医用可降解材料聚乙醇酸与脊髓生物相容性实验研究
作者：朱兴华 邓传宗 王晓冬 张沛云 顾晓松
单位：朱兴华 邓传宗(南通医学院附属医院外科，南通226001)；王晓冬 张沛云 顾晓松(南通医学院神经科学研究所)
关键词：聚乙醇酸；脊髓；生物相容性；大鼠
南通医学院学院000404 [摘 要] 目的：探索医用可降解材料聚乙醇酸(Polyglycolic Acid,PGA)与大鼠中枢神经系统脊髓的生物相容性。方法：取成年SD大鼠行腰1脊髓左半切洞损伤，植入医用可降解材料聚乙醇酸纤维，术后分期取聚乙醇酸纤维行改良三色染色，同时部分标本用抗GFAP单抗，抗NF单抗免疫组织化学特异性染色胶质细胞和神经轴突。结果：脊髓胶质细胞及神经元突起附着PGA纤维迁移生长，随着时间延长，PGA纤维上细胞数量增多，神经突起长度增加，生长状态活跃。结论：医用可降解材料聚乙醇酸与大鼠脊髓组织有较好的生物相容性。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)04-0331-03
THE BIOCOMPATIBILITY OF POLYGLYCOLIC ACID AS MEDICINE-DEGRADABLE WITH RAT SPINAL CORD
ZHU Xinghua,DENG Chuanzong,WANG Xiaodong,et al
(Department of Surgery,the Affiliated Hospital,Nantong Medical College,Nantong226001))
[Abstract] Objective:To investigate the biocompatibitity of polyglycolic acid(PGA) with adult rat spinal cord.Methods:21 adult sprague-Dawley rat spinal cords were transected halfly at the L1 level and 2.5mm long unilateral cavities were surgically created,where PGA Filaments were transplanted.The morphological outcomes were evaluated with modified trichrome staining and immunohistochemistry using antibodies against glial fibrillary acidic protein and neurofilament three weeks later.Results:many glias and neurites grew vigorously on PGA Filament.With the time going,the quantity of glias and the length of neurites increased.Conclusion:PGA has good biocompatibility with adult rat spinal cord.
, 百拇医药
[Key words] Polyglycolic acid;Spinal cord;Biocompatibility;rats
脊髓损伤后的再生修复研究是当今神经生物学研究的热点课题之一。近年来随着脑移植成功经验的启示，人们先后采用周围神经和胚胎脊髓进行脊髓内移植，对脊髓损伤神经元急性替代和提供“桥性结构”，在一定程度上促进和引导了神经轴突的再生和延伸[1，2]。但由于存在供体来源和伦理学问题的限制，这一研究受到很大影响。这就促使人们探索运用新型材料修复脊髓损伤。故我们将医用可降解材料聚乙醇酸植入大鼠脊髓，观察其与中枢神经系统脊髓的生物相容性，为进一步研究人工材料修复脊髓损伤提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 医用可降解材料聚乙醇酸为乙醇酸的二聚体经聚合反应而成，将其制成纤维状，直径12.5μm，长度2.5mm。
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1.2 脊髓半切洞损伤模型及PGA移植 取SD大鼠21只，戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，背部剪毛、消毒，后正中切开皮肤，椎板切除暴露脊髓，腰1脊髓左半横断，微型吸管吸取少量脊髓组织形成长2.5mm洞腔，植入PGA纤维，缝合硬脊膜及皮肤。分别于移植术后1周、2周、3周各取大鼠7只戊巴比妥钠腹腔内麻醉，经心灌注多聚甲醛，取出脊髓在解剖镜下取出PGA纤维，分别进行以下检查。
1.3 改良三色染色 将PGA纤维标本入Harris苏木素液染色5min，双蒸水洗5min后，三色液染色30min，3%冰醋酸冲洗后再流水冲洗至不褪色，脱水透明封片，光镜观察。
1.4 免疫组织化学染色 将PGA纤维标本用含2%羊血清，2%小牛血清白蛋白包被液包被30min，分别加入1∶8小鼠抗GFAP单克隆抗体，1∶50抗NF单克隆抗体(Siqma公司)各50μl，室温下36h，然后加入HRP标记的1∶500羊抗小鼠抗体(Gibco公司)各50μl，室温下4h，DAB呈色。以上每步间均用PBS液清洗。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 脊髓大体标本观察 PGA纤维与大鼠脊髓不同程度整合，3周时尤为紧密。PGA与外周组织无粘连，移植处无明显疤痕和空洞形成，脊髓背正中血管清晰可见。
2.2 改良三色染色 PGA纤维上有大量胶质细胞附着生长，胞体类圆形，胞浆丰富呈蓝紫色，核呈紫红色。2周、3周时较1周时细胞数量增多，与PGA结合紧密，见图1。
图1 改良三色染色：PGA植入2周，胶质细胞附着于PGA上，核呈紫红色，胞浆蓝紫色×400
2.3 免疫组织化学染色 GFAP组化染色显示棕褐色细胞附着于PGA纤维上，呈类圆形或梭形，串珠状生长，部分细胞有明显突起，偶见梭形细胞跨于两PGA之间，细胞与PGA结合紧密，生长状态旺盛，见图2。2周时NF染色显示棕褐色的神经突起附着于PGA生长延伸，3周时延伸长度明显增加，见图3。
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图2 GFAP免疫组织化学染色：PGA植入2周，棕褐色的星形胶质细胞附着PGA生长×400
图3 NF免疫组织化学染色：PGA植入2周，神经突起沿PGA迁移生长×400
3 讨 论
成年哺乳动物中枢神经元在早期分化完成后，仍保留着再生潜力，可以沿脑和脊髓内由非神经细胞形成的向导通路发出神经突起，在损伤部位重建新的神经联系[3]。神经损伤后，切断的神经轴突发芽可能向各个方向生长，为了使尽可能多的发芽纤维生长到原来的靶组织和靶器官，通过在损伤部位植入一段桥接物，为再生轴突提供跨越缺损的桥梁，这就是神经修复研究中的“桥梁性作用”。
聚乙醇酸又叫聚乙交脂，是乙醇酸二聚体经聚合反应而成的聚合物，抗原性小，在生物体内可逐渐降解吸收，分解为羟基乙酸，一部分经肾脏由尿排出体外，另一部分在肝脏经三羧酸循环代谢为二氧化碳和水。Vacamti等[4]利用PGA支架进行软骨细胞培养，发现PGA提供的三维空间有利于软骨细胞的生长、分裂、增殖。张沛云等[5]通过PGA与大鼠背根神经节体外联合培养，观察到大量雪旺氏细胞及神经突起附着于PGA，生长活跃。证实PGA与大鼠周围神经组织具有良好的生物相容性。Gautier等[6]将聚乳酸乙醇酸复合纤维植入大鼠脊髓，2周时发现其与脊髓良好整合，并发现NF阳性纤维附着于PGA。
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免疫组织细胞化学是近年来鉴别中枢神经系统不同肽类或神经递质神经元神经胶质的一种新手段，用不同抗体通过免疫反应可以检测移植物中不同的细胞及神经突起。本实验中将PGA纤维植入大鼠脊髓后，可见PGA与脊髓良好整合，GFAP阳性的胶质细胞附着于PGA纤维活跃生长，2周时可见NF阳性神经纤维沿PGA延伸，3周时延伸长度增加，结果提示人工生物材料聚乙醇酸与大鼠脊髓具有较好的生物相容性。
国家杰出青年科学基金资助项目(编号39425006)，江苏省教委青蓝工程资助项目
[参考文献]
[1] Cheng H,Cao Y,Olson L,et al.Spinal cord repair in adult paraplegic:partial restoration of hind limb function[J]. Science,1996,273(5274)∶510.
, http://www.100md.com
[2] Zhao G,Liao W,Cai J.Recovery of motor function of spinal cord with embryonic spinal cord graft in adult rat[J].Chung Kuo Hsiu Fu Chung Chien Wai Ko Tsa Chih,1997,11(6)∶332.
[3] Guth L,et al.Essentiality of a specific cellular terrain for growth of axons into a spinal cord Lession[J].Exp Neurol,1985,88∶1.
[4] Vacamti CA,Larger R,Schlco B,et al.Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a teuydate for new cartilag formation[J].Plast Reconstr Surg,1991,88∶753.
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[5] 张沛云，王晓冬，顾晓松，等.背根神经节与医用可降解材料聚乙醇酸纤维联合培养的实验研究[J].中华显微外科杂志，2000,23∶49.
[6] Gautier SE,Oudega M,Fragoso M,et al.Poly(alpha-hydroxyacids)for application in the spinal cord:resorbability and biocompatibility with adult rat schwann cells and spinal cord[J].J Biomed Mater Res,1998,42(4)∶642.
(收稿日期：2000-07-10), 百拇医药
单位：朱兴华 邓传宗(南通医学院附属医院外科，南通226001)；王晓冬 张沛云 顾晓松(南通医学院神经科学研究所)
关键词：聚乙醇酸；脊髓；生物相容性；大鼠
南通医学院学院000404 [摘 要] 目的：探索医用可降解材料聚乙醇酸(Polyglycolic Acid,PGA)与大鼠中枢神经系统脊髓的生物相容性。方法：取成年SD大鼠行腰1脊髓左半切洞损伤，植入医用可降解材料聚乙醇酸纤维，术后分期取聚乙醇酸纤维行改良三色染色，同时部分标本用抗GFAP单抗，抗NF单抗免疫组织化学特异性染色胶质细胞和神经轴突。结果：脊髓胶质细胞及神经元突起附着PGA纤维迁移生长，随着时间延长，PGA纤维上细胞数量增多，神经突起长度增加，生长状态活跃。结论：医用可降解材料聚乙醇酸与大鼠脊髓组织有较好的生物相容性。
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[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)04-0331-03
THE BIOCOMPATIBILITY OF POLYGLYCOLIC ACID AS MEDICINE-DEGRADABLE WITH RAT SPINAL CORD
ZHU Xinghua,DENG Chuanzong,WANG Xiaodong,et al
(Department of Surgery,the Affiliated Hospital,Nantong Medical College,Nantong226001))
[Abstract] Objective:To investigate the biocompatibitity of polyglycolic acid(PGA) with adult rat spinal cord.Methods:21 adult sprague-Dawley rat spinal cords were transected halfly at the L1 level and 2.5mm long unilateral cavities were surgically created,where PGA Filaments were transplanted.The morphological outcomes were evaluated with modified trichrome staining and immunohistochemistry using antibodies against glial fibrillary acidic protein and neurofilament three weeks later.Results:many glias and neurites grew vigorously on PGA Filament.With the time going,the quantity of glias and the length of neurites increased.Conclusion:PGA has good biocompatibility with adult rat spinal cord.
, 百拇医药
[Key words] Polyglycolic acid;Spinal cord;Biocompatibility;rats
脊髓损伤后的再生修复研究是当今神经生物学研究的热点课题之一。近年来随着脑移植成功经验的启示，人们先后采用周围神经和胚胎脊髓进行脊髓内移植，对脊髓损伤神经元急性替代和提供“桥性结构”，在一定程度上促进和引导了神经轴突的再生和延伸[1，2]。但由于存在供体来源和伦理学问题的限制，这一研究受到很大影响。这就促使人们探索运用新型材料修复脊髓损伤。故我们将医用可降解材料聚乙醇酸植入大鼠脊髓，观察其与中枢神经系统脊髓的生物相容性，为进一步研究人工材料修复脊髓损伤提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 医用可降解材料聚乙醇酸为乙醇酸的二聚体经聚合反应而成，将其制成纤维状，直径12.5μm，长度2.5mm。
, http://www.100md.com
1.2 脊髓半切洞损伤模型及PGA移植 取SD大鼠21只，戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，背部剪毛、消毒，后正中切开皮肤，椎板切除暴露脊髓，腰1脊髓左半横断，微型吸管吸取少量脊髓组织形成长2.5mm洞腔，植入PGA纤维，缝合硬脊膜及皮肤。分别于移植术后1周、2周、3周各取大鼠7只戊巴比妥钠腹腔内麻醉，经心灌注多聚甲醛，取出脊髓在解剖镜下取出PGA纤维，分别进行以下检查。
1.3 改良三色染色 将PGA纤维标本入Harris苏木素液染色5min，双蒸水洗5min后，三色液染色30min，3%冰醋酸冲洗后再流水冲洗至不褪色，脱水透明封片，光镜观察。
1.4 免疫组织化学染色 将PGA纤维标本用含2%羊血清，2%小牛血清白蛋白包被液包被30min，分别加入1∶8小鼠抗GFAP单克隆抗体，1∶50抗NF单克隆抗体(Siqma公司)各50μl，室温下36h，然后加入HRP标记的1∶500羊抗小鼠抗体(Gibco公司)各50μl，室温下4h，DAB呈色。以上每步间均用PBS液清洗。
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2 结 果
2.1 脊髓大体标本观察 PGA纤维与大鼠脊髓不同程度整合，3周时尤为紧密。PGA与外周组织无粘连，移植处无明显疤痕和空洞形成，脊髓背正中血管清晰可见。
2.2 改良三色染色 PGA纤维上有大量胶质细胞附着生长，胞体类圆形，胞浆丰富呈蓝紫色，核呈紫红色。2周、3周时较1周时细胞数量增多，与PGA结合紧密，见图1。
图1 改良三色染色：PGA植入2周，胶质细胞附着于PGA上，核呈紫红色，胞浆蓝紫色×400
2.3 免疫组织化学染色 GFAP组化染色显示棕褐色细胞附着于PGA纤维上，呈类圆形或梭形，串珠状生长，部分细胞有明显突起，偶见梭形细胞跨于两PGA之间，细胞与PGA结合紧密，生长状态旺盛，见图2。2周时NF染色显示棕褐色的神经突起附着于PGA生长延伸，3周时延伸长度明显增加，见图3。
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图2 GFAP免疫组织化学染色：PGA植入2周，棕褐色的星形胶质细胞附着PGA生长×400
图3 NF免疫组织化学染色：PGA植入2周，神经突起沿PGA迁移生长×400
3 讨 论
成年哺乳动物中枢神经元在早期分化完成后，仍保留着再生潜力，可以沿脑和脊髓内由非神经细胞形成的向导通路发出神经突起，在损伤部位重建新的神经联系[3]。神经损伤后，切断的神经轴突发芽可能向各个方向生长，为了使尽可能多的发芽纤维生长到原来的靶组织和靶器官，通过在损伤部位植入一段桥接物，为再生轴突提供跨越缺损的桥梁，这就是神经修复研究中的“桥梁性作用”。
聚乙醇酸又叫聚乙交脂，是乙醇酸二聚体经聚合反应而成的聚合物，抗原性小，在生物体内可逐渐降解吸收，分解为羟基乙酸，一部分经肾脏由尿排出体外，另一部分在肝脏经三羧酸循环代谢为二氧化碳和水。Vacamti等[4]利用PGA支架进行软骨细胞培养，发现PGA提供的三维空间有利于软骨细胞的生长、分裂、增殖。张沛云等[5]通过PGA与大鼠背根神经节体外联合培养，观察到大量雪旺氏细胞及神经突起附着于PGA，生长活跃。证实PGA与大鼠周围神经组织具有良好的生物相容性。Gautier等[6]将聚乳酸乙醇酸复合纤维植入大鼠脊髓，2周时发现其与脊髓良好整合，并发现NF阳性纤维附着于PGA。
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免疫组织细胞化学是近年来鉴别中枢神经系统不同肽类或神经递质神经元神经胶质的一种新手段，用不同抗体通过免疫反应可以检测移植物中不同的细胞及神经突起。本实验中将PGA纤维植入大鼠脊髓后，可见PGA与脊髓良好整合，GFAP阳性的胶质细胞附着于PGA纤维活跃生长，2周时可见NF阳性神经纤维沿PGA延伸，3周时延伸长度增加，结果提示人工生物材料聚乙醇酸与大鼠脊髓具有较好的生物相容性。
国家杰出青年科学基金资助项目(编号39425006)，江苏省教委青蓝工程资助项目
[参考文献]
[1] Cheng H,Cao Y,Olson L,et al.Spinal cord repair in adult paraplegic:partial restoration of hind limb function[J]. Science,1996,273(5274)∶510.
, http://www.100md.com
[2] Zhao G,Liao W,Cai J.Recovery of motor function of spinal cord with embryonic spinal cord graft in adult rat[J].Chung Kuo Hsiu Fu Chung Chien Wai Ko Tsa Chih,1997,11(6)∶332.
[3] Guth L,et al.Essentiality of a specific cellular terrain for growth of axons into a spinal cord Lession[J].Exp Neurol,1985,88∶1.
[4] Vacamti CA,Larger R,Schlco B,et al.Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a teuydate for new cartilag formation[J].Plast Reconstr Surg,1991,88∶753.
, http://www.100md.com
[5] 张沛云，王晓冬，顾晓松，等.背根神经节与医用可降解材料聚乙醇酸纤维联合培养的实验研究[J].中华显微外科杂志，2000,23∶49.
[6] Gautier SE,Oudega M,Fragoso M,et al.Poly(alpha-hydroxyacids)for application in the spinal cord:resorbability and biocompatibility with adult rat schwann cells and spinal cord[J].J Biomed Mater Res,1998,42(4)∶642.
(收稿日期：2000-07-10), 百拇医药