p8e, 百拇医药
rMHC-Ⅰlane 1：λDNA/HindⅢ；lane 2：RT-PCR product of rMHC-Ⅰ5p8e, 百拇医药
2.2 阳性克隆筛选 RT-PCR产物经双酶切与同样酶切的pBV220质粒连接后，转化大肠杆菌DH5a，挑取8个白色单菌落，按碱裂解法提取质粒DNA，经EcoR I， BamH I单酶和双酶切的酶切图谱如图2所示。
5p8e, 百拇医药
图 2 pBV/rMHC-Ⅰ重组体的酶切电泳5p8e, 百拇医药
Fig 2 Restriction enzymes digestion of recombined5p8e, 百拇医药
pBV/rMHC-Ⅰ5p8e, 百拇医药
Lane 1：λDNA/Hind Ⅲ；Lane 2：pBV/EcoR I+BamH I；5p8e, 百拇医药
Lane 3：pBV/rMHC-I/EcoR I；Lane 4：pBV/rMHC-Ⅰ/BamH I；Lane 5：pBV/rMHC-I/EcoR I+BamH I
2.3 rMHC-I类基因片断的酶切鉴定 从图3中可以看出，带有MHC-Ⅰ cDNA插入片断的阳性克隆可以被PstI酶切为2个片断，小片断为0.33kb。
k^#3, 百拇医药
图 3 pBV/rMHC-I质粒限制性酶切图谱k^#3, 百拇医药
Fig 3 Restriction enzyme mapping of pBV/rMHC-I plasmidk^#3, 百拇医药
Lane 1：λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ； Lane 2：pBV/rMHC-I/Ssp I；Lane 3：pBV/rMHC-I/Pru I；Lane 4：pBV/rMHC-I/Pst Ik^#3, 百拇医药
3 讨论k^#3, 百拇医药
主要组织相容性复合体(MHC)是一组编码细胞表面某些抗原的连锁的基因群。在不同种属的哺乳类动物中，MHC编码的抗原系统有不同的命名，但它们在组成结构、分布和功能上都很相似。如在小鼠、大鼠、人类分别称为H-2、AgB或H-1，HLA抗原。MHC-I类分子含有2条分离的多肽链，一条是由MHC基因编码的α链，另一条为非MHC编码的β链，此类抗原广泛分布于体内多种有核细胞表面。MHC-I类分子将加工后的抗原递呈给CD8+ T淋巴细胞，此路径的抗原加工与递呈由于其重要性近年来受到广泛重视。目前的研究认为，MHC-I类分子的a1和a2可变区外表面有一个20×10×10的沟槽，由8～9个氨基酸残基组成，这就是MHCI类分子的多肽结合部位[3]。MHC-I类分子限制性抗原的递呈是激活细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)的前提，而CTL在机体抗瘤与抗病毒免疫中起重要作用。Nouri[4]等研究认为，I类抗原的表达下降是细胞由正常向异常转化的关键性环节之一，I类抗原分子表达的下降程度和肿瘤的恶性程度呈正相关。在小鼠和许多人类肿瘤及肿瘤衍生细胞系上均发现MHC-I类抗原表达的下降或缺失。若将I类抗原的基因转移给肿瘤细胞株，则后者的致癌性或转移性即降低或消失。k^#3, 百拇医药
本研究应用分子生物学技术克隆MHC-IcDNA。根据文献报道合成一对可以克隆全长MHC-I cDNA的引物，且在两端添加了不同的酶切位点，便于质粒的定向克隆。用RT-PCR技术从大鼠脾细胞中成功克隆出全长为1.1kb cDNA。为进一步确定带有该插入片段的克隆为pBV-MHC-I，对其进行限制性酶谱分析：用EcoR I和BamH I双酶消化后，1%琼脂糖凝胶电泳可见两个DNA条带，与预计的大小一致；经Pst I(为MHC-I基因片断与pBV220上单酶切点)酶切后出现约0.33kb DNA，而经Ssp I及Pru I(均仅为pBV220上单酶切点)消化呈线性化。上述结果与理论预期一致,说明MHC-I已成功克隆到pBV220上。
MHC-I cDNA的获得，为进一步探索在原核或真核表达系统中表达，及其在抗原识别、免疫应答和免疫调节中的作用奠定了基础。], http://www.100md.com
中国博士后科学基金资助项目], http://www.100md.com
第一作者：男，31岁，博士后，主治医师(现在汕头大学医学院附二院外三科工作)], http://www.100md.com
参考文献], http://www.100md.com
1 Cristina Rada， Boberto Lorenzi， Simon J Powis， et al. Concerted evolution of class I genes in the major histo compatibility complexs of murine rodents. Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：2167], http://www.100md.com
2 Sambrook J， Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning——A Laboratory Mannual. 2nd. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989], http://www.100md.com
3 Sayegh MH，Watschinger B，Carpenter CB，et al. Mechanisms of T cell recognition of alloantigen——The role of Peptides. Transplantation， 1994，57：1295], http://www.100md.com
4 Nouri AME， Dos Santos AVL， Crosbyo D， et al. Correlation between class I antigen expression and the ability to generate tumor infiltrating lymphocytes from bladder tumor biopsies. Br J Cancer， 1991， 64：996], http://www.100md.com
(1998-03-02收稿；1998-07-13修回)(夏仁品 沈文律 罗义刚)
单位：夏仁品 罗义刚 华西医科大学附一院普外科 成都610041；沈文律 汕头大学医学院附二院 汕头515031j*wl, 百拇医药
关键词：词 分子克隆；MHC-Ⅰ；逆转录聚合酶链反应j*wl, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990304摘 要 采用逆转录PCR技术自SD大鼠脾细胞中克隆出全长1125个bp的编码主要组织相容性抗原Ⅰ类分子(MHC-Ⅰ)cDNA，经限制性内切酶图谱分析证实后，定向插入表达载体pBV220，并筛选出带有插入片断的阳性克隆，为研究在原核或真核表达系统中表达及其在抗原识别、免疫应答中的作用奠定了基础。j*wl, 百拇医药
中图号 R392.11j*wl, 百拇医药
MOLECULAR CLONING OF CLASS I GENES IN THE MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX OF RATj*wl, 百拇医药
Xia Renpin， Sheng Wenlu， Lo Yigangj*wl, 百拇医药
(Department of General Surgery， First University Hospital， West China University of Medical Sciences， Chengdu 610041)j*wl, 百拇医药
Abstract The total RNA was extracted from the Rat Spleen cells. According to the published sequence of Rat MHC-Ⅰ(rMHC-Ⅰ)， a couple of primers for rMHC-Ⅰ was designed and synthesized.Through reverse trans-cription and Polymerase chain reaction， obtained a specific band of rMHC-ⅠcDNA fragment from Rat spleen cells. The obtained fragment was inserted to pBV220 plasmid and transformed to E. coli DH5a. Restriction enzyme digestion and PCR identified it as Rat MHC-Ⅰ with the whole reading frame of 1125 base pairs.
Key words Molecular cloning， Rat MHC-Ⅰ， RT-PCRte[u, 百拇医药
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex， MHC)分子通过与经加工后的抗原肽结合，形成MHC/抗原肽复合物，供T细胞受体(TCR)识别，在免疫应答和免疫调节中起着关键性的作用，是免疫细胞间沟通信息、相互协作的基础。为此，90年代初Cristina等[1]从大鼠cDNA文库中克隆到大鼠MHC-Ⅰ cDNA，引起广泛注意。为了进一步探讨其在免疫应答及免疫调节中的作用，我们通过逆转录PCR技术从大鼠脾细胞中也克隆获得了MHC-Ⅰ cDNA。te[u, 百拇医药
1 材料与方法te[u, 百拇医药
1.1 材料 E.coli DH5a和质粒pBV220为华西医科大学钩体研究室伍卫华教授惠赠。总RNA提取试剂盒(QIAGen公司)，RT-PCR及PCR试剂盒(GibcoBRL)，EcoR I，BamH I，Pru I，Ssp I，Pst I内切酶及DNA Marker(华美公司)，RNA酶(Promega)，低溶点琼脂糖(Sigma)，T4连接酶(GibcoBRL)。te[u, 百拇医药
1.2 引物设计合成 根据Cristina发表的MHC-Ⅰ cDNA序列，设计跨跃整个阅读框的一对引物。上游引物：5′-TTGAATTCCAGATGGAGGCGATG-3′，含起始密码子、EcoR I识别位点及保护碱基。下游引物：5′-CTGGATCCTTCTTTCATGCTTTAC-3′，含终止密码子和BamH I酶切位点，由Cybersyn公司合成。te[u, 百拇医药
1.3 总RNA的提取 SD大鼠麻醉后摘取脾脏，以100mg脾组织用QIAGEN公司的总RNA提取系统提取总RNA。脾组织经细胞裂解液变性、碾磨及离心后，将上清液转移到特定的旋转柱子中，加冲洗液离心冲洗3次，再以DEPC处理的双蒸水收集总RNA。以OD260/OD280比值检测纯度(大于1.8)。变性凝胶电泳检测RNA的完整性。te[u, 百拇医药
1.4 反转录PCR 以脾组织总RNA为模板，加入MHC-Ⅰ基因的下游引物，采用GibcoBRL公司的反转录系统行反转录，合成MHC-Ⅰ cDNA第一链，反应体积为20μl。取5～10μl逆转录产物为底物，加上游引物，用PCR试剂盒进行扩增，反应体积为50μl，引物浓度为50pmol/L。反应条件：94°C 1min，58°C 1min，72°C 1min，35循环。低溶点琼脂糖凝胶电泳回收扩增片断。
1.5 cDNA克隆扩增 回收反转录PCR产物，经EcoR I和BamH I酶切后，与相应酶切的pBV220质粒DNA连接，转化感受态大肠杆菌DH5a，涂板培养。利用pBV220中LacZ基因插入失活显色反应[2]，筛选出插入有MHC-Ⅰ类基因片断的白色阳性菌落。挑取白色菌落，小量扩增。以碱裂解法提取质粒，酶切鉴定。5p8e, 百拇医药
2 结果5p8e, 百拇医药
2.1 MHC-Ⅰ cDNA的RT-PCR产物分析 将RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，可见一清晰的特异扩增带，其大小与理论预期(1.1kb)一致。
5p8e, 百拇医药图 1 大鼠MHC-Ⅰ cDNA产物的凝胶电泳5p8e, 百拇医药
Fig 1 Gel electrophoresis of RT-PCR product of5p8e, 百拇医药
rMHC-Ⅰlane 1：λDNA/HindⅢ；lane 2：RT-PCR product of rMHC-Ⅰ5p8e, 百拇医药
2.2 阳性克隆筛选 RT-PCR产物经双酶切与同样酶切的pBV220质粒连接后，转化大肠杆菌DH5a，挑取8个白色单菌落，按碱裂解法提取质粒DNA，经EcoR I， BamH I单酶和双酶切的酶切图谱如图2所示。
5p8e, 百拇医药图 2 pBV/rMHC-Ⅰ重组体的酶切电泳5p8e, 百拇医药
Fig 2 Restriction enzymes digestion of recombined5p8e, 百拇医药
pBV/rMHC-Ⅰ5p8e, 百拇医药
Lane 1：λDNA/Hind Ⅲ；Lane 2：pBV/EcoR I+BamH I；5p8e, 百拇医药
Lane 3：pBV/rMHC-I/EcoR I；Lane 4：pBV/rMHC-Ⅰ/BamH I；Lane 5：pBV/rMHC-I/EcoR I+BamH I
2.3 rMHC-I类基因片断的酶切鉴定 从图3中可以看出，带有MHC-Ⅰ cDNA插入片断的阳性克隆可以被PstI酶切为2个片断，小片断为0.33kb。
k^#3, 百拇医药图 3 pBV/rMHC-I质粒限制性酶切图谱k^#3, 百拇医药
Fig 3 Restriction enzyme mapping of pBV/rMHC-I plasmidk^#3, 百拇医药
Lane 1：λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ； Lane 2：pBV/rMHC-I/Ssp I；Lane 3：pBV/rMHC-I/Pru I；Lane 4：pBV/rMHC-I/Pst Ik^#3, 百拇医药
3 讨论k^#3, 百拇医药
主要组织相容性复合体(MHC)是一组编码细胞表面某些抗原的连锁的基因群。在不同种属的哺乳类动物中，MHC编码的抗原系统有不同的命名，但它们在组成结构、分布和功能上都很相似。如在小鼠、大鼠、人类分别称为H-2、AgB或H-1，HLA抗原。MHC-I类分子含有2条分离的多肽链，一条是由MHC基因编码的α链，另一条为非MHC编码的β链，此类抗原广泛分布于体内多种有核细胞表面。MHC-I类分子将加工后的抗原递呈给CD8+ T淋巴细胞，此路径的抗原加工与递呈由于其重要性近年来受到广泛重视。目前的研究认为，MHC-I类分子的a1和a2可变区外表面有一个20×10×10的沟槽，由8～9个氨基酸残基组成，这就是MHCI类分子的多肽结合部位[3]。MHC-I类分子限制性抗原的递呈是激活细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)的前提，而CTL在机体抗瘤与抗病毒免疫中起重要作用。Nouri[4]等研究认为，I类抗原的表达下降是细胞由正常向异常转化的关键性环节之一，I类抗原分子表达的下降程度和肿瘤的恶性程度呈正相关。在小鼠和许多人类肿瘤及肿瘤衍生细胞系上均发现MHC-I类抗原表达的下降或缺失。若将I类抗原的基因转移给肿瘤细胞株，则后者的致癌性或转移性即降低或消失。k^#3, 百拇医药
本研究应用分子生物学技术克隆MHC-IcDNA。根据文献报道合成一对可以克隆全长MHC-I cDNA的引物，且在两端添加了不同的酶切位点，便于质粒的定向克隆。用RT-PCR技术从大鼠脾细胞中成功克隆出全长为1.1kb cDNA。为进一步确定带有该插入片段的克隆为pBV-MHC-I，对其进行限制性酶谱分析：用EcoR I和BamH I双酶消化后，1%琼脂糖凝胶电泳可见两个DNA条带，与预计的大小一致；经Pst I(为MHC-I基因片断与pBV220上单酶切点)酶切后出现约0.33kb DNA，而经Ssp I及Pru I(均仅为pBV220上单酶切点)消化呈线性化。上述结果与理论预期一致,说明MHC-I已成功克隆到pBV220上。
MHC-I cDNA的获得，为进一步探索在原核或真核表达系统中表达，及其在抗原识别、免疫应答和免疫调节中的作用奠定了基础。], http://www.100md.com
中国博士后科学基金资助项目], http://www.100md.com
第一作者：男，31岁，博士后，主治医师(现在汕头大学医学院附二院外三科工作)], http://www.100md.com
参考文献], http://www.100md.com
1 Cristina Rada， Boberto Lorenzi， Simon J Powis， et al. Concerted evolution of class I genes in the major histo compatibility complexs of murine rodents. Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：2167], http://www.100md.com
2 Sambrook J， Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning——A Laboratory Mannual. 2nd. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989], http://www.100md.com
3 Sayegh MH，Watschinger B，Carpenter CB，et al. Mechanisms of T cell recognition of alloantigen——The role of Peptides. Transplantation， 1994，57：1295], http://www.100md.com
4 Nouri AME， Dos Santos AVL， Crosbyo D， et al. Correlation between class I antigen expression and the ability to generate tumor infiltrating lymphocytes from bladder tumor biopsies. Br J Cancer， 1991， 64：996], http://www.100md.com
(1998-03-02收稿；1998-07-13修回)(夏仁品 沈文律 罗义刚)