甲钴胺拮抗庆大霉素瞬时耳毒作用的实验研究
作者：金晓杰 沈香然 金西铭
单位：金晓杰(上海第二医科大学附属仁济医院耳鼻咽喉科 上海，200001)；沈香然(上海第二医科大学附属仁济医院耳鼻咽喉科 上海，200001)；金西铭(上海第二医科大学附属仁济医院耳鼻咽喉科 上海，200001)
关键词：甲钴胺；庆大霉素；瞬时耳毒性
临床耳鼻咽喉科杂志000714 摘要 目的：探讨甲钴胺是否具有防治氨基甙类抗生素耳毒作用。方法：用单次肌注大剂量庆大霉素(125 mg/kg)造成感音障碍的动物模型。通过系列观察耳蜗电图的变化，观察在肌注庆大霉素的同时应用甲钴胺(1 mg/kg)是否具有拮抗庆大霉素的瞬时耳毒作用。结果：①单次大剂量庆大霉素注射，可引起动物复合动作电位CAP N1，N2潜伏期延长与振幅减弱；N1-N2间期虽有延长，变化仍在正常范围内；②单次大剂量庆大霉素注射并与甲钴胺同时用药，N1及N2的上述变化明显改善。结论：甲钴胺在增强神经纤维生理功能的同时，尚有拮抗庆大霉素的瞬时耳毒作用，这可能与甲钴胺在S-腺苷甲硫胺酸甲基化过程中产生谷胱苷肽-SH有关。
, 百拇医药
Methylcobalamin, antagonist to transient ototoxic action of gentamicin
JIN Xiao-jie SHEN Xiang-ran JIN Xi-ming
(Department of Otorhinolaryngology,Renji Hospital,the Second Medical University,Shanghai 200001)
Abstract Objective:To explore whether is methylcobalamin effective in prophylaxis of AmAn ototoxic action.Method:We attempted to use a single injection of gentamicin(125mg/Kg b.i.w.) to make an animal (guinea pig)model of transient sensory disturbance of hearing, and by a series observation of the changes in ECochG to find out the antagonistic action of methylcobalamin which was simultaneously given to animals(1mg/Kg,i.m.)followed injection of gentamicin.Result:①The transient ototoxic action of gentamicin may cause delay of latency and diminution of amplitude of CAP N1 and N2 in animals with a single injection of gentamicin.Though the interval between N1 and N2 prolonged,the changes were still within normal ranges.②By contrast,the changes of delay at N1 and N2 as mentioned above were significantly improved in animals administered simultaneously with methylcobalamin.Conclusion:It indicated that in addition to the improvement of physiologic function of nerve fibres，methylcobalamin may be also an agent to prevent the transient ototoxic action of gentamicin .Due to methylcobalamin acts as a methyl donor ,it participates the synthesis of SAM (S-adenosylmethionine) and thus products GSH(Glutathion SH),the latter may inhibit ototoxic side-effects of gentamicin.
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Key words Methylcobalamin Gentamicin Transient ototoxic action
氨基甙类抗生素(AmAn)已被临床广泛应用，但有关其耳毒作用的防治问题仍未解决。近年来，甲钴胺的大量应用及实验研究表明，它在修复神经损伤和治疗末梢神经障碍中具有明显的效果。这就提出了一个问题，即甲钴胺在防治AmAn耳毒作用方面是否同样有效？为此，我们设计了用单次肌注大剂量庆大霉素造成感音障碍的动物模型，系列观察耳蜗电图的变化，探讨同时应用甲钴胺是否有拮抗庆大霉素耳毒的作用。报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
选择14只体重250～350 g耳廓反射正常的健康花色豚鼠，随机均分两组。甲钴胺组：用乌拉坦按
1.6 g/kg的剂量腹腔内注射麻醉后，在一次性单剂量肌注庆大霉素(125 mg/kg)的同时,按1 mg/kg剂量给予肌注甲钴胺(日本卫材株式会社驻上海办事处提供)；对照组：麻醉后仅肌注庆大霉素，剂量同甲钴胺组。
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1.2 检测方法
在用药前及用药后的15、30、45、60及75 min时，分别测定豚鼠右耳复合动作电位(CAP)。采用Nicolet信息处理机(Spirit TM,USA)引导并记录CAP。将不锈钢丝经豚鼠耳后茎乳孔插入，达面神经骨管水平段内，用作参考电极；记录电极置测试一侧耳垂处，对侧耳垂处置接地电极。用短声和频率为8、4、2 kHz的短音刺激，刺激间隔为20 ms。带通滤波为150～1 500 Hz，叠加40次，短音上升和下降时间各为2 ms，刺激强度为90 dB nHL。
1.3 扫描电镜组织学处理
在最后一次电生理测定后，立即将动物处死，取其听泡，从蜗尖和前庭窗灌入2%戊二醛固定液，浸入戊二醛固定液中。在解剖显微镜下暴露耳蜗膜迷路，经1%锇酸后固定、脱水、临界点干燥、镀金，扫描电镜下观察基底膜情况。
, http://www.100md.com 2 结果
注药前后各种声刺激下，N1、N2波的潜伏期变化见图1。对照组在注药后15 min时，N1波的潜伏期已出现延长，随时间的推移，延长增大。在注药30 min后，各声刺激引起的潜伏期延长均在0.1～0.2 ms；而在注药后75 min即相当于庆大霉素血清浓度的半衰期，潜伏期延长超过0.2 ms，各时间段与用药前比较均有显著性差异(P<0.05)。反之，甲钴胺组N1波潜伏期在注药后30 min内无延长，在短音刺激时，有些频率反有缩短的表现。在庆大霉素血清浓度半衰期内除4 kHz外，延长多不超过0.1 ms，各时间段与用药前比较均无显著性差异(P>0.05)。关于N2波的潜伏期，对照组在各种声刺激下各时间段的测值均有明显延长。在注药后75 min延长可达0.2～0.3 ms，与用药前比较均有显著性差异(P<0.05)；反之，甲钴胺组的测值延长均不超过0.1 ms，在半衰期时也均未超过0.2 ms，与用药前比较均无显著性差异。
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图1 甲钴胺组与对照组用药前及用药后15、30、45、60、75 min CAP N1，N2波潜伏期在click，4 kHz声刺激时的变化情况 N1e：甲钴胺组N1波，N1c：对照组N1波；N2e：甲钴胺组N2波，N2c：对照组N2波
N1-N2间期尽管有随注药后的时间推移而延长，但变异仍在正常范围内。
两组动物N1及N2波振幅变化情况见图2。对照组用庆大霉素后N1振幅除2 kHz外较用药前无明显变化外，在其它的声刺激下均出现随注药后的时间推移而振幅有逐渐减弱的现象(P<0.05)；反之，在甲钴胺组中，除4 kHz有微小变化外，在其它的声刺激下均出现随注药后时间的推移而振幅增强。对照组N2波的振幅在各种声刺激下，各时间段的测值与注药前比较均无明显变化，而甲钴胺组均随注药后时间的推移而有振幅增强的现象。
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图2 甲钴胺组与对照组用药前及用药后15、30、45、60、75 min
CAP N1，N2波振幅在click，8 kHz声刺激时的变化情况
扫描电镜观察：无论是甲钴胺组还是对照组内外毛细胞均无明显的死亡，在耳蜗底回见少量外毛细胞纤毛散乱、倒伏、脱落。
3 讨论
3.1 庆大霉素瞬时耳毒作用的机制
已有报道〔1〕，单次大剂量注射庆大霉素能引起动物内耳的瞬时耳毒作用。Keiner等〔2〕指出，庆大霉素经过代谢才对毛细胞有细胞毒性作用。本实验结果也间接提示了庆大霉素的这种瞬时耳毒作用，即在庆大霉素单次大剂量注药后，动物在15 min时已出现CAP N1和N2波潜伏期的延长与振幅的减弱。由于这种现象是在注药后的短时间内发生，显然，庆大霉素这一瞬时耳毒作用产生的机制可能与注药后的组织吸收和代谢，并经血液循环的直接扩散有关。
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N1的电位源于听神经的轴索，N2源于耳蜗核，它们分别反映了毛细胞至螺旋神经节和螺旋神经至蜗核的神经纤维放电与传导的功能。本实验N1及N2潜伏期的延长与振幅的减弱，提示单次大剂量注入已能影响听觉传入神经的放电功能或放电的神经纤维数量。实验的另一结果表明，N1-N2间期尽管有随注药后的时间推移而延长，但变异仍在正常范围内，提示了庆大霉素的瞬时耳毒作用虽可影响神经纤维的放电功能，但对神经纤维的传导功能却影响较小。Aran通过动物实验证实了单剂量庆大霉素瞬时耳毒作用的部位在外毛细胞——向内传出的突触，并可能与钙离子通道可逆性阻断作用有关〔1〕。由于传入突触的受阻，引起传入神经纤维放电功能的障碍就成为这一耳毒作用所致的必然结果。
3.2 甲钴胺的拮抗作用
甲钴胺是一种辅酶型B12，在体内代谢过程中所提供的-CH3参与生物的转甲基作用。实验表明，动物肌注甲钴胺后，药物能迅速进入神经细胞，参与神经细胞的蛋白质和磷脂的合成，因而有助于修复损伤的神经纤维，增强神经纤维的传导功能，有关的临床应用及实验研究均已有报道〔3，4〕。另外,Kikuchi通过视网膜细胞培养，观察到较长时期应用甲钴胺可保护培养中的视网膜神经元拮抗NMDA受器介导的谷胺酸神经毒性的作用，并认为这一作用或许是通过由S-腺苷甲硫胺酸(SAM)介导的甲基化而改变了细胞膜的特性所致〔5〕。本实验表明，甲钴胺有拮抗庆大霉素的瞬时耳毒作用。在动物注射单次大剂量庆大霉素的同时，给予甲钴胺可观察到甲钴胺组动物CAP的N1及N2潜伏期，除短音4 kHz声刺激外，多无明显延长，即使在庆大霉素血清浓度峰期或半衰期间，其延长均不超过0.1 ms，而单用庆大霉素的对照组多超过0.2 ms。在统计学上，两组潜伏期的延长与注药前比较也表现了不同的显著性意义；甲钴胺组N1及N2的振幅除N1 4 kHz有微小变化外，其它的声刺激多有随注药时间的推移出现增强的现象，而对照组却出现减弱。这些结果表明，甲钴胺在激活神经纤维生理功能的同时，还有拮抗庆大霉素的瞬时耳毒作用。Keiner等〔2〕报道，谷胱苷肽-SH(GSH)可抑制经代谢的庆大霉素引发的外毛细胞病理通道的开放，从而可抑制庆大霉素的耳毒副作用。甲钴胺在转甲基的过程中直接参与了SAM代谢并产生GSH，从而实现了对庆大霉素的解毒作用。当然对于这一机制的解释，仍有待于进一步研究阐明。
, 百拇医药
参考文献
1，Aran J M,Erre J P, Avan P. Contralateral suppression of transient evoked otoacoustic emission in guinea pigs:Effect of gentamicin.Br J Audiol，1994，28:267～271
2，Keiner S, Zimmermann U. Glutathione-SH as protection from cytotoxic side effects of gentamicin-studies with isolated outer hair cells.HNO，1995，43:492～497
3，王家瑜，费刚，徐秀玲，等.甲钴胺在面神经切断后再生修复中作用的实验研究.临床耳鼻咽喉科杂志，1997，11(增刊)：20～22
4，上海康复中心临床研究协作组.甲钴胺治疗糖尿病神经病变临床观察.中华内分泌代谢杂志，1997，13：197～200
5，Watanabe T, Kaji R, Oka N,et al.Ultra high dose methylcobolamine promote nerve regeneration in expe-
rimental acrylamide neuropathy. J Neurol Sci，1994，122:140～143
(收稿 1999-03-29), 百拇医药
单位：金晓杰(上海第二医科大学附属仁济医院耳鼻咽喉科 上海，200001)；沈香然(上海第二医科大学附属仁济医院耳鼻咽喉科 上海，200001)；金西铭(上海第二医科大学附属仁济医院耳鼻咽喉科 上海，200001)
关键词：甲钴胺；庆大霉素；瞬时耳毒性
临床耳鼻咽喉科杂志000714 摘要 目的：探讨甲钴胺是否具有防治氨基甙类抗生素耳毒作用。方法：用单次肌注大剂量庆大霉素(125 mg/kg)造成感音障碍的动物模型。通过系列观察耳蜗电图的变化，观察在肌注庆大霉素的同时应用甲钴胺(1 mg/kg)是否具有拮抗庆大霉素的瞬时耳毒作用。结果：①单次大剂量庆大霉素注射，可引起动物复合动作电位CAP N1，N2潜伏期延长与振幅减弱；N1-N2间期虽有延长，变化仍在正常范围内；②单次大剂量庆大霉素注射并与甲钴胺同时用药，N1及N2的上述变化明显改善。结论：甲钴胺在增强神经纤维生理功能的同时，尚有拮抗庆大霉素的瞬时耳毒作用，这可能与甲钴胺在S-腺苷甲硫胺酸甲基化过程中产生谷胱苷肽-SH有关。
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Methylcobalamin, antagonist to transient ototoxic action of gentamicin
JIN Xiao-jie SHEN Xiang-ran JIN Xi-ming
(Department of Otorhinolaryngology,Renji Hospital,the Second Medical University,Shanghai 200001)
Abstract Objective:To explore whether is methylcobalamin effective in prophylaxis of AmAn ototoxic action.Method:We attempted to use a single injection of gentamicin(125mg/Kg b.i.w.) to make an animal (guinea pig)model of transient sensory disturbance of hearing, and by a series observation of the changes in ECochG to find out the antagonistic action of methylcobalamin which was simultaneously given to animals(1mg/Kg,i.m.)followed injection of gentamicin.Result:①The transient ototoxic action of gentamicin may cause delay of latency and diminution of amplitude of CAP N1 and N2 in animals with a single injection of gentamicin.Though the interval between N1 and N2 prolonged,the changes were still within normal ranges.②By contrast,the changes of delay at N1 and N2 as mentioned above were significantly improved in animals administered simultaneously with methylcobalamin.Conclusion:It indicated that in addition to the improvement of physiologic function of nerve fibres，methylcobalamin may be also an agent to prevent the transient ototoxic action of gentamicin .Due to methylcobalamin acts as a methyl donor ,it participates the synthesis of SAM (S-adenosylmethionine) and thus products GSH(Glutathion SH),the latter may inhibit ototoxic side-effects of gentamicin.
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Key words Methylcobalamin Gentamicin Transient ototoxic action
氨基甙类抗生素(AmAn)已被临床广泛应用，但有关其耳毒作用的防治问题仍未解决。近年来，甲钴胺的大量应用及实验研究表明，它在修复神经损伤和治疗末梢神经障碍中具有明显的效果。这就提出了一个问题，即甲钴胺在防治AmAn耳毒作用方面是否同样有效？为此，我们设计了用单次肌注大剂量庆大霉素造成感音障碍的动物模型，系列观察耳蜗电图的变化，探讨同时应用甲钴胺是否有拮抗庆大霉素耳毒的作用。报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
选择14只体重250～350 g耳廓反射正常的健康花色豚鼠，随机均分两组。甲钴胺组：用乌拉坦按
1.6 g/kg的剂量腹腔内注射麻醉后，在一次性单剂量肌注庆大霉素(125 mg/kg)的同时,按1 mg/kg剂量给予肌注甲钴胺(日本卫材株式会社驻上海办事处提供)；对照组：麻醉后仅肌注庆大霉素，剂量同甲钴胺组。
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1.2 检测方法
在用药前及用药后的15、30、45、60及75 min时，分别测定豚鼠右耳复合动作电位(CAP)。采用Nicolet信息处理机(Spirit TM,USA)引导并记录CAP。将不锈钢丝经豚鼠耳后茎乳孔插入，达面神经骨管水平段内，用作参考电极；记录电极置测试一侧耳垂处，对侧耳垂处置接地电极。用短声和频率为8、4、2 kHz的短音刺激，刺激间隔为20 ms。带通滤波为150～1 500 Hz，叠加40次，短音上升和下降时间各为2 ms，刺激强度为90 dB nHL。
1.3 扫描电镜组织学处理
在最后一次电生理测定后，立即将动物处死，取其听泡，从蜗尖和前庭窗灌入2%戊二醛固定液，浸入戊二醛固定液中。在解剖显微镜下暴露耳蜗膜迷路，经1%锇酸后固定、脱水、临界点干燥、镀金，扫描电镜下观察基底膜情况。
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注药前后各种声刺激下，N1、N2波的潜伏期变化见图1。对照组在注药后15 min时，N1波的潜伏期已出现延长，随时间的推移，延长增大。在注药30 min后，各声刺激引起的潜伏期延长均在0.1～0.2 ms；而在注药后75 min即相当于庆大霉素血清浓度的半衰期，潜伏期延长超过0.2 ms，各时间段与用药前比较均有显著性差异(P<0.05)。反之，甲钴胺组N1波潜伏期在注药后30 min内无延长，在短音刺激时，有些频率反有缩短的表现。在庆大霉素血清浓度半衰期内除4 kHz外，延长多不超过0.1 ms，各时间段与用药前比较均无显著性差异(P>0.05)。关于N2波的潜伏期，对照组在各种声刺激下各时间段的测值均有明显延长。在注药后75 min延长可达0.2～0.3 ms，与用药前比较均有显著性差异(P<0.05)；反之，甲钴胺组的测值延长均不超过0.1 ms，在半衰期时也均未超过0.2 ms，与用药前比较均无显著性差异。
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图1 甲钴胺组与对照组用药前及用药后15、30、45、60、75 min CAP N1，N2波潜伏期在click，4 kHz声刺激时的变化情况 N1e：甲钴胺组N1波，N1c：对照组N1波；N2e：甲钴胺组N2波，N2c：对照组N2波
N1-N2间期尽管有随注药后的时间推移而延长，但变异仍在正常范围内。
两组动物N1及N2波振幅变化情况见图2。对照组用庆大霉素后N1振幅除2 kHz外较用药前无明显变化外，在其它的声刺激下均出现随注药后的时间推移而振幅有逐渐减弱的现象(P<0.05)；反之，在甲钴胺组中，除4 kHz有微小变化外，在其它的声刺激下均出现随注药后时间的推移而振幅增强。对照组N2波的振幅在各种声刺激下，各时间段的测值与注药前比较均无明显变化，而甲钴胺组均随注药后时间的推移而有振幅增强的现象。
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图2 甲钴胺组与对照组用药前及用药后15、30、45、60、75 min
CAP N1，N2波振幅在click，8 kHz声刺激时的变化情况
扫描电镜观察：无论是甲钴胺组还是对照组内外毛细胞均无明显的死亡，在耳蜗底回见少量外毛细胞纤毛散乱、倒伏、脱落。
3 讨论
3.1 庆大霉素瞬时耳毒作用的机制
已有报道〔1〕，单次大剂量注射庆大霉素能引起动物内耳的瞬时耳毒作用。Keiner等〔2〕指出，庆大霉素经过代谢才对毛细胞有细胞毒性作用。本实验结果也间接提示了庆大霉素的这种瞬时耳毒作用，即在庆大霉素单次大剂量注药后，动物在15 min时已出现CAP N1和N2波潜伏期的延长与振幅的减弱。由于这种现象是在注药后的短时间内发生，显然，庆大霉素这一瞬时耳毒作用产生的机制可能与注药后的组织吸收和代谢，并经血液循环的直接扩散有关。
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N1的电位源于听神经的轴索，N2源于耳蜗核，它们分别反映了毛细胞至螺旋神经节和螺旋神经至蜗核的神经纤维放电与传导的功能。本实验N1及N2潜伏期的延长与振幅的减弱，提示单次大剂量注入已能影响听觉传入神经的放电功能或放电的神经纤维数量。实验的另一结果表明，N1-N2间期尽管有随注药后的时间推移而延长，但变异仍在正常范围内，提示了庆大霉素的瞬时耳毒作用虽可影响神经纤维的放电功能，但对神经纤维的传导功能却影响较小。Aran通过动物实验证实了单剂量庆大霉素瞬时耳毒作用的部位在外毛细胞——向内传出的突触，并可能与钙离子通道可逆性阻断作用有关〔1〕。由于传入突触的受阻，引起传入神经纤维放电功能的障碍就成为这一耳毒作用所致的必然结果。
3.2 甲钴胺的拮抗作用
甲钴胺是一种辅酶型B12，在体内代谢过程中所提供的-CH3参与生物的转甲基作用。实验表明，动物肌注甲钴胺后，药物能迅速进入神经细胞，参与神经细胞的蛋白质和磷脂的合成，因而有助于修复损伤的神经纤维，增强神经纤维的传导功能，有关的临床应用及实验研究均已有报道〔3，4〕。另外,Kikuchi通过视网膜细胞培养，观察到较长时期应用甲钴胺可保护培养中的视网膜神经元拮抗NMDA受器介导的谷胺酸神经毒性的作用，并认为这一作用或许是通过由S-腺苷甲硫胺酸(SAM)介导的甲基化而改变了细胞膜的特性所致〔5〕。本实验表明，甲钴胺有拮抗庆大霉素的瞬时耳毒作用。在动物注射单次大剂量庆大霉素的同时，给予甲钴胺可观察到甲钴胺组动物CAP的N1及N2潜伏期，除短音4 kHz声刺激外，多无明显延长，即使在庆大霉素血清浓度峰期或半衰期间，其延长均不超过0.1 ms，而单用庆大霉素的对照组多超过0.2 ms。在统计学上，两组潜伏期的延长与注药前比较也表现了不同的显著性意义；甲钴胺组N1及N2的振幅除N1 4 kHz有微小变化外，其它的声刺激多有随注药时间的推移出现增强的现象，而对照组却出现减弱。这些结果表明，甲钴胺在激活神经纤维生理功能的同时，还有拮抗庆大霉素的瞬时耳毒作用。Keiner等〔2〕报道，谷胱苷肽-SH(GSH)可抑制经代谢的庆大霉素引发的外毛细胞病理通道的开放，从而可抑制庆大霉素的耳毒副作用。甲钴胺在转甲基的过程中直接参与了SAM代谢并产生GSH，从而实现了对庆大霉素的解毒作用。当然对于这一机制的解释，仍有待于进一步研究阐明。
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参考文献
1，Aran J M,Erre J P, Avan P. Contralateral suppression of transient evoked otoacoustic emission in guinea pigs:Effect of gentamicin.Br J Audiol，1994，28:267～271
2，Keiner S, Zimmermann U. Glutathione-SH as protection from cytotoxic side effects of gentamicin-studies with isolated outer hair cells.HNO，1995，43:492～497
3，王家瑜，费刚，徐秀玲，等.甲钴胺在面神经切断后再生修复中作用的实验研究.临床耳鼻咽喉科杂志，1997，11(增刊)：20～22
4，上海康复中心临床研究协作组.甲钴胺治疗糖尿病神经病变临床观察.中华内分泌代谢杂志，1997，13：197～200
5，Watanabe T, Kaji R, Oka N,et al.Ultra high dose methylcobolamine promote nerve regeneration in expe-
rimental acrylamide neuropathy. J Neurol Sci，1994，122:140～143
(收稿 1999-03-29), 百拇医药