HBV前C区突变株对干扰素治疗的应答反应
作者：张清波 戴兆云 胡德昌 章婉琴 邬祥惠 徐肇玥
单位：张清波、章婉琴、邬祥惠、徐肇玥 200040 上海医科大学附属华山医院；戴兆云 华东医院；胡德昌 上海医科大学附属中山医院
关键词：乙型肝炎病毒前C区；野生株；突变株；干扰素
中华传染病杂志990108 【摘要】 目的 评价干扰素对HBV前C区突变株的应答反应。方法 对104例慢性乙型肝炎患者，应用克隆测序和快速检测HBV前C区终止密码突变的方法，共检出21例突变株，其中16例曾应用干扰素治疗；野生株21/ 25例曾应用干扰素治疗。结果 16例HBV前C区突变株对干扰素治疗有应答者6例；野生株21例，对干扰素有应答者9例，二组相比差异无显著性。结论 HBV前C区突变株及野生株对干扰素均有部分应答，应答率分别为37.5%和42.9%，二组相比差异无显著性。
Study on the response to interferon in chronic hepatitis B patients with HBV pre-C mutants
, http://www.100md.com
ZHANG Qingbo, DAI Zhaoyun, HU Dechang, et al.
Hua Shan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
【Abstract】 Objective The study was to evaluate the response to interferon in chronic hepatitis B patients with HBV pre-C mutants.Methods Sequence analysis was made in HBV DNA positive patients by cloning their amplified products to M13,MP18 or PBS and, rapid detection of the stop codon of HBV pre-C mutants in 104 chronic hepatitis B patients was coincidently taken. Response to interferon was observed both in the 16 cases with pre-C mutants and 21 cases with wild type.Results HBV pre-C mutants were detected in 21/ 104 cases, 6/ 16 cases of which response to interferon therapy. In 25 cases with wild type, 9/ 21 cases response to interferon. However, there was no statistic difference between the two groups of HBeAg positive patients and anti-HBe positive patients.Conclusion Response to interferon in the patients with mutants are comparable to that of the patients with wild type. Response rates were respectively 37.5% and 42.85%.
, 百拇医药
【Key words】 HBV pre-C region Wild-type Mutation Interferon
应用分子生物学技术如聚合酶链反应(PCR)，分子克隆及序列分析等检测手段发现HBV DNA基因可以产生许多突变，尤以前核心区突变为著，从而使HBV丧失分泌HBeAg的能力，使患者由HBeAg阳性转向抗-HBe阳性。这种转变对干扰素治疗的应答有无影响是值得研究的，现将我院近年来的初步研究分析如下。
材料与方法
一、对象
1993年1月～1995年12月上海医科大学附属华山医院及中山医院收治的慢性乙型肝炎104例，男85例，女19例，年龄27～60岁，诊断参照1990年全国病毒性肝炎学术会议修订的标准。
二、乙型肝炎病毒标志(HBVM)检测
, http://www.100md.com
采用Abbott药盒，按说明书规定进行操作。
三、突变株测定
(一)克隆测序 39例慢性乙型肝炎，应用PCR检测HBV DNA，阳性者30例，将HBV DNA产物与载体M13、M18或PBS质粒进行克隆，并以双氧链中止法32P标记进行DNA序列测定。以野生株基因序列为准，由中国科学院生物化学研究所提供HBV基因库，然后用计算机比较序列。
(二)快速检测HBV前C区终止密码突变 65例慢性乙型肝炎患者采用快速检测HBV前C区形成终止密码突变的方法。
1.应用一对引物PCR方法扩增血清中HBV前C区及部分C区基因。
2.用已合成的三个寡核苷酸：M0(未突变)、M1(1898位单一位点突变)，M2(1898位和1901位两个位点突变)，以32P标记作为探针进行Southern blot杂交。
, http://www.100md.com
3.确定标准：M0杂交阳性者为HBV野生株感染、M1或M1/ M2杂交阳性者为突变株感染，M0、M1/ M2杂交均阳性者为野生株与突变株混合感染、M0、M1/ M2杂交均阴性者为其他形式的突变株感染。
四、治疗方法
应用干扰素300万单位肌内注射，每周3次，疗程3～6个月。
五、观察标准
用干扰素治疗3～6个月结束时ALT恢复正常、HBeAg及HBV DNA转为阴性者，作为对干扰素治疗有应答者，其余病例作为非应答者。
六、统计方法
采用t检验或χ2检验(数字小于40以下采用四格表精确检验法)。
, 百拇医药
结果
一、克隆测序结果
39例慢性乙型肝炎患者，HBeAg阳性组中未检出突变株，抗-HBe阳性者21例，其中HBV DNA阳性者15例，检出突变株5例，突变率33.3%。
二、同位素
32P标记探针快速检测突变株结果见表1。
表1 同位素32P快速检测突变株 组别
例数
HBV
DNA
(+)
, 百拇医药
野生株
(M0+)
突变株
突变率
(%)
M1/
M2(+)
M0M1/
M2(+)
M0M1/
M2(-)
HBeAg
(+)
, http://www.100md.com
31
19
12
2
3
2
36.84
抗-HBe
(+)
34
12
3
4
4
, 百拇医药
1
75
四格表精确检验法，二组相比P>0.05
三、野生株、突变株对干扰素治疗应答的比较
野生株的慢性乙型肝炎使用干扰素治疗者21例，突变株使用干扰素治疗者16例，两者比较见表2。
表2 野生株、突变株对干扰素治疗的应答比较 组别
野生株
突变株
例数
应答数(%)
例数
, 百拇医药
应答数(%)
HBeAg(+)
10
5(50)
9
4(44.4)
抗-HBe(+)
11
4(36.4)
7
2(28.6)
HBeAg(+)组及抗-HBe(+)组以及野生株、突变株相比P>0.05
, 百拇医药
四、野生株、突变株干扰素治疗结束后的复发比较
见表3。
表3 野生株、突变株干扰素治疗后复发比较 组别
野生株
突变株
例数
复发例数(%)
例数
复发例数(%)
HBeAg(+)
3
1(33.3)
, 百拇医药
4
1(25)
抗-HBe(+)
4
2(50)
2
2(100)
四格表精确检验法，P>0.05
7例野生株及6例突变株使用干扰素结束后分别随访2年余。HBeAg(+)组中野生株3例，复发1例；突变株4例，复发1例。抗-HBe(+)组中野生株4例中复发2例。突变株患者随访2例，2例均复发。
五、野生株、突变株患者病程与治后复发的关系
, 百拇医药
野生株、突变株的病例平均病程都为5年以上，两组复发率无差异，见表4。
表4 野生株、突变株病程与治后复发关系 组别
野生株
突变株
例数
病程
(年)
复发者病程
(年)
例数
病程
(年)
, 百拇医药
复发者病程
(年)
HBeAg(+)
3
6.67
7
4
8.5
11
抗-HBe(+)
4
8.75
11
, http://www.100md.com
2
15
15
χ2=0.1947，P>0.05
讨论
研究证实慢性乙型肝炎患者存在前C区或C区基因突变[1，2]。本试验应用克隆测序和同位素32P标记的三种探针快速检测突变株，共检出突变株21例，其中16例使用干扰素治疗，有应答者6例，无应答者10例，应答率37.5%。国内外对干扰素治疗慢性乙型肝炎的应答已有报道[3]，野生株与突变株对干扰素的应答报告也不一致。本研究结果提示突变株中，HBeAg(+)者与抗-HBe(+)者应答率分别为44.4%及25%，二组相比P>0.05。Carman等[4]认为单纯前C区基因变异并不能完全预测干扰素的疗效,本研究结果也提示野生株与变异株对干扰素的治疗均有部分应答者。然而变异株中HBeAg(+)组与抗-HBe(+)组停药后复发率却有差别，分别为25%及100%(因例数较少统计学处理差异无显著性)。文献指出抗-HBe(+)组的突变株多数能逃脱免疫的清除，所以在干扰素治疗结束后可渐渐繁殖起来，造成复发。Maurizia等[5]提出突变株对干扰素的应答并非取决于是否存在前C区变异株，而是与前C区变异株的数量有关，当变异株比例达到一定水平时即会降低干扰素的疗效。变异株随着病程的延长积累，从HBeAg(+)渐渐转向抗-HBe(+)，最终会成为优势株，因而强调慢性乙型肝炎应早期使用干扰素治疗，防止复发，防止向肝硬化及肝癌演变。本研究提示25%～44.4%的HBV前C区变异株仍对干扰素有应答，比Lok等[6]报道的前C区1898位突变株65%～67%对干扰素仍敏感的结论略低。
, 百拇医药
Takeda等[7]报告乙型肝炎e抗原抗体系统血清转换时或干扰素治疗后出现从野生株向突变株转换的倾向，因干扰素具有免疫调节作用，是否因能增加宿主对HBV的免疫压力而促进这种转化?也可能仅仅是e抗原抗体系统的自然演变过程，与干扰素治疗并无联系。因研究例数较少，今后尚需积累更多资料，加以探讨。
(本实验承上海医科大学屠红博士及李平洋老师协作，谨致谢意)
本课题为国家自然科学基金资助项目(39370645)
参考文献
1 Carman WF， Jacyna MR， Hadziyannis S, et al. Mutation preventing formation of hepatiti， B e antigen in patients with chronic hepatitis infection. Lancet, 1989,2:588-591.
, 百拇医药
2 张清波、戴兆云、徐肇NB04A，等.乙型肝炎病毒前核心区基因变异的研究.中华肝脏病杂志，1995，3：27-32.
3 XU JY， David B, Tim H, et al. Absence of hepatitis B virus pre-C mutants in patients with chronic hepatitis B responding to interferon-α. Hepatology, 1992,15:1002-1006.
4 Carman WF, Ferrao M, Lok A, et al. Pre-core sequence variation in Chinese isolates of hepatitis B virus. J Infection Diseases, 1992,165:127-133.
5 Maurizia RB, Manueia G, Giorgio S, et al. Hepatitis B virus unable to secrete e antigen and response to interferon in chronic hepatitis B. Gastroenterology, 1993,105:845-850.
, http://www.100md.com
6 Lok ASF, Ulus SA, Sheila G. Predictive value of precore hepatitis B virus mutations in spontaneous and interferon-induced hepatitis B e antigen clearance. Hepatology, 1995,21:19-24.
7 Takeda K, Akahane Y, Suzuki H, et al. Defects in the precore region of the HBV genome in patients with chronic hepatitis B after sustained seroconversion from HBeAg to anti-HBe induced spontaneously or with interferon therapy. Hepatology, 1990,12:1284-1289.
(收稿：1997-10-09 修回：1998-02-23), 百拇医药
单位：张清波、章婉琴、邬祥惠、徐肇玥 200040 上海医科大学附属华山医院；戴兆云 华东医院；胡德昌 上海医科大学附属中山医院
关键词：乙型肝炎病毒前C区；野生株；突变株；干扰素
中华传染病杂志990108 【摘要】 目的 评价干扰素对HBV前C区突变株的应答反应。方法 对104例慢性乙型肝炎患者，应用克隆测序和快速检测HBV前C区终止密码突变的方法，共检出21例突变株，其中16例曾应用干扰素治疗；野生株21/ 25例曾应用干扰素治疗。结果 16例HBV前C区突变株对干扰素治疗有应答者6例；野生株21例，对干扰素有应答者9例，二组相比差异无显著性。结论 HBV前C区突变株及野生株对干扰素均有部分应答，应答率分别为37.5%和42.9%，二组相比差异无显著性。
Study on the response to interferon in chronic hepatitis B patients with HBV pre-C mutants
, http://www.100md.com
ZHANG Qingbo, DAI Zhaoyun, HU Dechang, et al.
Hua Shan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
【Abstract】 Objective The study was to evaluate the response to interferon in chronic hepatitis B patients with HBV pre-C mutants.Methods Sequence analysis was made in HBV DNA positive patients by cloning their amplified products to M13,MP18 or PBS and, rapid detection of the stop codon of HBV pre-C mutants in 104 chronic hepatitis B patients was coincidently taken. Response to interferon was observed both in the 16 cases with pre-C mutants and 21 cases with wild type.Results HBV pre-C mutants were detected in 21/ 104 cases, 6/ 16 cases of which response to interferon therapy. In 25 cases with wild type, 9/ 21 cases response to interferon. However, there was no statistic difference between the two groups of HBeAg positive patients and anti-HBe positive patients.Conclusion Response to interferon in the patients with mutants are comparable to that of the patients with wild type. Response rates were respectively 37.5% and 42.85%.
, 百拇医药
【Key words】 HBV pre-C region Wild-type Mutation Interferon
应用分子生物学技术如聚合酶链反应(PCR)，分子克隆及序列分析等检测手段发现HBV DNA基因可以产生许多突变，尤以前核心区突变为著，从而使HBV丧失分泌HBeAg的能力，使患者由HBeAg阳性转向抗-HBe阳性。这种转变对干扰素治疗的应答有无影响是值得研究的，现将我院近年来的初步研究分析如下。
材料与方法
一、对象
1993年1月～1995年12月上海医科大学附属华山医院及中山医院收治的慢性乙型肝炎104例，男85例，女19例，年龄27～60岁，诊断参照1990年全国病毒性肝炎学术会议修订的标准。
二、乙型肝炎病毒标志(HBVM)检测
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采用Abbott药盒，按说明书规定进行操作。
三、突变株测定
(一)克隆测序 39例慢性乙型肝炎，应用PCR检测HBV DNA，阳性者30例，将HBV DNA产物与载体M13、M18或PBS质粒进行克隆，并以双氧链中止法32P标记进行DNA序列测定。以野生株基因序列为准，由中国科学院生物化学研究所提供HBV基因库，然后用计算机比较序列。
(二)快速检测HBV前C区终止密码突变 65例慢性乙型肝炎患者采用快速检测HBV前C区形成终止密码突变的方法。
1.应用一对引物PCR方法扩增血清中HBV前C区及部分C区基因。
2.用已合成的三个寡核苷酸：M0(未突变)、M1(1898位单一位点突变)，M2(1898位和1901位两个位点突变)，以32P标记作为探针进行Southern blot杂交。
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3.确定标准：M0杂交阳性者为HBV野生株感染、M1或M1/ M2杂交阳性者为突变株感染，M0、M1/ M2杂交均阳性者为野生株与突变株混合感染、M0、M1/ M2杂交均阴性者为其他形式的突变株感染。
四、治疗方法
应用干扰素300万单位肌内注射，每周3次，疗程3～6个月。
五、观察标准
用干扰素治疗3～6个月结束时ALT恢复正常、HBeAg及HBV DNA转为阴性者，作为对干扰素治疗有应答者，其余病例作为非应答者。
六、统计方法
采用t检验或χ2检验(数字小于40以下采用四格表精确检验法)。
, 百拇医药
结果
一、克隆测序结果
39例慢性乙型肝炎患者，HBeAg阳性组中未检出突变株，抗-HBe阳性者21例，其中HBV DNA阳性者15例，检出突变株5例，突变率33.3%。
二、同位素
32P标记探针快速检测突变株结果见表1。
表1 同位素32P快速检测突变株 组别
例数
HBV
DNA
(+)
, 百拇医药
野生株
(M0+)
突变株
突变率
(%)
M1/
M2(+)
M0M1/
M2(+)
M0M1/
M2(-)
HBeAg
(+)
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31
19
12
2
3
2
36.84
抗-HBe
(+)
34
12
3
4
4
, 百拇医药
1
75
四格表精确检验法，二组相比P>0.05
三、野生株、突变株对干扰素治疗应答的比较
野生株的慢性乙型肝炎使用干扰素治疗者21例，突变株使用干扰素治疗者16例，两者比较见表2。
表2 野生株、突变株对干扰素治疗的应答比较 组别
野生株
突变株
例数
应答数(%)
例数
, 百拇医药
应答数(%)
HBeAg(+)
10
5(50)
9
4(44.4)
抗-HBe(+)
11
4(36.4)
7
2(28.6)
HBeAg(+)组及抗-HBe(+)组以及野生株、突变株相比P>0.05
, 百拇医药
四、野生株、突变株干扰素治疗结束后的复发比较
见表3。
表3 野生株、突变株干扰素治疗后复发比较 组别
野生株
突变株
例数
复发例数(%)
例数
复发例数(%)
HBeAg(+)
3
1(33.3)
, 百拇医药
4
1(25)
抗-HBe(+)
4
2(50)
2
2(100)
四格表精确检验法，P>0.05
7例野生株及6例突变株使用干扰素结束后分别随访2年余。HBeAg(+)组中野生株3例，复发1例；突变株4例，复发1例。抗-HBe(+)组中野生株4例中复发2例。突变株患者随访2例，2例均复发。
五、野生株、突变株患者病程与治后复发的关系
, 百拇医药
野生株、突变株的病例平均病程都为5年以上，两组复发率无差异，见表4。
表4 野生株、突变株病程与治后复发关系 组别
野生株
突变株
例数
病程
(年)
复发者病程
(年)
例数
病程
(年)
, 百拇医药
复发者病程
(年)
HBeAg(+)
3
6.67
7
4
8.5
11
抗-HBe(+)
4
8.75
11
, http://www.100md.com
2
15
15
χ2=0.1947，P>0.05
讨论
研究证实慢性乙型肝炎患者存在前C区或C区基因突变[1，2]。本试验应用克隆测序和同位素32P标记的三种探针快速检测突变株，共检出突变株21例，其中16例使用干扰素治疗，有应答者6例，无应答者10例，应答率37.5%。国内外对干扰素治疗慢性乙型肝炎的应答已有报道[3]，野生株与突变株对干扰素的应答报告也不一致。本研究结果提示突变株中，HBeAg(+)者与抗-HBe(+)者应答率分别为44.4%及25%，二组相比P>0.05。Carman等[4]认为单纯前C区基因变异并不能完全预测干扰素的疗效,本研究结果也提示野生株与变异株对干扰素的治疗均有部分应答者。然而变异株中HBeAg(+)组与抗-HBe(+)组停药后复发率却有差别，分别为25%及100%(因例数较少统计学处理差异无显著性)。文献指出抗-HBe(+)组的突变株多数能逃脱免疫的清除，所以在干扰素治疗结束后可渐渐繁殖起来，造成复发。Maurizia等[5]提出突变株对干扰素的应答并非取决于是否存在前C区变异株，而是与前C区变异株的数量有关，当变异株比例达到一定水平时即会降低干扰素的疗效。变异株随着病程的延长积累，从HBeAg(+)渐渐转向抗-HBe(+)，最终会成为优势株，因而强调慢性乙型肝炎应早期使用干扰素治疗，防止复发，防止向肝硬化及肝癌演变。本研究提示25%～44.4%的HBV前C区变异株仍对干扰素有应答，比Lok等[6]报道的前C区1898位突变株65%～67%对干扰素仍敏感的结论略低。
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Takeda等[7]报告乙型肝炎e抗原抗体系统血清转换时或干扰素治疗后出现从野生株向突变株转换的倾向，因干扰素具有免疫调节作用，是否因能增加宿主对HBV的免疫压力而促进这种转化?也可能仅仅是e抗原抗体系统的自然演变过程，与干扰素治疗并无联系。因研究例数较少，今后尚需积累更多资料，加以探讨。
(本实验承上海医科大学屠红博士及李平洋老师协作，谨致谢意)
本课题为国家自然科学基金资助项目(39370645)
参考文献
1 Carman WF， Jacyna MR， Hadziyannis S, et al. Mutation preventing formation of hepatiti， B e antigen in patients with chronic hepatitis infection. Lancet, 1989,2:588-591.
, 百拇医药
2 张清波、戴兆云、徐肇NB04A，等.乙型肝炎病毒前核心区基因变异的研究.中华肝脏病杂志，1995，3：27-32.
3 XU JY， David B, Tim H, et al. Absence of hepatitis B virus pre-C mutants in patients with chronic hepatitis B responding to interferon-α. Hepatology, 1992,15:1002-1006.
4 Carman WF, Ferrao M, Lok A, et al. Pre-core sequence variation in Chinese isolates of hepatitis B virus. J Infection Diseases, 1992,165:127-133.
5 Maurizia RB, Manueia G, Giorgio S, et al. Hepatitis B virus unable to secrete e antigen and response to interferon in chronic hepatitis B. Gastroenterology, 1993,105:845-850.
, http://www.100md.com
6 Lok ASF, Ulus SA, Sheila G. Predictive value of precore hepatitis B virus mutations in spontaneous and interferon-induced hepatitis B e antigen clearance. Hepatology, 1995,21:19-24.
7 Takeda K, Akahane Y, Suzuki H, et al. Defects in the precore region of the HBV genome in patients with chronic hepatitis B after sustained seroconversion from HBeAg to anti-HBe induced spontaneously or with interferon therapy. Hepatology, 1990,12:1284-1289.
(收稿：1997-10-09 修回：1998-02-23), 百拇医药