标本处理对聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸的影响
作者：李金明 王露楠 邓巍
单位：卫生部北京医院 卫生部临床检验中心100730
关键词：聚合酶链反应；标本制备；DNA；病毒
中华检验医学杂志000605 【摘要】 目的 研究对血清标本进行乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶链反应(PCR)测定前的最佳标本处理方法。方法 使用煮沸裂解方法和核酸纯化方法同时处理2份HBV DNA含量不同血清标本及3份溶血和正常血清标本，比较荧光定量PCR测定的重复性及测定值的差异。结果 煮沸裂解法处理2份标本所得结果的重复性(变异系数CV分别为0.2165和0.3262)明显差于对样本进行核酸纯化后的测定重复性(CV分别为0.0699和0.1092)；并且，当标本中血红蛋白含量大于5.89 μg/L时(肉眼未见有明显溶血)，采用煮沸裂解法处理标本所得HBV DNA量较核酸纯化方法所得值低约2个数量级(P<0.05)。结论 在HBV DNA PCR检测时，煮沸裂解法不适合用来处理血清标本，而应使用核酸纯化方法。
, 百拇医药
Influence of nucleic acid extraction from serum with two methods on HBV DNA detection by fluorescence quantitative PCR (TaqMan)
LI Jinming WANG Lunan DENG Wei
(National Center for Clinical Laboratory,Beijing 100730, China)
【Abstract】 Objective To investigate the influence of nucleic acid extraction by boiling the serum samples and purifing nucleic acid from serum on HBV DNA detection by PCR. Methods The DNA templates from 2 serum samples with different HBV DNA concentration and 3 serum samples with hemolysis and non-hemolysis for PCR were prepared by two kinds of method, i.e. by boiling the serum to release HBV DNA from the virus particles and by purifing the nucleic acid from serum. Then,the difference of reproducibility and HBV DNA quantitative values by PCR using the templates prepared by the two nucleic acid extraction methods was compared.Results HBV DNA quantitative values by PCR using the templates purified from the two samples were more reproducible(CV: 0.2165 and 0.3262, respectively) than those using the templates prepared by boiling the serum (CV: 0.0699 and 0.1092, respectively). Moreover, when the concentration of hemoglobin in serum samples was higher than 5.89 μg/L, the HBV DNA quantitative values by PCR using the templates purified from the samples were about one-hundred-fold more than those using the templates prepared by boiling the serum (P<0.05).Conclusion The results suggested that the DNA template prepared by boiling the serum is not suitable for HBV DNA quantitative PCR detection, and nucleic acid for PCR must be purified from serum.
, 百拇医药
【Key words】 Polymerase chain reaction;Specimen handling;DNA, viral
乙型肝炎病毒(HBV)DNA的定量测定在乙型肝炎病人的临床治疗监测中有重要参考价值，其前提是定量必须具有很好的重复性。目前国内用于HBV DNA定量测定的方法基本上是荧光定量聚合酶链反应(PCR, TaqMan)技术，这种实时测定技术方便简单，且不易引起污染。影响PCR测定重复性和准确性的因素，除了PCR扩增本身以外，还有一个常被忽略但也非常关键的因素，即标本处理。目前，国内绝大部分用于HBV DNA测定的PCR试剂盒，常采用直接对血清煮沸裂解以释放病毒核酸的方法处理标本，这种方法虽然较经典的核酸提取方法简便，但由于其只是简单地将核酸从病毒颗粒中释放出来，继而用于扩增检测，血清中的一些成分，如血红素可能会对扩增产生抑制作用，从而影响测定。为此，我们比较了核酸提取纯化与煮沸裂解法对HBV DNA荧光定量测定的准确性和重复性的影响，结果报告如下。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料
1.试剂：HBV DNA荧光定量PCR试剂盒由深圳匹基生物技术开发有限公司提供。核酸纯化试剂来自于美国Biotronics公司。
2.仪器：PE5700荧光定量PCR仪(PE，美国)。
二、方法
1.血清标本处理。煮沸裂解法即采用现常用的试剂盒方法，操作简述如下：50 μl血清中加入等体积裂解液，煮沸10 min，离心后取上清直接用于PCR扩增。核酸纯化方法按试剂说明操作，简述如下：于1.5 ml离心管中加入120 μl血清或血浆和200μl STG溶液，充分混匀，80℃ 10 min。15 000 g离心5 min，然后用异丙醇沉淀，KW试剂洗涤，干后备用。该方法较酚-氯仿核酸纯化方法简便易行。
, 百拇医药
2.标本处理方法对测定的重复性的影响。取1份HBV DNA含量较高样本，原样及用阴性人血清稀释100倍后，分别用上述2种样本处理方法各提取15次，然后进行荧光定量测定，比较2种不同方法的测定重复性。
3.血红蛋白干扰试验。取枸橼酸盐抗凝的正常人血，用生理盐水冼涤数次后，加入一定量无菌蒸馏水溶解红细胞，测定血红蛋白含量。取一定量加入至HBV DNA较高含量样本中，至血红蛋白终浓度分别为589μg/L、58.9μg/L和5.89μg/L。然后再对这HBV DNA含量相同，但血红蛋白含量不同的3份样本分别用上述2种样本处理方法双份提取，荧光定量测定HBV DNA，比较结果。
4.统计学分析。血红蛋白含量不同对2种标本处理方法所得测定结果的差异采用t检验。
结果
一、对HBV DNA定量测定重复性的影响
, http://www.100md.com
从表1可见，核酸纯化方法处理标本所得到的测定结果，重复性明显好于煮沸裂解法。同时核酸纯化方法所得的结果，较好地反映出了2个样本之间1∶100稀释的倍比关系。
表1 2种标本处理方法对HBV DNA定量重复性的影响 标本处理
方法
样本
提取
次数
HBVDNA(拷贝数/ml)
s
CV
, 百拇医药
煮沸裂解法
原样
15
7.76×106
2.53×106
0.3260
原样1∶100
15
2.15×105
4.66×104
0.2165
, 百拇医药 核酸纯化
原样
15
3.02×107
3.30×106
0.1090
原样1∶100
15
4.45×105
3.11×104
0.0699
二、血红蛋白对测定结果的干扰(表2)
, 百拇医药
当血清标本中血红蛋白含量大于5.89 μg/L时，采用煮沸裂解法处理标本，测定HBV DNA的含量明显低于核酸纯化方法(P<0.05)。从荧光定量的扩增变化曲线来看，煮沸裂解法处理标本所得的曲线明显较核酸纯化方法平坦。表2 血红蛋白对PCR测定结果的干扰 标本处理
方法
血红蛋白
含量(μg/L)
HBVDNA(拷贝数/ml)
现测值
原测值
煮沸裂解法
5.89
5.80×105
, http://www.100md.com
7.76×106
58.90
6.27×105
7.76×106
589.00
4.33×105
7.76×106
核酸纯化
5.89
2.19×107
3.02×107
, http://www.100md.com
58.90
4.34×107
3.02×107
589.00
9.48×106
3.02×107
讨论
在临床进行血清HBV DNA的PCR测定时，由于煮沸处理标本进而直接扩增较核酸提取纯化法简便快速，因而国内绝大部分试剂盒均采用此种标本处理方法，但国外试剂如Roche公司Amplicor HBV DNA PCR-ELISA定量测定试剂及Biotronics公司的HBV DNA荧光定量PCR试剂均采用核酸纯化方法。
, 百拇医药
HBV DNA定量测定主要是用于乙型肝炎病人治疗的动态观察及疗效判断，这就要求定量测定要有很好的重复性，从而不至于给出错误的信息。我们探讨了目前国内常用的血清标本煮沸处理方法对HBV DNA荧光定量测定重复性的影响，发现其测定的重复性(2份样本的测定CV分别为0.2165和0.3262)明显差于对标本进行核酸纯化后的测定重复性(CV分别为0.0699和0.1092)。这可能是由于煮沸处理血清标本只是将病毒核酸从病毒颗粒中释放出来，因而在吸取离心后的样本上清用于扩增时，样本中很可能或多或少地会含有一些原有的血清标本成分，如血红素及其他一些蛋白等，很难保证在每次吸取时，这些对PCR扩增有干扰的物质的量均是一致的。Roche公司 的Amplicor HBV DNA PCR-ELISA定量测定方法的批内CV小于0.2000[1]。 此外，有研究表明，血红素可通过其卟啉环与Taq酶的不可逆结合而抑制Taq酶活性，从而影响PCR测定[2-4]。本组的结果表明，当血清标本中血红蛋白含量为589.00μg/L，可见血清明显为红色，2种标本处理方法测定结果均有降低，但煮沸处理法更为明显(从7.76×106拷贝数/ml降至4.33×105拷贝数/ml)；当血红蛋白含量为58.90 μg/L，肉眼观察略有红色，而在血红蛋白含量为5.89 μg/L时，肉眼观察不到是否溶血，这种情况在临床很常见。采用煮沸裂解方法处理标本，在扩增模板溶液中会有残留的血红蛋白，血红蛋白可通过对Taq酶的强抑制作用而影响扩增检测。但如能在扩增模板制备即标本处理时，将血红蛋白去除，则不会影响后面的扩增检测。从表2可以看出，核酸纯化方法在这两种情况下，结果均无明显改变，而煮沸处理法结果有明显降低。
, 百拇医药
综上所述，在HBV DNA的PCR定量测定时，用煮沸方法处理标本，操作虽简单一些，但测定的重复性明显不如对标本进行核酸纯化后的测定重复性，并且提取效率亦低些。尤其要引起重视的是，由于血液采集及分离血清过程中的操作原因，临床血清样本常见有轻微溶血，煮沸处理标本可致测定结果明显偏低(降低2个数量级)，这将使得在监测病人治疗中HBV DNA的定量失去诊断价值，而且在定性测定时，也会由于这些抑制物的存在，而使较弱阳性标本的PCR测定出现假阴性结果。
参考文献
1，Kessler HH, Pierer K, Santner BI, et al. Quantitative detection of hepatitis B virus DNA with a new PCR assay. Clin Chem Lab Med, 1998,36:601-604.
2，Neumaier M, Braun A, Wagener C. Fundamentals of quality assessment of molecular amplification methods in clinical diagnostics. Clin Chem, 1998,44:1-26.
, 百拇医药
3，MM3-A. Molecular diagnostic methods for infectious diseases; approved guideline. NCCLS, 1995,15(22):32-33.
4，Higuchi R. Simple and rapid preparation of samples for PCR. In:Erlich HA, eds. PCR technology: principles and applications for DNA ampliofication. New York: Stockton Press, 1989.31-38.
(收稿日期：2000-03-09), 百拇医药
单位：卫生部北京医院 卫生部临床检验中心100730
关键词：聚合酶链反应；标本制备；DNA；病毒
中华检验医学杂志000605 【摘要】 目的 研究对血清标本进行乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶链反应(PCR)测定前的最佳标本处理方法。方法 使用煮沸裂解方法和核酸纯化方法同时处理2份HBV DNA含量不同血清标本及3份溶血和正常血清标本，比较荧光定量PCR测定的重复性及测定值的差异。结果 煮沸裂解法处理2份标本所得结果的重复性(变异系数CV分别为0.2165和0.3262)明显差于对样本进行核酸纯化后的测定重复性(CV分别为0.0699和0.1092)；并且，当标本中血红蛋白含量大于5.89 μg/L时(肉眼未见有明显溶血)，采用煮沸裂解法处理标本所得HBV DNA量较核酸纯化方法所得值低约2个数量级(P<0.05)。结论 在HBV DNA PCR检测时，煮沸裂解法不适合用来处理血清标本，而应使用核酸纯化方法。
, 百拇医药
Influence of nucleic acid extraction from serum with two methods on HBV DNA detection by fluorescence quantitative PCR (TaqMan)
LI Jinming WANG Lunan DENG Wei
(National Center for Clinical Laboratory,Beijing 100730, China)
【Abstract】 Objective To investigate the influence of nucleic acid extraction by boiling the serum samples and purifing nucleic acid from serum on HBV DNA detection by PCR. Methods The DNA templates from 2 serum samples with different HBV DNA concentration and 3 serum samples with hemolysis and non-hemolysis for PCR were prepared by two kinds of method, i.e. by boiling the serum to release HBV DNA from the virus particles and by purifing the nucleic acid from serum. Then,the difference of reproducibility and HBV DNA quantitative values by PCR using the templates prepared by the two nucleic acid extraction methods was compared.Results HBV DNA quantitative values by PCR using the templates purified from the two samples were more reproducible(CV: 0.2165 and 0.3262, respectively) than those using the templates prepared by boiling the serum (CV: 0.0699 and 0.1092, respectively). Moreover, when the concentration of hemoglobin in serum samples was higher than 5.89 μg/L, the HBV DNA quantitative values by PCR using the templates purified from the samples were about one-hundred-fold more than those using the templates prepared by boiling the serum (P<0.05).Conclusion The results suggested that the DNA template prepared by boiling the serum is not suitable for HBV DNA quantitative PCR detection, and nucleic acid for PCR must be purified from serum.
, 百拇医药
【Key words】 Polymerase chain reaction;Specimen handling;DNA, viral
乙型肝炎病毒(HBV)DNA的定量测定在乙型肝炎病人的临床治疗监测中有重要参考价值，其前提是定量必须具有很好的重复性。目前国内用于HBV DNA定量测定的方法基本上是荧光定量聚合酶链反应(PCR, TaqMan)技术，这种实时测定技术方便简单，且不易引起污染。影响PCR测定重复性和准确性的因素，除了PCR扩增本身以外，还有一个常被忽略但也非常关键的因素，即标本处理。目前，国内绝大部分用于HBV DNA测定的PCR试剂盒，常采用直接对血清煮沸裂解以释放病毒核酸的方法处理标本，这种方法虽然较经典的核酸提取方法简便，但由于其只是简单地将核酸从病毒颗粒中释放出来，继而用于扩增检测，血清中的一些成分，如血红素可能会对扩增产生抑制作用，从而影响测定。为此，我们比较了核酸提取纯化与煮沸裂解法对HBV DNA荧光定量测定的准确性和重复性的影响，结果报告如下。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料
1.试剂：HBV DNA荧光定量PCR试剂盒由深圳匹基生物技术开发有限公司提供。核酸纯化试剂来自于美国Biotronics公司。
2.仪器：PE5700荧光定量PCR仪(PE，美国)。
二、方法
1.血清标本处理。煮沸裂解法即采用现常用的试剂盒方法，操作简述如下：50 μl血清中加入等体积裂解液，煮沸10 min，离心后取上清直接用于PCR扩增。核酸纯化方法按试剂说明操作，简述如下：于1.5 ml离心管中加入120 μl血清或血浆和200μl STG溶液，充分混匀，80℃ 10 min。15 000 g离心5 min，然后用异丙醇沉淀，KW试剂洗涤，干后备用。该方法较酚-氯仿核酸纯化方法简便易行。
, 百拇医药
2.标本处理方法对测定的重复性的影响。取1份HBV DNA含量较高样本，原样及用阴性人血清稀释100倍后，分别用上述2种样本处理方法各提取15次，然后进行荧光定量测定，比较2种不同方法的测定重复性。
3.血红蛋白干扰试验。取枸橼酸盐抗凝的正常人血，用生理盐水冼涤数次后，加入一定量无菌蒸馏水溶解红细胞，测定血红蛋白含量。取一定量加入至HBV DNA较高含量样本中，至血红蛋白终浓度分别为589μg/L、58.9μg/L和5.89μg/L。然后再对这HBV DNA含量相同，但血红蛋白含量不同的3份样本分别用上述2种样本处理方法双份提取，荧光定量测定HBV DNA，比较结果。
4.统计学分析。血红蛋白含量不同对2种标本处理方法所得测定结果的差异采用t检验。
结果
一、对HBV DNA定量测定重复性的影响
, http://www.100md.com
从表1可见，核酸纯化方法处理标本所得到的测定结果，重复性明显好于煮沸裂解法。同时核酸纯化方法所得的结果，较好地反映出了2个样本之间1∶100稀释的倍比关系。
表1 2种标本处理方法对HBV DNA定量重复性的影响 标本处理
方法
样本
提取
次数
HBVDNA(拷贝数/ml)
s
CV
, 百拇医药
煮沸裂解法
原样
15
7.76×106
2.53×106
0.3260
原样1∶100
15
2.15×105
4.66×104
0.2165
, 百拇医药 核酸纯化
原样
15
3.02×107
3.30×106
0.1090
原样1∶100
15
4.45×105
3.11×104
0.0699
二、血红蛋白对测定结果的干扰(表2)
, 百拇医药
当血清标本中血红蛋白含量大于5.89 μg/L时，采用煮沸裂解法处理标本，测定HBV DNA的含量明显低于核酸纯化方法(P<0.05)。从荧光定量的扩增变化曲线来看，煮沸裂解法处理标本所得的曲线明显较核酸纯化方法平坦。表2 血红蛋白对PCR测定结果的干扰 标本处理
方法
血红蛋白
含量(μg/L)
HBVDNA(拷贝数/ml)
现测值
原测值
煮沸裂解法
5.89
5.80×105
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7.76×106
58.90
6.27×105
7.76×106
589.00
4.33×105
7.76×106
核酸纯化
5.89
2.19×107
3.02×107
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58.90
4.34×107
3.02×107
589.00
9.48×106
3.02×107
讨论
在临床进行血清HBV DNA的PCR测定时，由于煮沸处理标本进而直接扩增较核酸提取纯化法简便快速，因而国内绝大部分试剂盒均采用此种标本处理方法，但国外试剂如Roche公司Amplicor HBV DNA PCR-ELISA定量测定试剂及Biotronics公司的HBV DNA荧光定量PCR试剂均采用核酸纯化方法。
, 百拇医药
HBV DNA定量测定主要是用于乙型肝炎病人治疗的动态观察及疗效判断，这就要求定量测定要有很好的重复性，从而不至于给出错误的信息。我们探讨了目前国内常用的血清标本煮沸处理方法对HBV DNA荧光定量测定重复性的影响，发现其测定的重复性(2份样本的测定CV分别为0.2165和0.3262)明显差于对标本进行核酸纯化后的测定重复性(CV分别为0.0699和0.1092)。这可能是由于煮沸处理血清标本只是将病毒核酸从病毒颗粒中释放出来，因而在吸取离心后的样本上清用于扩增时，样本中很可能或多或少地会含有一些原有的血清标本成分，如血红素及其他一些蛋白等，很难保证在每次吸取时，这些对PCR扩增有干扰的物质的量均是一致的。Roche公司 的Amplicor HBV DNA PCR-ELISA定量测定方法的批内CV小于0.2000[1]。 此外，有研究表明，血红素可通过其卟啉环与Taq酶的不可逆结合而抑制Taq酶活性，从而影响PCR测定[2-4]。本组的结果表明，当血清标本中血红蛋白含量为589.00μg/L，可见血清明显为红色，2种标本处理方法测定结果均有降低，但煮沸处理法更为明显(从7.76×106拷贝数/ml降至4.33×105拷贝数/ml)；当血红蛋白含量为58.90 μg/L，肉眼观察略有红色，而在血红蛋白含量为5.89 μg/L时，肉眼观察不到是否溶血，这种情况在临床很常见。采用煮沸裂解方法处理标本，在扩增模板溶液中会有残留的血红蛋白，血红蛋白可通过对Taq酶的强抑制作用而影响扩增检测。但如能在扩增模板制备即标本处理时，将血红蛋白去除，则不会影响后面的扩增检测。从表2可以看出，核酸纯化方法在这两种情况下，结果均无明显改变，而煮沸处理法结果有明显降低。
, 百拇医药
综上所述，在HBV DNA的PCR定量测定时，用煮沸方法处理标本，操作虽简单一些，但测定的重复性明显不如对标本进行核酸纯化后的测定重复性，并且提取效率亦低些。尤其要引起重视的是，由于血液采集及分离血清过程中的操作原因，临床血清样本常见有轻微溶血，煮沸处理标本可致测定结果明显偏低(降低2个数量级)，这将使得在监测病人治疗中HBV DNA的定量失去诊断价值，而且在定性测定时，也会由于这些抑制物的存在，而使较弱阳性标本的PCR测定出现假阴性结果。
参考文献
1，Kessler HH, Pierer K, Santner BI, et al. Quantitative detection of hepatitis B virus DNA with a new PCR assay. Clin Chem Lab Med, 1998,36:601-604.
2，Neumaier M, Braun A, Wagener C. Fundamentals of quality assessment of molecular amplification methods in clinical diagnostics. Clin Chem, 1998,44:1-26.
, 百拇医药
3，MM3-A. Molecular diagnostic methods for infectious diseases; approved guideline. NCCLS, 1995,15(22):32-33.
4，Higuchi R. Simple and rapid preparation of samples for PCR. In:Erlich HA, eds. PCR technology: principles and applications for DNA ampliofication. New York: Stockton Press, 1989.31-38.
(收稿日期：2000-03-09), 百拇医药