薄层扫描法测定凤香乐外用海绵条中苦参碱的含量
作者：陶涛
单位：广州市胸科医院 广州 510095
关键词：苦参碱 薄层扫描法 凤香乐外用海绵条
广东药学000616 摘要 用薄层扫描法测定凤香乐外用海绵条中苦参碱的含量。线性范围1.5～4.5μg，r=0.9993(n=5)，加样回收率100.3%，RSD=3.37%(n=7)。方法准确，可靠。
凤香乐外用海绵条是中药三类新药，该品是浸渍了地龙、苦参、黄柏、丁香、蛇床子等7味药材混合提取液的黄色外用海绵药条。具有清热湿，止痒杀虫功效。
本方中苦参为君药，苦参主要含苦参碱等生物碱成分[1]，对苦参碱采用薄层扫描法进行含量测定[2、3、4]，结果较为满意。
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1 仪器与试药
瑞士CAMAG薄层点样仪，薄层扫描仪。
样品及阴性对照品由广州兴华药厂提供；苦参碱对照品由中国药品生物制品检定所提供；苦参药材购自广州市药材公司，经鉴定符合中国药典(95版)一部规定；硅胶G为青岛海洋化工厂生产；中性氧化铝为薄层层析用规格；所有试剂均为分析纯。
2 溶液制备
2.1 对照品溶液的制备 精密称取室温真空干燥至恒重的苦参碱对照品适量，加甲醇溶解，使成浓度0.5mg/ml，即得。
2.2 供试品溶液的制备 取本品5枚，用石油醚150ml(30～60℃)浸没，水浴回流2h，弃去石油醚，药条吹干，加碱性氯仿150ml(3ml浓氨水→250ml氯仿)浸没，时时振摇，2h后，倾出浸出液，继加碱性氯仿200ml浸泡过夜(16h以上)，合并浸出液，将药条逐一放入30ml医用玻璃注射器内，每枚分别用30ml碱性氯仿分3次洗涤，挤干，用氯仿洗涤容器合并浸出液及洗涤液，水浴浓缩至干。残留物用少量氯仿转移至已处理好的中性氧化铝柱上，用氯仿250ml洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，回收氯仿并浓缩至干，残留物用甲醇溶解，定量转移至1ml量瓶内，并稀释至刻度，摇匀，即得。
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2.3 阴性对照品溶液的制备 取缺苦参药材的样品5枚，照供试品溶液制备方法处理，即得。
3 实验条件及其考察
3.1 色谱条件 硅胶G薄层板：以3%CMC-Na中含有2%NaOH为粘合剂，苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)为展开剂，改良碘化铋钾溶液-无水乙醇(2∶1)为显色剂，将薄层板浸于显色剂中1秒，冷风吹干，至斑点清晰，于100%湿度环境中放置1.5h至底色为米黄色。
3.2 扫描条件 λs=510nm，λr=650nm，Sx=3，双波长反射法锯齿扫描。
3.3 色谱分离度及干扰因素的考察 对空白样品溶液进行了测定，结果在苦参碱相应的位置上无吸收；供试品溶液得到分离度良好的色谱图。见图1。
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图1 薄层色谱图
①药材 ②苦参碱对照品 ③阴性对照品 ④⑤样品
3.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液3、4、7、8、9μl，分别点于同一薄层板上，展开，显色，测定。以斑点峰面积积分值A为纵坐标，点样量X(μg)为横坐标作图，得一直线，回归方程为：A=6019.21+5735.94X r=0.9993 n=5。
3.5 稳定性考察 苦参碱为双喹嗪类生物碱，因其本身无紫外吸收，故参照文献[2]用改良碘化铋钾显色后，扫描测定，其显色后可见光吸收图谱λmax于510nm处，与文献报道相符。
用无水乙醇-改良碘化铋钾溶液(2∶1)浸板显色后，薄层板背景色为橙黄，而苦参碱斑点色为橙红，背景色与斑点色反差较小，且背景吸收较大，扫描灵敏度小，基线不平。经反复试验，发现显色好的薄层板于空气中放置一段时间后，待显色剂中碘挥散尽，使背景变成米黄色后，再扫描，此时基线平稳，灵敏度提高，扫描图谱见图2。
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经观察在70%～80%湿度环境中放置时间4h，在100%湿度环境中放置时间1.5h。
3.6 精密度试验 取6份同一供试液3μl，点于同一薄层板上和分别点于6块薄层板上，测定，计算，结果同板的RSD为1.9%，异板的RSD为4.2%。
图2 苦参碱显色后扫描图谱
3.7 回收率试验 取已知含量药条5枚，加入苦参碱对照品0.57mg，按溶液制备项下的供试品溶液制备方法操作，按样品测定项下方法测定。结果平均回收率为100.3%，RSD=3.37%，n=7。
4 样品测定
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精密吸取供试品溶液3μl，对照品溶液3μl与4μl，分别交叉点于同一薄层板上，展开，取出，冷风吹干，于显色剂中浸渍1秒，取出，冷风吹干，至斑点清晰，于100%湿度环境中放置1.5h后，用另一干净玻璃覆盖，并用胶布将四周封闭、固定，扫描测定。用外标两点法计算苦参碱含量，本品含苦参碱(G15H24N2O)计算，测定结果见表1。
5 讨论
5.1 对于苦参碱的显色，我们曾参考文献用改良碘化铋钾溶液喷雾，发现重现性较差，扫描基线不稳，经反复实验，我们改用无水乙醇-改良碘化铋钾溶液(2∶1)浸板显色，显色后的薄层板底色均一，扫描基线平稳，此法设备简单，重现性良好。
表1 样品中苦参碱含量测定结果 批号
每克生药中含苦参碱量(mg)
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每枚中含苦参
碱量(mg)
1
0.059
0.118
2
0.060
0.120
3
0.083
0.166
4
0.054
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0.108
5
0.069
0.138
6
0.095
0.190
7
0.104
0.208
5.2 对色谱条件摸索，我们曾试用中性固定相、碱性固定相、酸性固定相，结果发现在固定相中加入NaOH，苦参碱的Rf值变小，斑点扩散减小，扫描精度提高，同时也增强了苦参碱在固定相中的稳定性，为浸板显色创造条件。
, 百拇医药
参考文献
1，江苏新医学院编.中药大辞典(上册).上海科学技术出版社，1977：1283
2，中国药典(95版)一部.1995：176
3，陈勇，甄汉深，等.薄层扫描法测定桂林西瓜霜喷剂中靛玉红和苦参碱的含量.中成药.1998，20(7)：13
4，黄老金，黄小鸥，等.薄层扫描法测定妇阴净中苦参碱的含量.广西医学.1997，19(4)：555
收稿日期：1999-09-19
修回日期：2000-09-08, http://www.100md.com
单位：广州市胸科医院 广州 510095
关键词：苦参碱 薄层扫描法 凤香乐外用海绵条
广东药学000616 摘要 用薄层扫描法测定凤香乐外用海绵条中苦参碱的含量。线性范围1.5～4.5μg，r=0.9993(n=5)，加样回收率100.3%，RSD=3.37%(n=7)。方法准确，可靠。
凤香乐外用海绵条是中药三类新药，该品是浸渍了地龙、苦参、黄柏、丁香、蛇床子等7味药材混合提取液的黄色外用海绵药条。具有清热湿，止痒杀虫功效。
本方中苦参为君药，苦参主要含苦参碱等生物碱成分[1]，对苦参碱采用薄层扫描法进行含量测定[2、3、4]，结果较为满意。
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1 仪器与试药
瑞士CAMAG薄层点样仪，薄层扫描仪。
样品及阴性对照品由广州兴华药厂提供；苦参碱对照品由中国药品生物制品检定所提供；苦参药材购自广州市药材公司，经鉴定符合中国药典(95版)一部规定；硅胶G为青岛海洋化工厂生产；中性氧化铝为薄层层析用规格；所有试剂均为分析纯。
2 溶液制备
2.1 对照品溶液的制备 精密称取室温真空干燥至恒重的苦参碱对照品适量，加甲醇溶解，使成浓度0.5mg/ml，即得。
2.2 供试品溶液的制备 取本品5枚，用石油醚150ml(30～60℃)浸没，水浴回流2h，弃去石油醚，药条吹干，加碱性氯仿150ml(3ml浓氨水→250ml氯仿)浸没，时时振摇，2h后，倾出浸出液，继加碱性氯仿200ml浸泡过夜(16h以上)，合并浸出液，将药条逐一放入30ml医用玻璃注射器内，每枚分别用30ml碱性氯仿分3次洗涤，挤干，用氯仿洗涤容器合并浸出液及洗涤液，水浴浓缩至干。残留物用少量氯仿转移至已处理好的中性氧化铝柱上，用氯仿250ml洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，回收氯仿并浓缩至干，残留物用甲醇溶解，定量转移至1ml量瓶内，并稀释至刻度，摇匀，即得。
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2.3 阴性对照品溶液的制备 取缺苦参药材的样品5枚，照供试品溶液制备方法处理，即得。
3 实验条件及其考察
3.1 色谱条件 硅胶G薄层板：以3%CMC-Na中含有2%NaOH为粘合剂，苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)为展开剂，改良碘化铋钾溶液-无水乙醇(2∶1)为显色剂，将薄层板浸于显色剂中1秒，冷风吹干，至斑点清晰，于100%湿度环境中放置1.5h至底色为米黄色。
3.2 扫描条件 λs=510nm，λr=650nm，Sx=3，双波长反射法锯齿扫描。
3.3 色谱分离度及干扰因素的考察 对空白样品溶液进行了测定，结果在苦参碱相应的位置上无吸收；供试品溶液得到分离度良好的色谱图。见图1。
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图1 薄层色谱图
①药材 ②苦参碱对照品 ③阴性对照品 ④⑤样品
3.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液3、4、7、8、9μl，分别点于同一薄层板上，展开，显色，测定。以斑点峰面积积分值A为纵坐标，点样量X(μg)为横坐标作图，得一直线，回归方程为：A=6019.21+5735.94X r=0.9993 n=5。
3.5 稳定性考察 苦参碱为双喹嗪类生物碱，因其本身无紫外吸收，故参照文献[2]用改良碘化铋钾显色后，扫描测定，其显色后可见光吸收图谱λmax于510nm处，与文献报道相符。
用无水乙醇-改良碘化铋钾溶液(2∶1)浸板显色后，薄层板背景色为橙黄，而苦参碱斑点色为橙红，背景色与斑点色反差较小，且背景吸收较大，扫描灵敏度小，基线不平。经反复试验，发现显色好的薄层板于空气中放置一段时间后，待显色剂中碘挥散尽，使背景变成米黄色后，再扫描，此时基线平稳，灵敏度提高，扫描图谱见图2。
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经观察在70%～80%湿度环境中放置时间4h，在100%湿度环境中放置时间1.5h。
3.6 精密度试验 取6份同一供试液3μl，点于同一薄层板上和分别点于6块薄层板上，测定，计算，结果同板的RSD为1.9%，异板的RSD为4.2%。
图2 苦参碱显色后扫描图谱
3.7 回收率试验 取已知含量药条5枚，加入苦参碱对照品0.57mg，按溶液制备项下的供试品溶液制备方法操作，按样品测定项下方法测定。结果平均回收率为100.3%，RSD=3.37%，n=7。
4 样品测定
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精密吸取供试品溶液3μl，对照品溶液3μl与4μl，分别交叉点于同一薄层板上，展开，取出，冷风吹干，于显色剂中浸渍1秒，取出，冷风吹干，至斑点清晰，于100%湿度环境中放置1.5h后，用另一干净玻璃覆盖，并用胶布将四周封闭、固定，扫描测定。用外标两点法计算苦参碱含量，本品含苦参碱(G15H24N2O)计算，测定结果见表1。
5 讨论
5.1 对于苦参碱的显色，我们曾参考文献用改良碘化铋钾溶液喷雾，发现重现性较差，扫描基线不稳，经反复实验，我们改用无水乙醇-改良碘化铋钾溶液(2∶1)浸板显色，显色后的薄层板底色均一，扫描基线平稳，此法设备简单，重现性良好。
表1 样品中苦参碱含量测定结果 批号
每克生药中含苦参碱量(mg)
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每枚中含苦参
碱量(mg)
1
0.059
0.118
2
0.060
0.120
3
0.083
0.166
4
0.054
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0.108
5
0.069
0.138
6
0.095
0.190
7
0.104
0.208
5.2 对色谱条件摸索，我们曾试用中性固定相、碱性固定相、酸性固定相，结果发现在固定相中加入NaOH，苦参碱的Rf值变小，斑点扩散减小，扫描精度提高，同时也增强了苦参碱在固定相中的稳定性，为浸板显色创造条件。
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参考文献
1，江苏新医学院编.中药大辞典(上册).上海科学技术出版社，1977：1283
2，中国药典(95版)一部.1995：176
3，陈勇，甄汉深，等.薄层扫描法测定桂林西瓜霜喷剂中靛玉红和苦参碱的含量.中成药.1998，20(7)：13
4，黄老金，黄小鸥，等.薄层扫描法测定妇阴净中苦参碱的含量.广西医学.1997，19(4)：555
收稿日期：1999-09-19
修回日期：2000-09-08, http://www.100md.com