Th1/Th2相关细胞因子基因检测方法的建立①
作者：刘杰 魏海明 田志刚 冯进波 孙汭
单位：山东省医科院基础医学研究所山东肿瘤生物治疗研究中心, 济南 250062
关键词：Th1/ Th2；细胞因子；肿瘤细胞；逆转录聚合酶链反应；RNA斑点杂交
中国免疫学杂志991208 摘 要 目的：建立检测Th1/Th2相关细胞因子的方法。方法：设计6对用于IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IFNγ和β-actin 基因扩增的引物，建立可用于Th1/Th2相关细胞因子检测的RT-PCR技术，同时用切口平移法制备6种细胞因子的cDNA探针，建立RNA斑点杂交技术。结果：用RT-PCR和RNA斑点杂交技术检测20种肿瘤细胞株，发现11/20为Th2型细胞因子表达，8/20为Th0型，1/20未检测到细胞因子。结论：RT-PCR技术和RNA斑点杂交技术是检测Th1/Th2相关细胞因子的有效方法。
, 百拇医药
中国图书分类号 R730.3
Establishment of detecting methods of Th1/Th2 cytokine gene
LIU Jie，WEI Hai-Ming,TIAN Zhi-Gang et al.Shandong Cancer Biotherapy Center，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062
Abstract Objective:To establish methods for sensitive,rapid,economical detection of Th1/Th2 cytokine gene expression.Methods:Sixpairs of primers specific for the IL-2，IL-4，IL-10，IL-13，IFNγ and β-actin were designed.A sensitive and rapid method for detection of Th1/Th2 cytokine genes by RT-PCR was established.Meanwhile another method:the RNA hybridization with six cDNA probes were established.Results:The RT-PCR reaction and RNA hybridization was used to test five kinds of cytokine mRNAs expressed 20 tumor cell lines Th2 mRNAs were expressed in eleven cell lines;The mRNAs in eight cell lines.Conclusion:The preliminary results suggested that RT-PCR and RNA hybridization might be used to test Th1/Th2 cytokine gene expression.
, 百拇医药
Key words Th1/Th2 Cytokine Tumor cell RT-PCR reaction RNA hybridization
正常机体的CD4+T细胞，可分泌Th1/Th2 2类细胞因子，Th1类细胞因子包括IL-2、TNFβ和IFNγ，介导细胞免疫应答，与机体抗肿瘤抗病毒作用有关；Th2类细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、 IL-9、IL-10和IL-13等，介导体液免疫应答，与移植物耐受、抑制自身免疫疾病有关。机体Th1/Th2平衡失调后，可导致肿瘤发生、细菌、病毒等微生物感染以及自身免疫病、变态反应性疾病和移植排斥反应的发生，检测机体Th1/Th2相关细胞因子，对认识疾病的发生发展规律及以调整Th1/Th2平衡为目的，设计相应的治疗方案具有重要意义[1，2]。近期有人发现某些肿瘤细胞亦可分泌Th2类细胞因子，并与病程进展有关[3，4] 。本文建立RT-PCR和RNA斑点杂交方法，检测人外周血淋巴细胞和20株肿瘤细胞中与Th1/Th2相关的5种细胞因子表达状况，获得较好结果，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞株和人外周血单个核细胞分离 淋巴瘤5株，骨髓瘤2株，白血病2株，肺癌4株，乳腺癌3株，黑色素瘤2株，膀胱癌和结直肠癌各1株，依各细胞性质分别行贴壁或悬浮培养。人外周血单个核细胞分离采用淋巴细胞分层液，按常规方法进行。
1.2 PCR引物 5种细胞因子和β-actin的引物序列见表1,均由美国Verginia大学医学院高斌博士提供。
表1 RT-PCR检测Th1/Th2相关细胞因子的引物序列
Tab.1 The primer sequences of Th1/Th2 cytokines by RT-PCR Cytokine
Sequences
, 百拇医药 Length(bp)
β-actin
5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3'
500
5'CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3'
IL-2
5'ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT3'
458
5'GTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC3'
IFNγ
5'ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT3'
, 百拇医药
494
5'GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT3'
IL-4
5'ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT3'
456
5'CGAACACTTTGAATATTTCTCTCTCTCAT3'
IL-10
5'ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA3'
249
5'GTTTCGTATCTTCATTGTCAT3'
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IL-13
5'CAGGATCCCCTCCCTCTACAGCCCTCAGG3'
300
5'CGGAATTCTTAGTTGAACCGTCCCTCGCG3'
1.3 RNA提取 按GIT一步法提取，紫外分光光度法测RNA含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。
1.4 RT反应 取1～5 μg RNA，加入0.1 mol/L DTT 2 μl, MMLV 200 U(1 μl)，4×dNTP(10 mmol/L每种) 1 μl, 下游引物P2 0.5 μl(50 pmol), 总反应体积20 μl。37℃ 1 h后，95℃ 10 min灭活MMLV。
, 百拇医药 1.5 PCR反应体系 20 μl RT反应产物，15 mmol/L MgCl2 13.3 μl，4×dNTP 1 μl，上游引物P1 0.5 μl(50 pmol)，Taq DNA聚合酶2 μl (1 U/μl)，循环条件94℃1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次，末次72℃，延长7 min，电泳鉴定。
1.6 mRNA斑点杂交 分别含有质粒β-actin、IL-2、IFNγ、IL-4、IL-10和IL-13的大肠杆菌菌株由本室冻存，并按常规方法提取质粒，用切口平移法标记生物素化的各细胞因子探针，按本室常规进行mRNA斑点杂交。
2 结果
2.1 RT-PCR检测Th1/Th2类细胞因子基因表达实验条件的选择 以IL-10为例选择不同RNA量，分别用OligodT12-18、单一下游引物P2和5种细胞因子下游引物做RT反应，用不同RT产物量做PCR反应，结果用1～5 μg RNA，以下游引物P2作RT反应，并取全部RT产物(20 μl)作PCR反应，能取得较好结果。
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2.2 RT-PCR检测Th1/Th2类细胞因子的电泳图谱 以HT29细胞为例，图1所示该细胞表达IL-4、IL-10和IL-13，为典型的Th2型细胞，Daudi细胞表达5种细胞因子，为Th0型细胞(既表达Th1类细胞因子，又表达Th2类细胞因子)。
图1 HT29(结肠癌)Th1/Th2类细胞因子的基因表达
Fig.1 Th1/Th2 cytokine genes expression of colon cancer cell line HT29
Note:A.PCR marker:1 000,750,500,300,150,50 bp；B.β-actin；C.IL-2；D.IFNγ；E.IL-4；F.IL-10；G.IL-13
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图2 20种人肿瘤细胞株IL-4基因的表达
Fig.2 IL-4 gene expression of 20 human tumor cell lines
Note:A.HT29，T24，M14，M21，HTB123，HTB-133T-4TD，OMDA231，PG；B.SCL，NSCL-16HC，NSCL-22H，DB，Karpas,Michael,Daudi,Raji;C.RPMI8226,U266,K562,HL60
2.3 mRNA斑点杂交的结果 点杂交显示生物素标记6种cDNA基因探针的灵敏度达0.1 pg水平，图2以IL-4为例，显示20种不同肿瘤细胞株的RNA杂交结果。
2.4 RT-PCR和RNA斑点杂交结果的比较 两者的结果基本一致。黑色素瘤M21细胞IL-2在RT-PCR检测时有较淡的相应分子条带出现，但RNA斑点杂交未出现相应阳性结果。比较而言，RNA斑点杂交的结果可信度更高，RT-PCR因其过于灵敏，有时会出现假阳性结果，2种方法同时应用，会取得准确结果。
, 百拇医药
2.5 20种人肿瘤细胞株和健康人外周血单个核细胞Th1/Th2类细胞因子的基因表达结果 包括结直肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、乳腺癌和肺癌在内的11株实体瘤中，IL-2、IFNγ、IL-4、IL-10、IL-13的表达分别为1/11、2/11、9/11、10/11和10/11，明显表现为Th2型；包括淋巴瘤、骨髓瘤和白血病在内的9株血液系统肿瘤，上述5种细胞因子的表达依次为7/9、6/9、9/9、9/9和9/9，以Th0型为主。经过测定5例健康人外周血单个核细胞(未进行体外刺激)发现仅1例表达低水平的IL-2和IL-6，其余均未测出。而检测10例哮喘病人外周血单个核细胞却发现有3例IL-2弱表达，1例IFNγ弱表达，5例表达IL-4，9例表达较高水平的IL-10，8例表达IL-13(另文详细报道)。
3 讨论
RT-PCR是用来检测基因表达状况的一种快速、灵敏、特异的方法，并可进行半定量，在特异引物的引导下，可以从低丰度的mRNA逆转录产物中扩增出近μg级的cDNA产物。通常进行重组克隆时，提取目的基因表达高丰度的细胞总RNA进行RT-PCR以获得目的DNA片段，20 μl RT反应体系只取5 μl即可进行PCR，最终的扩增产物10 μl即可以在1.5%琼脂糖电泳上观察出明显的条带。但在本次进行Th1/Th2 基因表达的检测时发现，上述的方法不能获得肉眼可见的扩增条带，并且传统的OligodT12-18在灵敏度和特异性方面与下游引物P2法相比都表现出极大的差距，这说明Th1/Th2类细胞因子虽然发挥了巨大的免疫系统调节作用，但绝对含量相对地微小，由此也可看出细胞因子微量高效的特点。于是，我们提取了1×105肿瘤细胞的总RNA，每种细胞因子的RT体系中加入1～5 μg RNA，将20 μl RT反应产物全部用于一种细胞因子的PCR，即获得了清晰的扩增带影。采用下游引物P2参与RT反应的方法，不仅可省去OligodT12-18的实验费用，亦可减少一个可影响因素的分析。
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RT-PCR技术在具有高度灵敏性的同时，势必容易产生结果的假阳性，出现非特异性的扩增条带。因此进行RT-PCR时应注意：引物设计的特异性；PCR反应时适当提高退火温度；PCR扩增产物应有相应的技术同时操作进行特异性鉴定，如Northern转印杂交、RNA斑点杂交、PCR产物电泳后转印杂交等。
RNA斑点杂交是一种检测Th1/Th2相关细胞因子的优选方法，该法忠实性强，可直观了解各种Th1/Th2相关细胞因子的表达状况。但采用生物素标记探针进行RNA斑点杂交时，有时也会有非特异着色现象，可通过提高洗膜温度、延长洗膜时间等方法提高其特异性，该法的另一不足是操作繁琐，同时进行多个样品检测时易导致RNA降解，若控制好反应条件，可获得满意的结果。
Th1/Th2的漂移与多种疾病的发生发展有关，我们以RT-PCR和RNA斑点杂交法检测了5例正常人外周血单个核细胞和 20 种肿瘤细胞株中Th1/Th2相关细胞因子的表达状况，发现正常人未刺激的外周血单个核细胞基本处于不表达的状态；而肿瘤细胞中除1株黑色素瘤细胞M14未检测出细胞因子外，其余19株均表现为Th2或 Th0状态，无1株表现为Th1，说明肿瘤细胞已发生了明显的Th2或Th2/Th0漂移现象。机体的抗肿瘤免疫作用，理论上应以Th1介导的细胞免疫为主，一时Th1/Th2失衡，向Th2方向漂移，造成免疫抑制状态、机体的抗肿瘤免疫将受到严重干扰。根据机体的Th2漂移状况，应设法促使荷瘤机体由Th2向Th1逆转，这种以调整Th1/Th2平衡为目的的逆转方法，可为肿瘤的免疫治疗提供新的手段[5，6]。从此意义上说，检测Th1/Th2类细胞因子的意义，并不着重于疾病的诊断，而更注重疾病发生发展的规律，并以调整Th1/Th2平衡为目的，设计相应的治疗方案，推而广之，Th1/Th2类细胞因子的检测能分析多种疾病的发生发展规律，包括细胞病毒感染、变态反应性疾病、自身免疫病的发生，也能为疾病的生物治疗，包括细胞因子治疗、抗细胞因子治疗、过继细胞免疫治疗的亚临床和临床研究，提供正确的治疗方案。
, 百拇医药
资金项目：本研究受国家自然科学基金(39480023)资助
作者简介：刘 杰，女，30岁，硕士，助理研究员，主要从事肿瘤免疫和分子生物学研究；
田志刚，男，41岁，博士，研究员，主要从事肿瘤免疫和分子生物学研究
参考文献
1 Abbas A K,Murphy K M,Sher A et al. Functional diversity of helper T lymphocytes.Nature,1996;383(6603):787
2 Mosmann T R,Sad S.The expanding universe of T-cell subsets:Th1,Th2 and more.Immunology Today,1996;17(3):138
, 百拇医药
3 Huang M,Wang J,Lee P et al. Human non-small cell lung cancer cells express a type 2 cytokine pattern. Cancer Res, 1995;55:3847
4 Roussel E,Gingras M C,Grimm E A et al. Predominance of a type 2 intratumoural immune response in fresh tumour-infiltrating lymphocytes from human gliomas. Clin Exp Immunol,1996;105(2):344
5 刘 杰，魏海明，田志刚. Th1/Th2漂移与抗肿瘤免疫. 国外医学.肿瘤学分册，1997；24(3)168
6 魏海明，刘 杰，田志刚. 检测Th1/Th2亚群的临床意义. 中华医学检验杂志，1998；21(1)：56
收稿1997-11-29 修回1998-05-29
, 百拇医药
单位：山东省医科院基础医学研究所山东肿瘤生物治疗研究中心, 济南 250062
关键词：Th1/ Th2；细胞因子；肿瘤细胞；逆转录聚合酶链反应；RNA斑点杂交
中国免疫学杂志991208 摘 要 目的：建立检测Th1/Th2相关细胞因子的方法。方法：设计6对用于IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IFNγ和β-actin 基因扩增的引物，建立可用于Th1/Th2相关细胞因子检测的RT-PCR技术，同时用切口平移法制备6种细胞因子的cDNA探针，建立RNA斑点杂交技术。结果：用RT-PCR和RNA斑点杂交技术检测20种肿瘤细胞株，发现11/20为Th2型细胞因子表达，8/20为Th0型，1/20未检测到细胞因子。结论：RT-PCR技术和RNA斑点杂交技术是检测Th1/Th2相关细胞因子的有效方法。
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中国图书分类号 R730.3
Establishment of detecting methods of Th1/Th2 cytokine gene
LIU Jie，WEI Hai-Ming,TIAN Zhi-Gang et al.Shandong Cancer Biotherapy Center，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062
Abstract Objective:To establish methods for sensitive,rapid,economical detection of Th1/Th2 cytokine gene expression.Methods:Sixpairs of primers specific for the IL-2，IL-4，IL-10，IL-13，IFNγ and β-actin were designed.A sensitive and rapid method for detection of Th1/Th2 cytokine genes by RT-PCR was established.Meanwhile another method:the RNA hybridization with six cDNA probes were established.Results:The RT-PCR reaction and RNA hybridization was used to test five kinds of cytokine mRNAs expressed 20 tumor cell lines Th2 mRNAs were expressed in eleven cell lines;The mRNAs in eight cell lines.Conclusion:The preliminary results suggested that RT-PCR and RNA hybridization might be used to test Th1/Th2 cytokine gene expression.
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Key words Th1/Th2 Cytokine Tumor cell RT-PCR reaction RNA hybridization
正常机体的CD4+T细胞，可分泌Th1/Th2 2类细胞因子，Th1类细胞因子包括IL-2、TNFβ和IFNγ，介导细胞免疫应答，与机体抗肿瘤抗病毒作用有关；Th2类细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、 IL-9、IL-10和IL-13等，介导体液免疫应答，与移植物耐受、抑制自身免疫疾病有关。机体Th1/Th2平衡失调后，可导致肿瘤发生、细菌、病毒等微生物感染以及自身免疫病、变态反应性疾病和移植排斥反应的发生，检测机体Th1/Th2相关细胞因子，对认识疾病的发生发展规律及以调整Th1/Th2平衡为目的，设计相应的治疗方案具有重要意义[1，2]。近期有人发现某些肿瘤细胞亦可分泌Th2类细胞因子，并与病程进展有关[3，4] 。本文建立RT-PCR和RNA斑点杂交方法，检测人外周血淋巴细胞和20株肿瘤细胞中与Th1/Th2相关的5种细胞因子表达状况，获得较好结果，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞株和人外周血单个核细胞分离 淋巴瘤5株，骨髓瘤2株，白血病2株，肺癌4株，乳腺癌3株，黑色素瘤2株，膀胱癌和结直肠癌各1株，依各细胞性质分别行贴壁或悬浮培养。人外周血单个核细胞分离采用淋巴细胞分层液，按常规方法进行。
1.2 PCR引物 5种细胞因子和β-actin的引物序列见表1,均由美国Verginia大学医学院高斌博士提供。
表1 RT-PCR检测Th1/Th2相关细胞因子的引物序列
Tab.1 The primer sequences of Th1/Th2 cytokines by RT-PCR Cytokine
Sequences
, 百拇医药 Length(bp)
β-actin
5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3'
500
5'CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3'
IL-2
5'ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT3'
458
5'GTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC3'
IFNγ
5'ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT3'
, 百拇医药
494
5'GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT3'
IL-4
5'ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT3'
456
5'CGAACACTTTGAATATTTCTCTCTCTCAT3'
IL-10
5'ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA3'
249
5'GTTTCGTATCTTCATTGTCAT3'
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IL-13
5'CAGGATCCCCTCCCTCTACAGCCCTCAGG3'
300
5'CGGAATTCTTAGTTGAACCGTCCCTCGCG3'
1.3 RNA提取 按GIT一步法提取，紫外分光光度法测RNA含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。
1.4 RT反应 取1～5 μg RNA，加入0.1 mol/L DTT 2 μl, MMLV 200 U(1 μl)，4×dNTP(10 mmol/L每种) 1 μl, 下游引物P2 0.5 μl(50 pmol), 总反应体积20 μl。37℃ 1 h后，95℃ 10 min灭活MMLV。
, 百拇医药 1.5 PCR反应体系 20 μl RT反应产物，15 mmol/L MgCl2 13.3 μl，4×dNTP 1 μl，上游引物P1 0.5 μl(50 pmol)，Taq DNA聚合酶2 μl (1 U/μl)，循环条件94℃1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次，末次72℃，延长7 min，电泳鉴定。
1.6 mRNA斑点杂交 分别含有质粒β-actin、IL-2、IFNγ、IL-4、IL-10和IL-13的大肠杆菌菌株由本室冻存，并按常规方法提取质粒，用切口平移法标记生物素化的各细胞因子探针，按本室常规进行mRNA斑点杂交。
2 结果
2.1 RT-PCR检测Th1/Th2类细胞因子基因表达实验条件的选择 以IL-10为例选择不同RNA量，分别用OligodT12-18、单一下游引物P2和5种细胞因子下游引物做RT反应，用不同RT产物量做PCR反应，结果用1～5 μg RNA，以下游引物P2作RT反应，并取全部RT产物(20 μl)作PCR反应，能取得较好结果。
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2.2 RT-PCR检测Th1/Th2类细胞因子的电泳图谱 以HT29细胞为例，图1所示该细胞表达IL-4、IL-10和IL-13，为典型的Th2型细胞，Daudi细胞表达5种细胞因子，为Th0型细胞(既表达Th1类细胞因子，又表达Th2类细胞因子)。
图1 HT29(结肠癌)Th1/Th2类细胞因子的基因表达
Fig.1 Th1/Th2 cytokine genes expression of colon cancer cell line HT29
Note:A.PCR marker:1 000,750,500,300,150,50 bp；B.β-actin；C.IL-2；D.IFNγ；E.IL-4；F.IL-10；G.IL-13
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图2 20种人肿瘤细胞株IL-4基因的表达
Fig.2 IL-4 gene expression of 20 human tumor cell lines
Note:A.HT29，T24，M14，M21，HTB123，HTB-133T-4TD，OMDA231，PG；B.SCL，NSCL-16HC，NSCL-22H，DB，Karpas,Michael,Daudi,Raji;C.RPMI8226,U266,K562,HL60
2.3 mRNA斑点杂交的结果 点杂交显示生物素标记6种cDNA基因探针的灵敏度达0.1 pg水平，图2以IL-4为例，显示20种不同肿瘤细胞株的RNA杂交结果。
2.4 RT-PCR和RNA斑点杂交结果的比较 两者的结果基本一致。黑色素瘤M21细胞IL-2在RT-PCR检测时有较淡的相应分子条带出现，但RNA斑点杂交未出现相应阳性结果。比较而言，RNA斑点杂交的结果可信度更高，RT-PCR因其过于灵敏，有时会出现假阳性结果，2种方法同时应用，会取得准确结果。
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2.5 20种人肿瘤细胞株和健康人外周血单个核细胞Th1/Th2类细胞因子的基因表达结果 包括结直肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、乳腺癌和肺癌在内的11株实体瘤中，IL-2、IFNγ、IL-4、IL-10、IL-13的表达分别为1/11、2/11、9/11、10/11和10/11，明显表现为Th2型；包括淋巴瘤、骨髓瘤和白血病在内的9株血液系统肿瘤，上述5种细胞因子的表达依次为7/9、6/9、9/9、9/9和9/9，以Th0型为主。经过测定5例健康人外周血单个核细胞(未进行体外刺激)发现仅1例表达低水平的IL-2和IL-6，其余均未测出。而检测10例哮喘病人外周血单个核细胞却发现有3例IL-2弱表达，1例IFNγ弱表达，5例表达IL-4，9例表达较高水平的IL-10，8例表达IL-13(另文详细报道)。
3 讨论
RT-PCR是用来检测基因表达状况的一种快速、灵敏、特异的方法，并可进行半定量，在特异引物的引导下，可以从低丰度的mRNA逆转录产物中扩增出近μg级的cDNA产物。通常进行重组克隆时，提取目的基因表达高丰度的细胞总RNA进行RT-PCR以获得目的DNA片段，20 μl RT反应体系只取5 μl即可进行PCR，最终的扩增产物10 μl即可以在1.5%琼脂糖电泳上观察出明显的条带。但在本次进行Th1/Th2 基因表达的检测时发现，上述的方法不能获得肉眼可见的扩增条带，并且传统的OligodT12-18在灵敏度和特异性方面与下游引物P2法相比都表现出极大的差距，这说明Th1/Th2类细胞因子虽然发挥了巨大的免疫系统调节作用，但绝对含量相对地微小，由此也可看出细胞因子微量高效的特点。于是，我们提取了1×105肿瘤细胞的总RNA，每种细胞因子的RT体系中加入1～5 μg RNA，将20 μl RT反应产物全部用于一种细胞因子的PCR，即获得了清晰的扩增带影。采用下游引物P2参与RT反应的方法，不仅可省去OligodT12-18的实验费用，亦可减少一个可影响因素的分析。
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RT-PCR技术在具有高度灵敏性的同时，势必容易产生结果的假阳性，出现非特异性的扩增条带。因此进行RT-PCR时应注意：引物设计的特异性；PCR反应时适当提高退火温度；PCR扩增产物应有相应的技术同时操作进行特异性鉴定，如Northern转印杂交、RNA斑点杂交、PCR产物电泳后转印杂交等。
RNA斑点杂交是一种检测Th1/Th2相关细胞因子的优选方法，该法忠实性强，可直观了解各种Th1/Th2相关细胞因子的表达状况。但采用生物素标记探针进行RNA斑点杂交时，有时也会有非特异着色现象，可通过提高洗膜温度、延长洗膜时间等方法提高其特异性，该法的另一不足是操作繁琐，同时进行多个样品检测时易导致RNA降解，若控制好反应条件，可获得满意的结果。
Th1/Th2的漂移与多种疾病的发生发展有关，我们以RT-PCR和RNA斑点杂交法检测了5例正常人外周血单个核细胞和 20 种肿瘤细胞株中Th1/Th2相关细胞因子的表达状况，发现正常人未刺激的外周血单个核细胞基本处于不表达的状态；而肿瘤细胞中除1株黑色素瘤细胞M14未检测出细胞因子外，其余19株均表现为Th2或 Th0状态，无1株表现为Th1，说明肿瘤细胞已发生了明显的Th2或Th2/Th0漂移现象。机体的抗肿瘤免疫作用，理论上应以Th1介导的细胞免疫为主，一时Th1/Th2失衡，向Th2方向漂移，造成免疫抑制状态、机体的抗肿瘤免疫将受到严重干扰。根据机体的Th2漂移状况，应设法促使荷瘤机体由Th2向Th1逆转，这种以调整Th1/Th2平衡为目的的逆转方法，可为肿瘤的免疫治疗提供新的手段[5，6]。从此意义上说，检测Th1/Th2类细胞因子的意义，并不着重于疾病的诊断，而更注重疾病发生发展的规律，并以调整Th1/Th2平衡为目的，设计相应的治疗方案，推而广之，Th1/Th2类细胞因子的检测能分析多种疾病的发生发展规律，包括细胞病毒感染、变态反应性疾病、自身免疫病的发生，也能为疾病的生物治疗，包括细胞因子治疗、抗细胞因子治疗、过继细胞免疫治疗的亚临床和临床研究，提供正确的治疗方案。
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资金项目：本研究受国家自然科学基金(39480023)资助
作者简介：刘 杰，女，30岁，硕士，助理研究员，主要从事肿瘤免疫和分子生物学研究；
田志刚，男，41岁，博士，研究员，主要从事肿瘤免疫和分子生物学研究
参考文献
1 Abbas A K,Murphy K M,Sher A et al. Functional diversity of helper T lymphocytes.Nature,1996;383(6603):787
2 Mosmann T R,Sad S.The expanding universe of T-cell subsets:Th1,Th2 and more.Immunology Today,1996;17(3):138
, 百拇医药
3 Huang M,Wang J,Lee P et al. Human non-small cell lung cancer cells express a type 2 cytokine pattern. Cancer Res, 1995;55:3847
4 Roussel E,Gingras M C,Grimm E A et al. Predominance of a type 2 intratumoural immune response in fresh tumour-infiltrating lymphocytes from human gliomas. Clin Exp Immunol,1996;105(2):344
5 刘 杰，魏海明，田志刚. Th1/Th2漂移与抗肿瘤免疫. 国外医学.肿瘤学分册，1997；24(3)168
6 魏海明，刘 杰，田志刚. 检测Th1/Th2亚群的临床意义. 中华医学检验杂志，1998；21(1)：56
收稿1997-11-29 修回1998-05-29
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