不同药物抗风疹病毒的实验研究
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山东医科大学学报 2000年第2期第38卷 论著
作者：宋艳艳 王志玉 钟蒙 王桂亭 许洪芝 刘培曼
单位：宋艳艳 王志玉 钟蒙 王桂亭 许洪芝(山东医科大学病毒学研究室)；刘培曼(山东医科大学无机化学教研室)
关键词：腺嘌呤衍生物；尿嘧啶衍生物；大黄；风疹病毒；抗病毒作用
山东医科大学学报000214
摘 要：目的：为筛选有效的抗RV药物。方法：选用9种新合成的腺嘌呤衍生物、6种尿嘧啶衍生物及大黄醇提液，分别在BHK21、RNC和HNC细胞上进行了体外抗病毒试验。在BHK21上以CPE为观察指标，在RNC和HNC上因不出现明显的CPE，则将细胞培养物转种于BHK2l细胞并用间接免疫荧光和免疫酶技术检测药物的抗病毒效应。结果：取代基为—CH2—C6H5、—(CH2)2OH、—C6H5—CH3的腺嘌呤衍生物及取代基为—CH3、—(CH2)2OH、—C6H5—CH3、—C6H5—Cl的尿嘧啶衍生物，对RVJR-23的最小抑毒剂量在78～625mg/L之间；大黄醇提液对RVJR-23的最小抑毒剂量为5000mg/L。结论：上述药物均有抗RV作用，大黄醇提液的作用较新合成的部分腺嘌呤与尿嘧啶衍生物更为明显，且毒性小。
, 百拇医药
分类号：Q526+·2；Q526+·1；R373·1+1；R978·7 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0151-05
STUDY ON ANTI-RUBELLA VIRUS ACTIONS OF DIFFERENT DRUGS
SONG Yan-yan ,WANG Zhi-yu ,ZHONG Meng
(Dept.of Virology，Shandong Medical University)
Abstract：Objective:To find new effective anti-rubella virus drugs. Methods:Anti-rubella virus actions of synthesized adenine and uridine derivants and ethanol extract of rhubarb were studied in three kinds of cell cultures. CPE was used as observation index in BHK21 cell culture. In view of no obvious CPE in primary rabbit cerebral cell cultures and that of human foetus, the anti-viral actiorns of rhubarb in RNC and HNC were examined with trans-inoculating to BHK21 cell, indirect fluorescence and enzyme immunological technique. Results:The active replacement radicals for adenine and uridine derivants are—CH2—C6H5、—(CH2)2OH and—C6H5—CH3 in Derivant A and—CH3,—(CH2)2OH,—C6H5—CH3 and—C6H5P—Cl in Derivant U, their minimum inhibition doses to RV JR-23 range from 78 to 625mg/L. For ethanol extract of rhubarb, the minimum inhibitory dose to RV JR-23 is 5000mg/L. Conclusiou: All drugs mentioned above exhibited antiviral action. Ethanol extract of rhubarb showed more obvious than synthesized adenine and uridine derivants,but did not show cytotoxiclty.
, 百拇医药
Keywords：Adenine derivants;Uridine derivants;Rhubarb;Rubella virus;Anti-viral action 风疹病毒(rubellavirus,RV)是人类重要致病病毒之一，可引起胎儿宫内感染，发生先天风疹综合征(CRS)，或感染中枢神经系统造成感染后脑炎和进行性全脑炎(PRPE)[1]。目前，尽管已有减毒活疫苗应用于人群，但是对妊娠妇女及其他已感染者不适宜。因此，寻求有效的抗RV药物具有非常重要的意义。
我们利用多种细胞，对中药大黄及腺嘌呤、尿嘌呤衍生物(DerivantAandB)的体外抗病毒作用进行了实验研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞BHK21细胞，引自卫生部北京生物制品研究所，用Eagle培养基常规传代。乳兔和人胚脑神经细胞(RNC,HNC)按本室建立的方法进行[2]。
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1.1.2病毒标准野毒珠RVGOS-10引自卫生部北京生物制品研究所，滴度为106.25TCID50/ml，地方野毒株RVJR-23由本室分离[3]，滴度为106.0TCID50/ml，实验用100TCID50/ml。
1.1.3实验动物3～5日龄新西兰乳兔，购自山东省实验动物中心。
1.1.4人胚来自意外受伤孕妇保胎无效的流产胎儿(孕龄3～5个月)。
1.1.5药物
1.1.5.1大黄醇提液及其成分鉴定用95%的乙醇浸泡大黄过夜，加热提取2次，2h/次，合并提取液减压浓缩，在无菌条件下自然挥发至干，再用Hanks液配成100g/L的溶液。取少量大黄醇提液滴于干净滤纸上，待自然挥发干时，滴入10%NaOH溶液，滤纸变为紫红色，证明为葸醌类[4]。-20℃保存备用。
, 百拇医药
1.1.5.2腺嘌呤及尿嘧啶衍生物由本校无机化学教研室合成。无环鸟苷和三氮唑核苷由上海第六制药厂生产。实验时用Hanks液配制。
1.1.5.3阿糖胞苷为上海第十二制药厂产品。胰岛素为上海生化制药厂产品。
1.1.6抗体
1.6.1兔抗RV抗体本室自制，血凝抑制抗体滴度为1：160，工作浓度为1：10。
1.6.2羊抗兔IgG荧光抗体卫生部上海生物制品研究所产品，工作浓度为1：20。
1.6.3羊抗兔IgG酶标抗体(HRP-IgG)卫生部北京生物制品研究所产品，工作浓度为1：40。
1.2方法
1.2.1细胞毒性实验在96孔培养板中加入BHK21细胞悬液及不同浓度的药物，每一浓度设4孔，同时设正常细胞对照，37℃培养120h，每日观察细胞形态变化。
, 百拇医药
1.2.2药物抗RV实验
1.2.2.1药物对RV所致细胞病变作用(cytopathogeniceffect，CPE)的影响于96孔培养板中加入细胞悬液、病毒液及不同浓度的药物，37℃培养。当病毒对照出现明显CPE(++++)时，判定结果。
1.2.2.2药物对RV增殖的抑制作用选择RNC和HNC生长良好的细胞瓶，其中半数装有盖玻片，在接种PV的同时，加入不同浓度的药物，37℃培养168h。取出盖玻片，无水乙醇固定，进行间接免疫荧光染色[2]及间接酶标抗体染色，观察病毒抗原的分布。将无盖玻片的细胞瓶于-40℃冻融2次，将药物浓度相同的培养物合并，转种于BHK21细胞进行病毒滴定。
1.2.2.3大黄醇提液阻止RV复制的动力学测定选择生长良好的单层细胞，以加入10000mg/L的大黄醇提液及RV为实验组，病毒对照组不加药物，同时设细胞对照，37℃培养，分别于0、6、12、24、48、72、96、120、144和168h时取出盖玻片，无水乙醇固定，进行间接免疫荧光染色及间接酶标抗体染色，观察感染不同持续时间与荧光强度及显色深浅之间的关系。
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1.2.3间接酶标抗体染色用3%H2O2甲醇固定10min，PBS缓冲液洗涤3次，0.83g/L牛白蛋白覆盖10min，加兔抗RV抗体4℃过夜，PBS洗涤3次，加羊抗兔HRP-IgG15min，加底物显色15min，自来水冲洗，封片观察。
2结果
2.1各种药物对BHK21细胞的毒性作用大黄醇提液每一浓度对细胞无毒性作用，细胞生长良好，与对照组无差异。而各种腺嘌呤和尿嘧啶衍生物对细胞均有不同程度的毒性作用(见表1)。
表1.腺嘌呤、尿嘧啶衍生物对BHK21细胞的毒性作用及其抗RV作用
注：A为腺嘌呤(adenine)，U为尿嘧啶(uridine)
2.2大黄醇提液、腺嘌呤和尿嘧啶衍生物对RV所致CPE的抑制作用将不同浓度的药物、RV和BHK21细胞一同培养，当病毒对照CPE达++++时，判定结果。发现大黄醇提液有明显的抗RV作用，对RVGOS-10和RVJR-23的最小抑制剂量分别为10000mg/L和5000mg/L(见图1)；9种腺嘌呤衍生物中，当取代基为、—(CH2)2OH和时对RV有一定的抑制作用，其最小抑毒浓度分别为78mg/L、312mg/L和78mg/L，但其抑毒效果不如大黄醇提液及阳性对照药稳定；尿嘧啶衍生物中，当取代基为—OH3、—(CH2)OH、和时对RV有较弱的抑制作用，其他各种衍生物的抗RV作用不明显，各种合成药物对RVGOS-10和RVJR-23的作用无明显差异(见表1)。
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图1大黄醇提液抗RV作用
A：BHK21细胞感染RV96h，出现明显CPE，细胞变圆、聚集(×120)
B：BHK21细胞接种RV的同时加入大黄醇提液(10000mg/L)，未见CPE出现(×200)
Fig.1And-RVactionofethanol-extractofrhubarb
A:BHK21cellwereinfectedwithRVfor96hourswithobviouscytopathiceffect.Thecellsbecameroundandgathering
B:10000mg/Lofethanol-extractofrhubarbwasaddedt0BHK21cellsatthetimeofinfectionwithRV.Cytopathiceffectwasnotfound(×120)
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2.3大黄醇提液在RNC及HNC中的抗RV作用
2.3.1病毒感染RNC后，加入不同浓度的大黄醇提液，培养14d，无明显CPE(见图2、图3)。经反复冻融转种BHK21细胞，并进行滴定，发现当大黄浓度为10000mg/L时，有明显的抑制RV产生CPE作用，且其病毒滴度也明显减低(见表2、表3)。
图2正常HNC
Fig.2Normalhumancerebralnervecells
图3HNC感染RV14天，未见CPE
Fig.3HNCwereinfectedwithRVfor14days.Cvtopathiceffectwasnotfound
表2大黄醇提液在RNC上对RV增殖的抑制作用
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2.3.2取相应药物浓度的细胞片，固定后进行间接免疫荧光染色，发现大黄醇提液浓度在1000mg/L以下时，荧光强度与病毒对照相似，均可见核周明显荧光，当药物浓度为5000mg/L时，荧光减弱，当其浓度为10000～20000mg/L时，荧光进一步减弱。而细胞对照染色均匀，无明显的核周围荧光颗粒(见图4、表2)。
图4RNC感染RV144h，荧光染色后可见明显荧光
Fig.4RNCwereinfectedwithRVfor144h.Obviousfluoreswasfoundbyindirectfluorescencestaining
2.3.3将感染RV并同时加入不同浓度大黄醇提液的HNC细胞片取出，固定后进行间接酶标染色。结果细胞对照结构清晰，不显色，而病毒对照细胞核周围可见明显黄色，且以胶质细胞更为明显。各药物组酶标检测与荧光染色结果相同(见图5、表3)。
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图5HNC感染RV144h，酶染后明显着色
Fig.5HNCwereinfectedwithRVfor144h.Colourcanbeseenwithenzymestaining
表3大黄醇提液在HNC上对RV增殖的抑制作用
2.4大黄醇提液阻止RV复制的动态观察在RV感染RNC和HNC的同时，加入10000mg/L大黄醇提液，取出不同培养时间的细胞片，固定后经间接免疫荧光染色及间接酶标抗体技术检测，两项检测结果吻合。发现在短时间内，加药物组与病毒对照组相似，且6h即可见较弱荧光，细胞形态清楚，核清晰可见，核周围荧光增强；120h后药物组的荧光强度比病毒对照组明显减弱。RVJ23株与GOS-10株结果相似(见表4)。细胞对照荧光弱且均匀。
表4大黄醇提液(10000mg/L)阻止RV在RNC中复制的动态观察
, 百拇医药
3讨论
BHK21细胞是检测RV最敏感的细胞之一，RV感染BHK21细胞后，细胞变圆，但不破碎，有明显聚集现象，其CPE特异，容易观察。因此，CPE可作为观察药物抗RV作用的有效指标。当药物对病毒增殖有抑制作用时，不出现CPE。出现CPE，则说明药物无抗病毒作用。
病毒增殖周期的关键在于其核酸和蛋白质合成。而选用腺嘌呤和尿嘧啶衍生物的目的在于其经酶的作用，磷酰基化后，以假底物参与病毒核酸代谢，引起错误转录和翻译，导译病毒失活。实验结果表明，9种腺嘌呤衍生物中，只有当取代基为和时有明显的抗病毒作用，提示该三种取代基为抗病毒的活性基团，而前两种对于HSV的增殖也有较强的抑制作用[5]，说明其可干扰多种病毒的增殖。6种尿嘧啶衍生物中，只有取代基为—CH3、—(CH2)2OH，和时，有一定的抗病毒作用，但抗病毒作用较弱。提示除了要有活性基团，尚需有一定的空间结构才能更好地发挥抗病毒作用。
, http://www.100md.com 无环鸟苷对DNA病毒有明显的抑制作用。本实验结果表明其对RV的增殖也有明显的抑制作用，提示其不仅是DNA病毒良好的抑制剂，而且对某些RNA病毒也可能有抑制作用。
多次实验结果表明，大黄醇提液在各种培养细胞上对RV的增殖均有明显的抑制作用，且与药物浓度间存在剂量反应关系。以往研究证实大黄醇提液对HSV、VZV的增殖具有较强的抑制作用[6]，证明其抗病毒谱较广，对RNA病毒、DNA病毒均有作用。大黄醇提液纯属中药制剂，毒副作用小，而抗病毒西药均有明显的毒性作用。因此，抗病毒中药制剂具有良好的开发应用价值。经检验，大黄醇提液中的有效抗病毒成分为蒽醌类，但其抗病毒作用机理尚有待进一步研究。
基金项目：山东省卫生厅资助课题
参考文献：
[1]Goyle P K and Wolonsky J S.Charaeterization of immune complexes in Progyessive Rubella Panencephalitis[J].Ann Neurol,1981,9:557
, 百拇医药
[2]王志玉，姚苹，宋艳艳，等.风疹病毒在原代兔脑神经细胞中的增殖[J].预防医学文献信息，1996，2(3)：257
[3]韩世杰，王桂亭，周树安，等.风疹病毒的分离[J].山东医科大学学报，1985，(23)：22
[4]中药科学院上海药物所编.中草药有效成分提取与分离[M]，上海：上海科技出版社，1981.18.
[5]王志玉，王桂亭，许洪芝，等.9-(N4')0取代乙醛缩氨基硫脲)腺嘌呤衍生物的体外抗病毒作用[J].山东医科大学学报，1995，33(1)：28
[6]王芃，解砚英，王元书，等.中药大黄抗病毒作用的实验研究[J].山东医科大学学报，1996，34(2)：166
收稿日期：1999-04-09, 百拇医药
单位：宋艳艳 王志玉 钟蒙 王桂亭 许洪芝(山东医科大学病毒学研究室)；刘培曼(山东医科大学无机化学教研室)
关键词：腺嘌呤衍生物；尿嘧啶衍生物；大黄；风疹病毒；抗病毒作用
山东医科大学学报000214
摘 要：目的：为筛选有效的抗RV药物。方法：选用9种新合成的腺嘌呤衍生物、6种尿嘧啶衍生物及大黄醇提液，分别在BHK21、RNC和HNC细胞上进行了体外抗病毒试验。在BHK21上以CPE为观察指标，在RNC和HNC上因不出现明显的CPE，则将细胞培养物转种于BHK2l细胞并用间接免疫荧光和免疫酶技术检测药物的抗病毒效应。结果：取代基为—CH2—C6H5、—(CH2)2OH、—C6H5—CH3的腺嘌呤衍生物及取代基为—CH3、—(CH2)2OH、—C6H5—CH3、—C6H5—Cl的尿嘧啶衍生物，对RVJR-23的最小抑毒剂量在78～625mg/L之间；大黄醇提液对RVJR-23的最小抑毒剂量为5000mg/L。结论：上述药物均有抗RV作用，大黄醇提液的作用较新合成的部分腺嘌呤与尿嘧啶衍生物更为明显，且毒性小。
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分类号：Q526+·2；Q526+·1；R373·1+1；R978·7 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0151-05
STUDY ON ANTI-RUBELLA VIRUS ACTIONS OF DIFFERENT DRUGS
SONG Yan-yan ,WANG Zhi-yu ,ZHONG Meng
(Dept.of Virology，Shandong Medical University)
Abstract：Objective:To find new effective anti-rubella virus drugs. Methods:Anti-rubella virus actions of synthesized adenine and uridine derivants and ethanol extract of rhubarb were studied in three kinds of cell cultures. CPE was used as observation index in BHK21 cell culture. In view of no obvious CPE in primary rabbit cerebral cell cultures and that of human foetus, the anti-viral actiorns of rhubarb in RNC and HNC were examined with trans-inoculating to BHK21 cell, indirect fluorescence and enzyme immunological technique. Results:The active replacement radicals for adenine and uridine derivants are—CH2—C6H5、—(CH2)2OH and—C6H5—CH3 in Derivant A and—CH3,—(CH2)2OH,—C6H5—CH3 and—C6H5P—Cl in Derivant U, their minimum inhibition doses to RV JR-23 range from 78 to 625mg/L. For ethanol extract of rhubarb, the minimum inhibitory dose to RV JR-23 is 5000mg/L. Conclusiou: All drugs mentioned above exhibited antiviral action. Ethanol extract of rhubarb showed more obvious than synthesized adenine and uridine derivants,but did not show cytotoxiclty.
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Keywords：Adenine derivants;Uridine derivants;Rhubarb;Rubella virus;Anti-viral action 风疹病毒(rubellavirus,RV)是人类重要致病病毒之一，可引起胎儿宫内感染，发生先天风疹综合征(CRS)，或感染中枢神经系统造成感染后脑炎和进行性全脑炎(PRPE)[1]。目前，尽管已有减毒活疫苗应用于人群，但是对妊娠妇女及其他已感染者不适宜。因此，寻求有效的抗RV药物具有非常重要的意义。
我们利用多种细胞，对中药大黄及腺嘌呤、尿嘌呤衍生物(DerivantAandB)的体外抗病毒作用进行了实验研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞BHK21细胞，引自卫生部北京生物制品研究所，用Eagle培养基常规传代。乳兔和人胚脑神经细胞(RNC,HNC)按本室建立的方法进行[2]。
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1.1.2病毒标准野毒珠RVGOS-10引自卫生部北京生物制品研究所，滴度为106.25TCID50/ml，地方野毒株RVJR-23由本室分离[3]，滴度为106.0TCID50/ml，实验用100TCID50/ml。
1.1.3实验动物3～5日龄新西兰乳兔，购自山东省实验动物中心。
1.1.4人胚来自意外受伤孕妇保胎无效的流产胎儿(孕龄3～5个月)。
1.1.5药物
1.1.5.1大黄醇提液及其成分鉴定用95%的乙醇浸泡大黄过夜，加热提取2次，2h/次，合并提取液减压浓缩，在无菌条件下自然挥发至干，再用Hanks液配成100g/L的溶液。取少量大黄醇提液滴于干净滤纸上，待自然挥发干时，滴入10%NaOH溶液，滤纸变为紫红色，证明为葸醌类[4]。-20℃保存备用。
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1.1.5.2腺嘌呤及尿嘧啶衍生物由本校无机化学教研室合成。无环鸟苷和三氮唑核苷由上海第六制药厂生产。实验时用Hanks液配制。
1.1.5.3阿糖胞苷为上海第十二制药厂产品。胰岛素为上海生化制药厂产品。
1.1.6抗体
1.6.1兔抗RV抗体本室自制，血凝抑制抗体滴度为1：160，工作浓度为1：10。
1.6.2羊抗兔IgG荧光抗体卫生部上海生物制品研究所产品，工作浓度为1：20。
1.6.3羊抗兔IgG酶标抗体(HRP-IgG)卫生部北京生物制品研究所产品，工作浓度为1：40。
1.2方法
1.2.1细胞毒性实验在96孔培养板中加入BHK21细胞悬液及不同浓度的药物，每一浓度设4孔，同时设正常细胞对照，37℃培养120h，每日观察细胞形态变化。
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1.2.2药物抗RV实验
1.2.2.1药物对RV所致细胞病变作用(cytopathogeniceffect，CPE)的影响于96孔培养板中加入细胞悬液、病毒液及不同浓度的药物，37℃培养。当病毒对照出现明显CPE(++++)时，判定结果。
1.2.2.2药物对RV增殖的抑制作用选择RNC和HNC生长良好的细胞瓶，其中半数装有盖玻片，在接种PV的同时，加入不同浓度的药物，37℃培养168h。取出盖玻片，无水乙醇固定，进行间接免疫荧光染色[2]及间接酶标抗体染色，观察病毒抗原的分布。将无盖玻片的细胞瓶于-40℃冻融2次，将药物浓度相同的培养物合并，转种于BHK21细胞进行病毒滴定。
1.2.2.3大黄醇提液阻止RV复制的动力学测定选择生长良好的单层细胞，以加入10000mg/L的大黄醇提液及RV为实验组，病毒对照组不加药物，同时设细胞对照，37℃培养，分别于0、6、12、24、48、72、96、120、144和168h时取出盖玻片，无水乙醇固定，进行间接免疫荧光染色及间接酶标抗体染色，观察感染不同持续时间与荧光强度及显色深浅之间的关系。
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1.2.3间接酶标抗体染色用3%H2O2甲醇固定10min，PBS缓冲液洗涤3次，0.83g/L牛白蛋白覆盖10min，加兔抗RV抗体4℃过夜，PBS洗涤3次，加羊抗兔HRP-IgG15min，加底物显色15min，自来水冲洗，封片观察。
2结果
2.1各种药物对BHK21细胞的毒性作用大黄醇提液每一浓度对细胞无毒性作用，细胞生长良好，与对照组无差异。而各种腺嘌呤和尿嘧啶衍生物对细胞均有不同程度的毒性作用(见表1)。
表1.腺嘌呤、尿嘧啶衍生物对BHK21细胞的毒性作用及其抗RV作用
注：A为腺嘌呤(adenine)，U为尿嘧啶(uridine)
2.2大黄醇提液、腺嘌呤和尿嘧啶衍生物对RV所致CPE的抑制作用将不同浓度的药物、RV和BHK21细胞一同培养，当病毒对照CPE达++++时，判定结果。发现大黄醇提液有明显的抗RV作用，对RVGOS-10和RVJR-23的最小抑制剂量分别为10000mg/L和5000mg/L(见图1)；9种腺嘌呤衍生物中，当取代基为、—(CH2)2OH和时对RV有一定的抑制作用，其最小抑毒浓度分别为78mg/L、312mg/L和78mg/L，但其抑毒效果不如大黄醇提液及阳性对照药稳定；尿嘧啶衍生物中，当取代基为—OH3、—(CH2)OH、和时对RV有较弱的抑制作用，其他各种衍生物的抗RV作用不明显，各种合成药物对RVGOS-10和RVJR-23的作用无明显差异(见表1)。
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图1大黄醇提液抗RV作用
A：BHK21细胞感染RV96h，出现明显CPE，细胞变圆、聚集(×120)
B：BHK21细胞接种RV的同时加入大黄醇提液(10000mg/L)，未见CPE出现(×200)
Fig.1And-RVactionofethanol-extractofrhubarb
A:BHK21cellwereinfectedwithRVfor96hourswithobviouscytopathiceffect.Thecellsbecameroundandgathering
B:10000mg/Lofethanol-extractofrhubarbwasaddedt0BHK21cellsatthetimeofinfectionwithRV.Cytopathiceffectwasnotfound(×120)
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2.3大黄醇提液在RNC及HNC中的抗RV作用
2.3.1病毒感染RNC后，加入不同浓度的大黄醇提液，培养14d，无明显CPE(见图2、图3)。经反复冻融转种BHK21细胞，并进行滴定，发现当大黄浓度为10000mg/L时，有明显的抑制RV产生CPE作用，且其病毒滴度也明显减低(见表2、表3)。
图2正常HNC
Fig.2Normalhumancerebralnervecells
图3HNC感染RV14天，未见CPE
Fig.3HNCwereinfectedwithRVfor14days.Cvtopathiceffectwasnotfound
表2大黄醇提液在RNC上对RV增殖的抑制作用
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2.3.2取相应药物浓度的细胞片，固定后进行间接免疫荧光染色，发现大黄醇提液浓度在1000mg/L以下时，荧光强度与病毒对照相似，均可见核周明显荧光，当药物浓度为5000mg/L时，荧光减弱，当其浓度为10000～20000mg/L时，荧光进一步减弱。而细胞对照染色均匀，无明显的核周围荧光颗粒(见图4、表2)。
图4RNC感染RV144h，荧光染色后可见明显荧光
Fig.4RNCwereinfectedwithRVfor144h.Obviousfluoreswasfoundbyindirectfluorescencestaining
2.3.3将感染RV并同时加入不同浓度大黄醇提液的HNC细胞片取出，固定后进行间接酶标染色。结果细胞对照结构清晰，不显色，而病毒对照细胞核周围可见明显黄色，且以胶质细胞更为明显。各药物组酶标检测与荧光染色结果相同(见图5、表3)。
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图5HNC感染RV144h，酶染后明显着色
Fig.5HNCwereinfectedwithRVfor144h.Colourcanbeseenwithenzymestaining
表3大黄醇提液在HNC上对RV增殖的抑制作用
2.4大黄醇提液阻止RV复制的动态观察在RV感染RNC和HNC的同时，加入10000mg/L大黄醇提液，取出不同培养时间的细胞片，固定后经间接免疫荧光染色及间接酶标抗体技术检测，两项检测结果吻合。发现在短时间内，加药物组与病毒对照组相似，且6h即可见较弱荧光，细胞形态清楚，核清晰可见，核周围荧光增强；120h后药物组的荧光强度比病毒对照组明显减弱。RVJ23株与GOS-10株结果相似(见表4)。细胞对照荧光弱且均匀。
表4大黄醇提液(10000mg/L)阻止RV在RNC中复制的动态观察
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3讨论
BHK21细胞是检测RV最敏感的细胞之一，RV感染BHK21细胞后，细胞变圆，但不破碎，有明显聚集现象，其CPE特异，容易观察。因此，CPE可作为观察药物抗RV作用的有效指标。当药物对病毒增殖有抑制作用时，不出现CPE。出现CPE，则说明药物无抗病毒作用。
病毒增殖周期的关键在于其核酸和蛋白质合成。而选用腺嘌呤和尿嘧啶衍生物的目的在于其经酶的作用，磷酰基化后，以假底物参与病毒核酸代谢，引起错误转录和翻译，导译病毒失活。实验结果表明，9种腺嘌呤衍生物中，只有当取代基为和时有明显的抗病毒作用，提示该三种取代基为抗病毒的活性基团，而前两种对于HSV的增殖也有较强的抑制作用[5]，说明其可干扰多种病毒的增殖。6种尿嘧啶衍生物中，只有取代基为—CH3、—(CH2)2OH，和时，有一定的抗病毒作用，但抗病毒作用较弱。提示除了要有活性基团，尚需有一定的空间结构才能更好地发挥抗病毒作用。
, http://www.100md.com 无环鸟苷对DNA病毒有明显的抑制作用。本实验结果表明其对RV的增殖也有明显的抑制作用，提示其不仅是DNA病毒良好的抑制剂，而且对某些RNA病毒也可能有抑制作用。
多次实验结果表明，大黄醇提液在各种培养细胞上对RV的增殖均有明显的抑制作用，且与药物浓度间存在剂量反应关系。以往研究证实大黄醇提液对HSV、VZV的增殖具有较强的抑制作用[6]，证明其抗病毒谱较广，对RNA病毒、DNA病毒均有作用。大黄醇提液纯属中药制剂，毒副作用小，而抗病毒西药均有明显的毒性作用。因此，抗病毒中药制剂具有良好的开发应用价值。经检验，大黄醇提液中的有效抗病毒成分为蒽醌类，但其抗病毒作用机理尚有待进一步研究。
基金项目：山东省卫生厅资助课题
参考文献：
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, 百拇医药
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收稿日期：1999-04-09, 百拇医药