细胞培养用品对光透射率的影响
作者：陈祖林1 唐建民2 单治堂1 罗云生1
单位：重庆市第三军医大学 1.新桥医院普外科(400037) 2.生物物理教研室
关键词：光动力学疗法；细胞培养；透射率
中国激光医学杂志980311The Effect of Cell Culture Materials upon Light Transmittance
Chen Zulin, Shan Zhitang, Luo Yunsheng
Department of General Surgery, Xinqiao Hospital(400037)
, 百拇医药
Tang Jianmin
Department of Biophysics，The Third Military Medical University, Chongqing
摘要 为检测细胞培养用品对光透射率的影响，采用紫外分光光度计对培养瓶(板)、培养液、D-Hanks液等的透射规律和光敏剂的吸收规律进行观察。结果：对培养板(瓶)，400 nm～800 nm光可透过80%以上，200 nm～300 nm光完全不能透过。RPMI1640细胞培养液可让600 nm～800 nm光透过近100%，在575 nm附近出现明显波谷，光透射率低，可能系酚红的影响；无酚红的D-Hanks液对210 nm～800 nm光透射率无明显影响。建立了一种培养细胞接受到的激光剂量的测定计算方法。
ABSTRACT
, 百拇医药 The aim of this study is to determine the effect of cell culture materials upon light transmittance. An ultraviolet spectrophotometer was used to detect the transmittance of cell well, wall of culture flask and culture media and the absorption spectrum of photosensitizer PSD-007. The transmittance of cell well cover and the wall of culture flask are more than 80 percent at 400 nm-800 nm, close to zero between 200 nm-300 nm. The transmittance of RPMI1640 culture solution is close to 100 percent between 600 nm-800 nm. The transmission valley at 575 nm is caused by phenol red. The D-Hanks solution without phenol red has little influence on the light transmittance at 210 nm-800 nm. Our findings indicate that the transmittance of cell culture materials should be well considered to ensure accurate PDT irradiation doses. In this study a light dosimetry method has been established as well.
, 百拇医药
Key words Photodynamic therapy, Cell culture, Transmittance
在光动力学疗法(Photodynamic therapy, PDT)治疗肿瘤的基础研究中，体外培养细胞实验是常用的方法之一。由于培养的细胞易被污染和它对环境的敏感性，须无菌封闭后照射。但受培养瓶(板)、培养液的影响，照射到瓶盖上的激光剂量和培养细胞接受到的激光剂量显然不同。为更准确而有效地控制培养细胞接受到的照射剂量，我们研究培养品对光的透射规律，建立了一种细胞接受到的激光剂量的测量计算方法。
材料与方法
一、材料及液体配制
(一)D-Hanks液：NaCl 8.00 g， KCl0.40 g，Na2HPO4.12H2O 0.134 g，KH2PO4 0.06 g，NaHCO30.35 g，酚红0.02 g，加去离子三蒸馏水1 000 ml，用1 mol/L HCl或NaOH调整pH值至7.30，高压灭菌。以上试剂均为国产。
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(二)无酚红D-Hanks液：上述配方内不加酚红。
(三)RPMI1640细胞培养液：RPMI1640(美国Life Technologies, Inc.)10 g，L-Glutamine(第二军医大学)0.292 3 g，Hepes(德国)2.383 g，NaHCO3 2.0 g，加去离子三蒸馏水至1 000 ml，用1 mol/L的HCl或NaOH调整pH值为7.30，过滤灭菌，-20℃保存。用前加入青霉素和链霉素，使终浓度为100单位/ml，小牛血清(西南医院产)终浓度为10%。
(四)光敏剂：PSD-007(第二军医大学)，终浓度4 μg/ml。
(五)培养瓶(华美生物公司)，规格25 ml，壁厚1.16 mm；培养板(Corning, New York)，24孔和48孔，盖厚1.25 mm。
, 百拇医药
(六)癌细胞株：SW480结肠癌细胞株(引自美国凯特林癌症中心)。
二、方法
(一)PDT作用于癌细胞的研究中，激光直接从培养瓶(板)外照射，不改变癌细胞的内外环境，亦不会导致细胞污染。如图1。
(二)透射和吸收规律测定参照文献[1]，在UV-2201紫外可见分光光度计(日本Shimadzu)上自动扫描，各组用生理盐水和空白作对照参比。培养液与D-Hanks液的厚度为0.5 cm，扫描范围200 nm～800 nm，波长精度±0.1 nm。
(三)培养细胞接受到的激光能量计算方法：细胞实际接受的激光能量=照射到培养瓶(板)表面的光能量×培养瓶壁(板盖)透射率×培养液透射率。透射率系所用激光波长的透射率。
实验结果
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一、细胞培养瓶壁和细胞培养板盖透射光谱如图2。
二、RMPI1640培养液、含酚红的和不含酚红的D-Hanks液的透射率光谱如图3。
三、光敏剂PSD-007的吸收光谱如图4。
图1 激光照射模型
Fig.1 Diagram of laser irradiation method
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图2 培养板盖和培养瓶壁透射率 (1)培养板盖 (2)培养瓶壁
Fig.2 Transmittance of the cell well (1) and wall of culture flask(2)
图3 RPMI1640培养液和D-Hanks液的透射率 (1)RPMI1640培养液 (2)D-Hanks(含酚红) (3)D-Hanks(无酚红)
Fig.3 Transmittance of RPMI1640 (1), D-Hankssolution with phenol red(2), and without phenol red(3).
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图4 PSD-007的吸收光谱(4 μg/ml)
Fig.4 Absorption spectrum of PSD-007 (4 μg/ml)
四、单层贴壁生长的癌细胞照光功率密度
He-Ne激光波长为632.8 nm，照射到培养瓶(板盖)表面的功率密度为1.5mW/cm2。
(一)培养瓶内细胞接受的激光照射功率密度为：激光到达培养瓶表面的功率密度(1.5 mW/cm2)×培养瓶壁透射率(87.8%)×RPMI1640液透射率(99.6%)=1.31mW/cm2。
(二)培养板上细胞接受的激光照射功率密度为：激光到达培养板表面的功率密度(1.5 mW/cm2)×培养板盖透射率(80.2%)×RPMI1640液透射率(99.6%)=1.20mW/cm2。
, 百拇医药
讨 论
在PDT治疗的培养细胞实验研究中，如去掉培养基直接照射细胞，激光剂量易控制，效果好；缺点是照射时的无营养状态对癌细胞有影响，且细胞极易被污染，导致实验失败。国内外有人通过普通光滤过产生的光，采用自行设计的照射系统进行研究[2,3]，可以避免污染，且方便；但这种光源没有激光器发射光的单色性好，其生物效应可能存在差异；这种照射方法没有考虑培养瓶(板)或培养液对照射光源的影响。如采用激光为光源，从培养瓶(板)外照射，既未改变照射光源，又可防止培养细胞被污染，不需去掉培养液和对照射环境特殊处理，但要考虑培养瓶或培养板、培养液等对激光透过的影响。我们的结果表明：对培养瓶壁，350 nm～800 nm光可通过86%～88%；对培养板，光可在400 nm～800 nm波长范围内透过80%。
本实验还发现，不论是培养瓶，还是培养板，若用200 nm～300 nm激光或光照射，均完全不能通过，300 nm～350 nm光可部分通过。不同的培养液对激光透过的影响也不一致：600 nm～800 nm的光几乎可完全透过培养液到达培养细胞上；对含酚红的D-Hanks液在280 nm和RPMI1640液在560 nm左右存在明显波谷，该两处透射率极低；对RPMI1640培养液稍好，分别有28%和36%左右的光透过；若采用RPMI1640液，用300 nm～540 nm和600 nm～800 nm的光，其透射率较大；不含酚红的D-Hanks液仅在260 nm～340 nm有一平坦波谷，约4%的光未透过，在200 nm～210 nm处有较小影响。因此若采用210 nm～800 nm的光，不含酚红的D-Hanks几乎不影响激光达到培养肿瘤细胞之能量。图3显示RPMI1640液出现的几个主要波谷和波峰都与含酚红的D-Hanks液的波谷、波峰对应，说明RPMI1640培养液透射规律主要受酚红的影响。选择激光时最好不选用560 nm和280 nm左右的激光，因其透过培养液的能力较差。
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因透射率与培养液的厚度有关，测透射率曲线时，如实验中培养液的厚度为d，分光光度计中样品槽的液体厚度为d1，当d=d1时，因两者的透射率相同，可直接用分光光度计测试的结果；当d≠d1时，则要对厚度为d的培养液的透射率进行计算：先通过分光光度计测得数据，根据朗伯定律，计算出培养液的吸收系数μ。即I1/I0=e-μd1。式中I1，I0为测试品的透射率，可测出，因此μ可求出。最后通过d的透射率I1/I0=e-μd便可求出。式中μ已知，d可测出。这样，在培养物品性质相同的情况下，只要测出其厚度，就可根据该公式计算其透射率。如培养物品性质有差异，需经测试直接得出透射率；如需推广，需求得吸收系数，再根据上述公式求得透射率。
我们还对PSD-007的吸收规律进行了观察，在390 nm有一强的吸收峰，这也证实了为什么在光动力学治疗研究中采用该波段附近的光效果最佳[4]；培养瓶(板)和
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RPMI1640培养液对390 nm左右的光也有较好的通透性(透射率为50%左右)。进一步研究，红光(如632.8 nm激光)也能达到光动力学治疗要求[3]，且红光对生物组织具有较强的透射力，而其他紫外光透射能力非常差。
参 考 文 献
1.陈祖林，续正瑞，聂慧芳，等.血液成分对光的吸收规律的实验研究.中国激光，1994，21：77.
2.Laukka MA, Wang KK, Bonner JA, et al. Apoptosis occurs in lymphoma cell but not is hepatoma cells following ionizing radiation and photodynamic therapy. Dig Dis Sci, 1994, 39：2467.
3.吕发度，詹溶洲，闵红波，等.新光敏剂铝酞菁对人癌细胞系的光敏杀伤实验研究.中华肿瘤杂志，1991，13：20.
4.Pass HI. Photodynamic therapy for lung cancer. Chest Surg Clin North Am, 1991, 1：135.
(1996年7月29日收稿 1997年4月21日修回), 百拇医药(陈祖林1 唐建民2 单治堂1 罗云生1)
单位：重庆市第三军医大学 1.新桥医院普外科(400037) 2.生物物理教研室
关键词：光动力学疗法；细胞培养；透射率
中国激光医学杂志980311The Effect of Cell Culture Materials upon Light Transmittance
Chen Zulin, Shan Zhitang, Luo Yunsheng
Department of General Surgery, Xinqiao Hospital(400037)
, 百拇医药
Tang Jianmin
Department of Biophysics，The Third Military Medical University, Chongqing
摘要 为检测细胞培养用品对光透射率的影响，采用紫外分光光度计对培养瓶(板)、培养液、D-Hanks液等的透射规律和光敏剂的吸收规律进行观察。结果：对培养板(瓶)，400 nm～800 nm光可透过80%以上，200 nm～300 nm光完全不能透过。RPMI1640细胞培养液可让600 nm～800 nm光透过近100%，在575 nm附近出现明显波谷，光透射率低，可能系酚红的影响；无酚红的D-Hanks液对210 nm～800 nm光透射率无明显影响。建立了一种培养细胞接受到的激光剂量的测定计算方法。
ABSTRACT
, 百拇医药 The aim of this study is to determine the effect of cell culture materials upon light transmittance. An ultraviolet spectrophotometer was used to detect the transmittance of cell well, wall of culture flask and culture media and the absorption spectrum of photosensitizer PSD-007. The transmittance of cell well cover and the wall of culture flask are more than 80 percent at 400 nm-800 nm, close to zero between 200 nm-300 nm. The transmittance of RPMI1640 culture solution is close to 100 percent between 600 nm-800 nm. The transmission valley at 575 nm is caused by phenol red. The D-Hanks solution without phenol red has little influence on the light transmittance at 210 nm-800 nm. Our findings indicate that the transmittance of cell culture materials should be well considered to ensure accurate PDT irradiation doses. In this study a light dosimetry method has been established as well.
, 百拇医药
Key words Photodynamic therapy, Cell culture, Transmittance
在光动力学疗法(Photodynamic therapy, PDT)治疗肿瘤的基础研究中，体外培养细胞实验是常用的方法之一。由于培养的细胞易被污染和它对环境的敏感性，须无菌封闭后照射。但受培养瓶(板)、培养液的影响，照射到瓶盖上的激光剂量和培养细胞接受到的激光剂量显然不同。为更准确而有效地控制培养细胞接受到的照射剂量，我们研究培养品对光的透射规律，建立了一种细胞接受到的激光剂量的测量计算方法。
材料与方法
一、材料及液体配制
(一)D-Hanks液：NaCl 8.00 g， KCl0.40 g，Na2HPO4.12H2O 0.134 g，KH2PO4 0.06 g，NaHCO30.35 g，酚红0.02 g，加去离子三蒸馏水1 000 ml，用1 mol/L HCl或NaOH调整pH值至7.30，高压灭菌。以上试剂均为国产。
, http://www.100md.com
(二)无酚红D-Hanks液：上述配方内不加酚红。
(三)RPMI1640细胞培养液：RPMI1640(美国Life Technologies, Inc.)10 g，L-Glutamine(第二军医大学)0.292 3 g，Hepes(德国)2.383 g，NaHCO3 2.0 g，加去离子三蒸馏水至1 000 ml，用1 mol/L的HCl或NaOH调整pH值为7.30，过滤灭菌，-20℃保存。用前加入青霉素和链霉素，使终浓度为100单位/ml，小牛血清(西南医院产)终浓度为10%。
(四)光敏剂：PSD-007(第二军医大学)，终浓度4 μg/ml。
(五)培养瓶(华美生物公司)，规格25 ml，壁厚1.16 mm；培养板(Corning, New York)，24孔和48孔，盖厚1.25 mm。
, 百拇医药
(六)癌细胞株：SW480结肠癌细胞株(引自美国凯特林癌症中心)。
二、方法
(一)PDT作用于癌细胞的研究中，激光直接从培养瓶(板)外照射，不改变癌细胞的内外环境，亦不会导致细胞污染。如图1。
(二)透射和吸收规律测定参照文献[1]，在UV-2201紫外可见分光光度计(日本Shimadzu)上自动扫描，各组用生理盐水和空白作对照参比。培养液与D-Hanks液的厚度为0.5 cm，扫描范围200 nm～800 nm，波长精度±0.1 nm。
(三)培养细胞接受到的激光能量计算方法：细胞实际接受的激光能量=照射到培养瓶(板)表面的光能量×培养瓶壁(板盖)透射率×培养液透射率。透射率系所用激光波长的透射率。
实验结果
, http://www.100md.com
一、细胞培养瓶壁和细胞培养板盖透射光谱如图2。
二、RMPI1640培养液、含酚红的和不含酚红的D-Hanks液的透射率光谱如图3。
三、光敏剂PSD-007的吸收光谱如图4。
图1 激光照射模型
Fig.1 Diagram of laser irradiation method
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图2 培养板盖和培养瓶壁透射率 (1)培养板盖 (2)培养瓶壁
Fig.2 Transmittance of the cell well (1) and wall of culture flask(2)
图3 RPMI1640培养液和D-Hanks液的透射率 (1)RPMI1640培养液 (2)D-Hanks(含酚红) (3)D-Hanks(无酚红)
Fig.3 Transmittance of RPMI1640 (1), D-Hankssolution with phenol red(2), and without phenol red(3).
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图4 PSD-007的吸收光谱(4 μg/ml)
Fig.4 Absorption spectrum of PSD-007 (4 μg/ml)
四、单层贴壁生长的癌细胞照光功率密度
He-Ne激光波长为632.8 nm，照射到培养瓶(板盖)表面的功率密度为1.5mW/cm2。
(一)培养瓶内细胞接受的激光照射功率密度为：激光到达培养瓶表面的功率密度(1.5 mW/cm2)×培养瓶壁透射率(87.8%)×RPMI1640液透射率(99.6%)=1.31mW/cm2。
(二)培养板上细胞接受的激光照射功率密度为：激光到达培养板表面的功率密度(1.5 mW/cm2)×培养板盖透射率(80.2%)×RPMI1640液透射率(99.6%)=1.20mW/cm2。
, 百拇医药
讨 论
在PDT治疗的培养细胞实验研究中，如去掉培养基直接照射细胞，激光剂量易控制，效果好；缺点是照射时的无营养状态对癌细胞有影响，且细胞极易被污染，导致实验失败。国内外有人通过普通光滤过产生的光，采用自行设计的照射系统进行研究[2,3]，可以避免污染，且方便；但这种光源没有激光器发射光的单色性好，其生物效应可能存在差异；这种照射方法没有考虑培养瓶(板)或培养液对照射光源的影响。如采用激光为光源，从培养瓶(板)外照射，既未改变照射光源，又可防止培养细胞被污染，不需去掉培养液和对照射环境特殊处理，但要考虑培养瓶或培养板、培养液等对激光透过的影响。我们的结果表明：对培养瓶壁，350 nm～800 nm光可通过86%～88%；对培养板，光可在400 nm～800 nm波长范围内透过80%。
本实验还发现，不论是培养瓶，还是培养板，若用200 nm～300 nm激光或光照射，均完全不能通过，300 nm～350 nm光可部分通过。不同的培养液对激光透过的影响也不一致：600 nm～800 nm的光几乎可完全透过培养液到达培养细胞上；对含酚红的D-Hanks液在280 nm和RPMI1640液在560 nm左右存在明显波谷，该两处透射率极低；对RPMI1640培养液稍好，分别有28%和36%左右的光透过；若采用RPMI1640液，用300 nm～540 nm和600 nm～800 nm的光，其透射率较大；不含酚红的D-Hanks液仅在260 nm～340 nm有一平坦波谷，约4%的光未透过，在200 nm～210 nm处有较小影响。因此若采用210 nm～800 nm的光，不含酚红的D-Hanks几乎不影响激光达到培养肿瘤细胞之能量。图3显示RPMI1640液出现的几个主要波谷和波峰都与含酚红的D-Hanks液的波谷、波峰对应，说明RPMI1640培养液透射规律主要受酚红的影响。选择激光时最好不选用560 nm和280 nm左右的激光，因其透过培养液的能力较差。
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因透射率与培养液的厚度有关，测透射率曲线时，如实验中培养液的厚度为d，分光光度计中样品槽的液体厚度为d1，当d=d1时，因两者的透射率相同，可直接用分光光度计测试的结果；当d≠d1时，则要对厚度为d的培养液的透射率进行计算：先通过分光光度计测得数据，根据朗伯定律，计算出培养液的吸收系数μ。即I1/I0=e-μd1。式中I1，I0为测试品的透射率，可测出，因此μ可求出。最后通过d的透射率I1/I0=e-μd便可求出。式中μ已知，d可测出。这样，在培养物品性质相同的情况下，只要测出其厚度，就可根据该公式计算其透射率。如培养物品性质有差异，需经测试直接得出透射率；如需推广，需求得吸收系数，再根据上述公式求得透射率。
我们还对PSD-007的吸收规律进行了观察，在390 nm有一强的吸收峰，这也证实了为什么在光动力学治疗研究中采用该波段附近的光效果最佳[4]；培养瓶(板)和
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RPMI1640培养液对390 nm左右的光也有较好的通透性(透射率为50%左右)。进一步研究，红光(如632.8 nm激光)也能达到光动力学治疗要求[3]，且红光对生物组织具有较强的透射力，而其他紫外光透射能力非常差。
参 考 文 献
1.陈祖林，续正瑞，聂慧芳，等.血液成分对光的吸收规律的实验研究.中国激光，1994，21：77.
2.Laukka MA, Wang KK, Bonner JA, et al. Apoptosis occurs in lymphoma cell but not is hepatoma cells following ionizing radiation and photodynamic therapy. Dig Dis Sci, 1994, 39：2467.
3.吕发度，詹溶洲，闵红波，等.新光敏剂铝酞菁对人癌细胞系的光敏杀伤实验研究.中华肿瘤杂志，1991，13：20.
4.Pass HI. Photodynamic therapy for lung cancer. Chest Surg Clin North Am, 1991, 1：135.
(1996年7月29日收稿 1997年4月21日修回), 百拇医药(陈祖林1 唐建民2 单治堂1 罗云生1)