骨骼肌冰冻切片和酶组织化学技术在肌病诊断中的应用
作者：吕海东 杨彬 郜建伟 秦东香 马晓丽 李树林 张林洁
单位：吕海东 杨彬 郜建伟 秦东香 马晓丽 李树林(河南省焦作市人民医院神经内科 454002)；张林洁(河南省焦作市第二人民医院 454005)
关键词：骨骼肌；冰冻切片；酶组化染色；诊断价值
中国现代医学杂志001022 目的：观察骨骼肌疾病的肌肉标本在冰冻片和酶组织化学染色中的病理学改变。方法：将肌肉标本放入液氮中，速冻固定，冰冻切片，进行组织化学染色和酶组织化学的病理观察。结果：70例骨骼肌标本，有异常改变者45例，骨骼肌酶组织化学染色，有群组化现象16例，GT染色发现破碎红边纤维2例，ORO染色发现脂质增多4例。结论：骨骼肌冰冻切片可更加清晰地显示骨骼肌纤维的结构，能完好地保留骨骼肌酶的活性，酶组织化学染色可显示骨骼肌酶学变化的肌纤维的分型，有利于提高对肌病的认识和诊断水平，对骨骼肌疾病的诊断有很大的临床实用价值，值得推广应用。
, 百拇医药
分类号 R746
骨骼肌病理检查是肌病诊断中的一种重要检查方法，特别是近年来，骨骼肌冰冻切片和酶组织化学染色技术的开展和电镜检查的应用，使其在肌病诊断过程中，起着越来越重要的作用。本文总结了我科近3年来，采用液氮速冻固定，冰冻切片和酶组织化学染色技术，对70例肌肉标本进行病理学检查结果，分析讨论其病理改变及其在临床诊断 的价值。
1 资料和方法
1.1 临床资料
男48例，女22例，年龄4～66岁。临床表现有肌无力56例，伴肌肉萎缩43例，伴肌肉疼痛11例，发作性肌无力6例。临床诊断：进行性肌营养不良症11例，肌萎缩侧索硬化症8例，脊肌萎缩症6例，多发性肌炎/皮肌炎8例，颈椎病8例，重症肌无力6例，周期性麻痹5例，肌强直1例。诊断不明者17例。
, 百拇医药 1.2 方法和材料
1.2.1 取材 所有病例均选中等程度受累的骨骼肌为活检部位，在局麻下切开皮肤及皮下组织，分离肌组织约0.5cm×0.5cm×1.0cm，两端结扎后切断，将标本放置冰壶中送实验室检查。本组70例病人中，取材于股四头肌41例，肱二头肌11例，腓肠肌8例，三角肌6例，尺侧腕屈肌4例。
1.2.2 固定和制片 将标本从冰壶中取出，分成不等的两部分，将其中2/3部分用沙布包裹后，迅速投放入液氮罐中，速冻固定，10min后，将其取出，放入恒冷箱式冰冻切片机中，待肌肉标本的温度回升到恒冷水冻切片机内的温度时(-20℃～-30℃)，再行厚度为8～10μm的冰冻切片，然后将切好的片子放入冰箱冷冻室内待染，切剩余的标本再放回液氮罐中保存。将另外1/3标本再分成两部分，其中一部分放入10%福尔马林溶液中固定(备用作石蜡切片)，另一部分放入2%戊二醛中固定(备用作电镜包埋检查)。
1.2.3 组织化学染色 除常规HE染色外，将作组织化学染色和酶组织化学染色。组织化学染色包括：改良Gomeri三色(GT)、油红O脂肪染色(ORO)、糖原染色(PAS)。骨骼肌酶组化染色包括：肌球蛋白腺苷三磷酸酶(ATP酶)，还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶(NADH-TR)，其中ATP酶染色时，将分别作PH值为4.2，4.4，10.6，10.8时，不同pH值的染色[1～3]。
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2 结果
70例骨骼肌标本病理学检查结果为：有异常改变者45例，其中符合肌源性损害者22例，神经源性损害者19例，有典型的肌间“淋巴溢”现象5例，炎性病变9例，伴束周萎缩4例。骨骼肌酶组织化学染色，有群组化现象16例，其中大群组化现象11例。GT染色发现破碎红边纤维(RRF)2例。ORO染色发现脂质增多4例，其中脂质沉积1例。肌肉病理未见特征性改变者25例。
结合临床表现及实验室检查，诊断进行性肌营养不良症12例，其中Dunchenne型肌营养不良症9例，肢带型肌营养不良症2例，远端型肌营养不良症1例。诊断运动神经元病9例，其中肌萎缩侧索硬化症5例，脊肌萎缩症4例。诊断多发性肌炎2例，皮肌炎4例。颈椎病7例，重症肌无力5例，类固醇肌病2例，神经性肌强直1例，萎缩性肌强直1例，脂质沉积性肌病1例，平山氏病1例。
3 讨论
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以往人们对肌病的诊断主要依靠肌电图和血清肌酶谱检查，但绝大多数肌病患者，肌电图均表现为肌原性损害，血清肌酶谱有不同程度的升高，所以，骨骼肌疾病的临床定性诊断十分困难。过去即使有少数病人作了肌肉活检，也都是传统的石蜡包埋切片，单纯HE染色。由于这种石蜡包埋切片的制作过程，受到固定、脱水、包埋和热处理等多种因素的影响，骨骼肌酶的活性均早已失活，难以进行组织化学染色和骨骼肌酶学观察。我们现在所采用的液氮速冻固定，恒冷冰冻切片，避免了以上诸多因素的影响，很好地保留了骨骼肌酶的活性。通过骨骼肌酶与非酶组织化学染色技术，即可清晰地显示出在各种骨骼肌疾病中，两型肌纤维的分布情况及各种特征性的病理改变。
骨骼组织在冷冻过程中极易产生冰晶，所以，标本的冷冻过程是作好肌肉活检的关键，目前国内普遍采用的方法是，先用液氮将异戊烷冷冻至-155℃～-160℃，再将肌肉标本放入异戊烷中速冻10s，然后取出用锡纸包裹或装入纱布袋中，再放入液氮罐中保存，但仍时有冰晶产生[2，3]。我们采用的方法是将骨骼肌标本先放入纱布包中，不用异戊烷，直接放入液氮罐中速冻固定。由于标本预先装入纱布袋中，避免了将冻好的标本在空气中停留的过程，所以很少产生冰晶。此方法在国内未见有文献报道。
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我们通过对70例骨骼肌标本的病理学观察，认为ATP酶染色法为区分Ⅰ、Ⅱ型肌纤维的最佳方法，NADH-TR染色法次之，它们均可显示神经再支配所引起的群组化现象，此在鉴别神经源性和肌源性病变中有重要意义。本组19例神经源性肌萎缩的病例中，16例有群组化现象，其中11例有大群组化现象，均为在ATP酶染色切片中发现。同时，在ATP酶和NADH-TR两种酶染的切片中，还可以观察到萎缩、肥大、群组化为何种类型肌纤维，对诊断先天性和后天性肌病有一定价值[3～5]。ORO和PAS分别为反应肌纤维中脂质和糖原含量的最佳方法，对诊断代谢障碍性肌病具有确诊价值[2，3]。我们利用此方法诊断类固醇肌病2例，脂质沉积性肌病1例。在GT染色中，若发现一定数量的RRF，即可考虑诊断为线粒体疾病[3，4，6]。本组有2例发现少数RRF，其中1例为神经源性肌萎缩病例，另1例为脂质沉积性肌病，因RFF数量较少且不够典型，未诊断为线粒体肌病，但有作用认为脂质沉积性肌病，实为线粒体肌病的一种类型[3，6，7]。
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本组病例中，临床诊断和病理诊断相符合者36例，占78.5%。临床诊断不明，通过肌肉活检，病理学检查，达到确诊者12例，占70.6%。其中，肢带型肌营养不良症2例，远端型肌营养不良1例，多发性肌炎/皮肌炎3例，类固醇肌病2例，神经性肌强直1例，萎缩性肌强直1例，脂质沉积性肌病1例，平山氏病1例，这些均为疑难少见病例。这些病例的确诊，亦充分说明了肌肉活检病理学检查在骨骼肌疾病诊断中的重要性，体现了冰冻切片和酶组织化学染色技术在骨骼肌病理检查中的价值。
由此可见，通过骨骼肌冰冻切片和酶组织化学染色技术的病理学检查，不仅可以提高我们对肌病的诊断水平，而且有利于我们发现和认识一些特殊类型的肌病，对骨骼疾病的诊断有很大的临床实用价值，值得推广应用。
参考文献
1，张 哲，陈 辉.实用病理组织染色技术.沈阳：辽宁科学技术出版社，1988：77～85
, http://www.100md.com
2，王拥军.神经病学实验室诊断技术.北京：科学技术出版社，1998：269～276
3，陈碧芬.骨骼肌疾病病理学.福州：福建科学技术出版社，1993：37～43
4，吕海东，李树林.骨骼肌酶与非酶组织化学技术在肌病诊断中的价值.河南诊断与治疗杂志，1999；13(1)：21～22
5，吕海东，张 燕.少年型脊肌萎缩症一家系2例报告.中华医学遗传学杂志，1999；16(3)：202
6，郭玉璞.线粒体脑肌病.中华神经科杂志，1997；30(5)：301～305
7，陈 琳，郭 重，郭玉璞，等.脂质沉积性肌病的临床和病理特点.中华神经科杂志，1998；31(3)：165～167
(2000-02-23收稿), 百拇医药
单位：吕海东 杨彬 郜建伟 秦东香 马晓丽 李树林(河南省焦作市人民医院神经内科 454002)；张林洁(河南省焦作市第二人民医院 454005)
关键词：骨骼肌；冰冻切片；酶组化染色；诊断价值
中国现代医学杂志001022 目的：观察骨骼肌疾病的肌肉标本在冰冻片和酶组织化学染色中的病理学改变。方法：将肌肉标本放入液氮中，速冻固定，冰冻切片，进行组织化学染色和酶组织化学的病理观察。结果：70例骨骼肌标本，有异常改变者45例，骨骼肌酶组织化学染色，有群组化现象16例，GT染色发现破碎红边纤维2例，ORO染色发现脂质增多4例。结论：骨骼肌冰冻切片可更加清晰地显示骨骼肌纤维的结构，能完好地保留骨骼肌酶的活性，酶组织化学染色可显示骨骼肌酶学变化的肌纤维的分型，有利于提高对肌病的认识和诊断水平，对骨骼肌疾病的诊断有很大的临床实用价值，值得推广应用。
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分类号 R746
骨骼肌病理检查是肌病诊断中的一种重要检查方法，特别是近年来，骨骼肌冰冻切片和酶组织化学染色技术的开展和电镜检查的应用，使其在肌病诊断过程中，起着越来越重要的作用。本文总结了我科近3年来，采用液氮速冻固定，冰冻切片和酶组织化学染色技术，对70例肌肉标本进行病理学检查结果，分析讨论其病理改变及其在临床诊断 的价值。
1 资料和方法
1.1 临床资料
男48例，女22例，年龄4～66岁。临床表现有肌无力56例，伴肌肉萎缩43例，伴肌肉疼痛11例，发作性肌无力6例。临床诊断：进行性肌营养不良症11例，肌萎缩侧索硬化症8例，脊肌萎缩症6例，多发性肌炎/皮肌炎8例，颈椎病8例，重症肌无力6例，周期性麻痹5例，肌强直1例。诊断不明者17例。
, 百拇医药 1.2 方法和材料
1.2.1 取材 所有病例均选中等程度受累的骨骼肌为活检部位，在局麻下切开皮肤及皮下组织，分离肌组织约0.5cm×0.5cm×1.0cm，两端结扎后切断，将标本放置冰壶中送实验室检查。本组70例病人中，取材于股四头肌41例，肱二头肌11例，腓肠肌8例，三角肌6例，尺侧腕屈肌4例。
1.2.2 固定和制片 将标本从冰壶中取出，分成不等的两部分，将其中2/3部分用沙布包裹后，迅速投放入液氮罐中，速冻固定，10min后，将其取出，放入恒冷箱式冰冻切片机中，待肌肉标本的温度回升到恒冷水冻切片机内的温度时(-20℃～-30℃)，再行厚度为8～10μm的冰冻切片，然后将切好的片子放入冰箱冷冻室内待染，切剩余的标本再放回液氮罐中保存。将另外1/3标本再分成两部分，其中一部分放入10%福尔马林溶液中固定(备用作石蜡切片)，另一部分放入2%戊二醛中固定(备用作电镜包埋检查)。
1.2.3 组织化学染色 除常规HE染色外，将作组织化学染色和酶组织化学染色。组织化学染色包括：改良Gomeri三色(GT)、油红O脂肪染色(ORO)、糖原染色(PAS)。骨骼肌酶组化染色包括：肌球蛋白腺苷三磷酸酶(ATP酶)，还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶(NADH-TR)，其中ATP酶染色时，将分别作PH值为4.2，4.4，10.6，10.8时，不同pH值的染色[1～3]。
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2 结果
70例骨骼肌标本病理学检查结果为：有异常改变者45例，其中符合肌源性损害者22例，神经源性损害者19例，有典型的肌间“淋巴溢”现象5例，炎性病变9例，伴束周萎缩4例。骨骼肌酶组织化学染色，有群组化现象16例，其中大群组化现象11例。GT染色发现破碎红边纤维(RRF)2例。ORO染色发现脂质增多4例，其中脂质沉积1例。肌肉病理未见特征性改变者25例。
结合临床表现及实验室检查，诊断进行性肌营养不良症12例，其中Dunchenne型肌营养不良症9例，肢带型肌营养不良症2例，远端型肌营养不良症1例。诊断运动神经元病9例，其中肌萎缩侧索硬化症5例，脊肌萎缩症4例。诊断多发性肌炎2例，皮肌炎4例。颈椎病7例，重症肌无力5例，类固醇肌病2例，神经性肌强直1例，萎缩性肌强直1例，脂质沉积性肌病1例，平山氏病1例。
3 讨论
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以往人们对肌病的诊断主要依靠肌电图和血清肌酶谱检查，但绝大多数肌病患者，肌电图均表现为肌原性损害，血清肌酶谱有不同程度的升高，所以，骨骼肌疾病的临床定性诊断十分困难。过去即使有少数病人作了肌肉活检，也都是传统的石蜡包埋切片，单纯HE染色。由于这种石蜡包埋切片的制作过程，受到固定、脱水、包埋和热处理等多种因素的影响，骨骼肌酶的活性均早已失活，难以进行组织化学染色和骨骼肌酶学观察。我们现在所采用的液氮速冻固定，恒冷冰冻切片，避免了以上诸多因素的影响，很好地保留了骨骼肌酶的活性。通过骨骼肌酶与非酶组织化学染色技术，即可清晰地显示出在各种骨骼肌疾病中，两型肌纤维的分布情况及各种特征性的病理改变。
骨骼组织在冷冻过程中极易产生冰晶，所以，标本的冷冻过程是作好肌肉活检的关键，目前国内普遍采用的方法是，先用液氮将异戊烷冷冻至-155℃～-160℃，再将肌肉标本放入异戊烷中速冻10s，然后取出用锡纸包裹或装入纱布袋中，再放入液氮罐中保存，但仍时有冰晶产生[2，3]。我们采用的方法是将骨骼肌标本先放入纱布包中，不用异戊烷，直接放入液氮罐中速冻固定。由于标本预先装入纱布袋中，避免了将冻好的标本在空气中停留的过程，所以很少产生冰晶。此方法在国内未见有文献报道。
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我们通过对70例骨骼肌标本的病理学观察，认为ATP酶染色法为区分Ⅰ、Ⅱ型肌纤维的最佳方法，NADH-TR染色法次之，它们均可显示神经再支配所引起的群组化现象，此在鉴别神经源性和肌源性病变中有重要意义。本组19例神经源性肌萎缩的病例中，16例有群组化现象，其中11例有大群组化现象，均为在ATP酶染色切片中发现。同时，在ATP酶和NADH-TR两种酶染的切片中，还可以观察到萎缩、肥大、群组化为何种类型肌纤维，对诊断先天性和后天性肌病有一定价值[3～5]。ORO和PAS分别为反应肌纤维中脂质和糖原含量的最佳方法，对诊断代谢障碍性肌病具有确诊价值[2，3]。我们利用此方法诊断类固醇肌病2例，脂质沉积性肌病1例。在GT染色中，若发现一定数量的RRF，即可考虑诊断为线粒体疾病[3，4，6]。本组有2例发现少数RRF，其中1例为神经源性肌萎缩病例，另1例为脂质沉积性肌病，因RFF数量较少且不够典型，未诊断为线粒体肌病，但有作用认为脂质沉积性肌病，实为线粒体肌病的一种类型[3，6，7]。
, 百拇医药
本组病例中，临床诊断和病理诊断相符合者36例，占78.5%。临床诊断不明，通过肌肉活检，病理学检查，达到确诊者12例，占70.6%。其中，肢带型肌营养不良症2例，远端型肌营养不良1例，多发性肌炎/皮肌炎3例，类固醇肌病2例，神经性肌强直1例，萎缩性肌强直1例，脂质沉积性肌病1例，平山氏病1例，这些均为疑难少见病例。这些病例的确诊，亦充分说明了肌肉活检病理学检查在骨骼肌疾病诊断中的重要性，体现了冰冻切片和酶组织化学染色技术在骨骼肌病理检查中的价值。
由此可见，通过骨骼肌冰冻切片和酶组织化学染色技术的病理学检查，不仅可以提高我们对肌病的诊断水平，而且有利于我们发现和认识一些特殊类型的肌病，对骨骼疾病的诊断有很大的临床实用价值，值得推广应用。
参考文献
1，张 哲，陈 辉.实用病理组织染色技术.沈阳：辽宁科学技术出版社，1988：77～85
, http://www.100md.com
2，王拥军.神经病学实验室诊断技术.北京：科学技术出版社，1998：269～276
3，陈碧芬.骨骼肌疾病病理学.福州：福建科学技术出版社，1993：37～43
4，吕海东，李树林.骨骼肌酶与非酶组织化学技术在肌病诊断中的价值.河南诊断与治疗杂志，1999；13(1)：21～22
5，吕海东，张 燕.少年型脊肌萎缩症一家系2例报告.中华医学遗传学杂志，1999；16(3)：202
6，郭玉璞.线粒体脑肌病.中华神经科杂志，1997；30(5)：301～305
7，陈 琳，郭 重，郭玉璞，等.脂质沉积性肌病的临床和病理特点.中华神经科杂志，1998；31(3)：165～167
(2000-02-23收稿), 百拇医药