血吸虫重组卡介苗-Sj26GST疫苗的构建及免疫原性的研究
作者：戴五星 皇甫永穆 郑波 程继忠 黄翠华 黄海浪
单位：武汉，同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室 430030
关键词：血吸虫；日本；疫苗；合成；基因表达
中华医学杂志000602 【摘要】 目的 构建含日本血吸虫相对分子质量为26 000的抗原(Sj26GST)基因的重组卡介菌(rBCG)疫苗,观察其对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法 采用分子生物学技术,将Sj26GST cDNA克隆到人结核杆菌热休克蛋白(HSP)70启动子下游,构成融合基因,再将此融合基因亚克隆到E.coli-分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000中,构成重组质粒pBCG-Sj26,然后转化卡介苗(BCG),构成血吸虫重组BCG-Sj26GST(rBCG-Sj26GST)疫苗,经热诱导,在BCG中表达Sj26GST抗原。用rBCG-Sj26GST疫苗皮下免疫BALB/c小鼠,以淋巴细胞刺激指数 (SI)反映细胞增殖能力,以NO释放量检测巨噬细胞吞噬活性,以ELISA试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素(IL)-2和干扰素(IFN)-γ的含量。结果 HSP70启动子与Sj26GST cDNA融合基因已被克隆到pBCG-2000穿梭表达质粒中,相对分子质量为26 000处可见明显的表达蛋白带, 其表达量占菌体总蛋白量的15%。rBCG-Sj26GST疫苗以106菌落形成单位(CFU)经皮下免疫小鼠后, 其脾SI为2.26±0.43，与对照组(1.61±0.28)，载体组(1.48±0.30)和BCG组(1.42±0.26)比较，P<0.05;巨噬细胞NO的含量为357 nmol/ml±84 nmol/ml，与对照组(183 nmol/ml±33 nmol/ml)和载体组(203 nmol/ml±56 nmol/ml)比较，P<0.01；小鼠血清IL-2的含量为267 pg/ml±130 pg/ml，高于对照组(45 pg/ml±15 pg/ml，P<0.01)和载体组(52 pg/ml±29 pg/ml，P<0.05);小鼠血清IFN-γ和脾淋巴细胞培养上清IL-2的含量分别比对照组增高20%和44%, 均有升高趋势。结论 重组的Sj26GST基因能在BCG中高效表达;rBCG-Sj26GST疫苗具有较强的免疫原性,能明显增强BALB/c小鼠的免疫应答反应。
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Construction of recombinant BCG bearing Schistosoma japonicum 26Ku antigen gene and study on its immunogenicity on mice
DAI Wuxing HUANGFU Yongmu ZHENG Bo et al
(Department of Medical Molecular Biology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University,Wuhan 430030, China)
【Abstract】 Objective To construct recombinant BCG vaccine bearing Schistosoma japonicum 26Ku glutathione S-transferase (Sj26GST) gene and determine its immunogenicity on BALB/c mice. Methods Using techniques of molecular biology, human mycobacterium tuberculosis HSP70 promoter and Sj26GST gene were linked to produce a fused gene. The fused gene was cloned into an E.coli-Mycobacterium shuttle plasmid pBCG-2000 to construct an E. coli-Mycobacterium expression shuttle plasmid pBCG-Sj26 that could express Sj26GST gene. Then, the pBCG-Sj26 was introduced by electroporation into mycobacterium bovis BCG to construct a recombinant BCG vaccine bearing Sj26GST gene ( rBCG- Sj26GST). The expression of Sj26GST gene in BCG was induced by heating. The lymphocyte stimulating index (SI), macrophage activity and IL-2, IFN-γ levels of the serum and culture supernatant of spleen lymphocytes were tested after immunization of BALB/c mice with rBCG-Sj26GST vaccine. Results The fused gene of HSP70 promoter and Sj26GST cDNA was inserted into an E. coli- Mycobacterium shuttle expression plasmid by analysing electrophoresis results on PCR products using plasmid pBCG-Sj26 as a templet. The content of rSj26GST contained 15% of total bacterial protein of BCG. The SI of the experimental group was 2.26±0.43, which was significantly higher than those in the control group (1.61±0.28, P<0.05), vector group (1.48±0.30, P<0.05) and BCG group (1.42±0.26, P<0.05). The macrophage NO level of the experimental group was (357.42±84.11) nmol/ml which was significantly higher than those in the control group (183 nmol/ml±33 nmol/ml, P<0.01) and vector group (203 nmol/ml±56 nmol/ml, P<0.01). The serum IL-2 level of the experimental group was (267 pg/ml±130 pg/ml), which was significantly higher than those in the control group (45 pg/ml±15 pg/ml, P<0.01) and vector group (52 pg/ml±29 pg/ ml, P<0.05). Compared with the control group, the serum IFN-γ level increased by 20%, the IL-2 level of the culture supernatant of spleen lymphocytes increased by 44%. Conclusions The foreign gene encoding Sj26 GST can be expressed in BCG. rBCG- Sj26GST vaccine may induce stronger immune response in BALB/c mice than in control, vector and BCG groups.
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【Key words】 Schistosomides； Vaccines synthetic； Gene expression
血吸虫病是世界上严重危害人类健康的主要寄生虫病之一, 因此世界卫生组织已把发展血吸虫病疫苗作为首要目标[1]。在血吸虫所具有免疫保护作用的候选抗原中,尤以日本血吸虫相对分子质量为26 000和曼氏血吸虫相对分子质量为28 000的抗原分子更加引人注目。我们采用分子生物学技术,将日本血吸虫相对分子质量为26 000抗原基因克隆入大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pBCG- 2000中,转化卡介苗(BCG),构成日本血吸虫重组BCG疫苗,并用此疫苗免疫BALB/c小鼠, 为阐明此疫苗抗感染的机制提供实验依据。
材料与方法
一、材料
1.实验动物:雄性BALB/c小鼠,体重18 g±1 g,购自本校实验动物中心。
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2.菌种、质粒、工具酶、引物及主要试剂:E.coli DH5α为本室收藏;质粒pBCG- 2000为本室构建;BCG丹麦株,为北京生物制品研究所提供;质粒pGEX( 含日本血吸虫菲律宾株Sj26GST全长cDNA序列)由美国Wang博士赠送;质粒pMT70( 含人结核杆菌热休克蛋白70的启动子序列)由英国DB Lowrie提供;Middle Brook 7H9 Broh(M7H9) 培养基(0713-17-9)和Middle Brook ADC Enrichment(0714-62)均购自美国Difco公司; 刀豆素A(ConA)、小牛血清、DNA限制性内切酶、修饰酶、dNTP以及DNA和蛋白质相对分子质量标准均购于北京华美生物工程公司;RPMI-1640购于美国Sigma公司;MTT购于瑞士Fluka公司;白细胞介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ检测试剂盒购于美国Endogen公司;HSP启动子和Sj26GST基因寡核苷酸引物分别由上海Sangon生物工程有限公司和本校分子生物学开放实验室合成。
二、方法
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1.HSP70启动子和Sj26GST基因的PCR扩增:首先合成两对寡核苷酸引物:(1)5′-TACGAA-TTCTAGACCGCACG-3′;(2)5′-CCCGACCGCAGGATC-CATGGTG-3′;(3)5′-CCGCTGCAGATGTCCCCTATA-CTAGGTTAT-3′;(4)5′-GTCGTCGACTTATTTTGGAGG-ATGGTCGC-3′。以(1)、(2)为引物,质粒 pMT-70为模板合成长度约为150 bp的HSP70的启动子片段;以(3)、(4)为引物,质粒pGEX为模板合成654 bp的Sj26GST全长cDNA序列。
2.重组DNA技术：参照文献[2]。
3.分枝杆菌的培养、转化与诱导表达：参照文献[3]。
4.SDS-PAGE及蛋白质密度扫描:BCG在生长至对数生长期时(需4周左右),收菌前3 d,每天45℃热诱导45 min,然后离心收获细菌,将BCG悬浮于预冷的磷酸盐缓冲液中,进行超声粉碎,取20 μl用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,考马斯亮蓝染色。SDS-PAGE结果用图像分析系统和岛津薄层扫描仪在波长560 nm处扫描分析。
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5.动物免疫:雄性BALB/c小鼠28只,随机分成4组,每组7只。第1组为空白对照组, 每只鼠皮下注射生理盐水0.1 ml;第2组为空载体组,每只鼠皮下注射含pBCG-2000质粒(不含HSP70启动子和相对分子质量为26 000 GST cDNA)的重组耻垢分枝杆菌0.1 ml(106CFU);第3组为BCG组,每只鼠皮下注射BCG 0.1 ml(106CFU);第4组为实验组,每只鼠皮下注射重组卡介苗(rBCG)-Sj26GST疫苗0.1 ml(106CFU)。免疫8周时,断头处死小鼠,取血、取腹腔巨噬细胞和脾脏进行试验。
6.淋巴细胞转化试验与巨噬细胞NO的测定：参照文献[4]进行。
7.IL-2及IFN-γ的测定:断头取血分离血清,鼠脾淋巴细胞IL-2及IFN-γ的诱生培养参照文献[5]进行。采用ELISA试剂盒测定IL-2和IFN-γ,按说明书操作,在DG3022酶标仪于波长450 nm测A值,检测标准品,血清及脾淋巴细胞培养上清标本。 以标准品的吸光度对浓度绘制标准曲线,求血清及淋巴细胞培养上清中IL-2及IFN-γ的含量。
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8.统计学处理:差异显著性检验采用t检验。
结果
一、rBCG-Sj26GST疫苗的构建及鉴定
如图1所示,将编码Sj26GST的cDNA片段按正确的方向克隆入质粒pMT-70人结核杆菌HSP70启动子下游,然后再将HSP70启动子和目的基因一起克隆到pBCG-2000中, 构成能在大肠杆菌一分枝杆菌表达的pBCG-Sj26质粒。为说明重组体中含有正确连接的 HSP70启动子与Sj26GST基因,且大小与理论值一致,以引物(1)、(4)为引物, 质粒pBCG -Sj26为模板,经PCR扩增合成长度为800 bp左右HSP70-Sj26GST cDNA片段(图2)。表明HSP70启动子与Sj26GST cDNA融合基因已被克隆到穿梭表达质粒中。将pBCG-Sj26质粒转化到BCG中表达,表达的Sj26GST蛋白占BCG总蛋白的15%(图3)。
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E：EcoR Ⅰ；S：Sal Ⅰ；Sm：Sma Ⅱ；Xh：Xho Ⅰ；P：Pst Ⅰ；N：Nco Ⅰ；X：Xba Ⅰ；B：BamH Ⅰ；Ev：EcoRV；H：Hind Ⅱ；K：Kpn Ⅰ；Sc：Sca Ⅰ；Bg：Bgl Ⅰ；Hp：Hpa Ⅰ；Sa：Sac Ⅰ；OriE：大肠杆菌质粒复制起始点；OriM：分枝杆菌质粒复制起始点；Phsp70：人结核杆菌Hsp70启动子；GST：谷胱甘肽S转移酶
图1 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-Sj26的构建
二、rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠淋巴细胞转化功能及巨噬细胞吞噬活性的影响
由表1可见，用rBCG-Sj26GST疫苗按106 CFU经皮下注射免疫BALB/c小鼠,其脾淋巴细胞刺激指数(SI)为2.26±0.43，与对照组(1.61±0.28)，载体组(1.48±0.30)和BCG组(1.42±0.26)相比，差异具有显著意义(P<0.05)；rBCG-Sj26GST组巨噬细胞释放的NO明显高于对照组和载体组(P<0.01),与BCG组相比,其含量虽差异无显著意义(P>0.05),但仍增高35%。
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1.分子量标准；2、3.HSP70启动子；4、5.Sj26GST基因；6、7.HSP70启动子与Sj26GST基因
图2 日本血吸虫26KuGST基因PCR产物
电泳结果
1.分子量标准；2.E.coli DH5α菌体总蛋白；3.Ecoli DH5α(含pGEX)经IPTG诱导后的菌体总蛋白；4.BCG(含pBCG-2000)经热诱导后破菌沉淀部分的蛋白；5.BCG(含pBCG-Sj26)经热诱导后破菌沉淀部分的蛋白；6.BCG(含pBCG-2000)经热诱导后破菌上清部分的蛋白；7.BCG(含pBCG-Sj26)经热诱导后破菌上清部分的蛋白
图3 Sj26GST基因在BCG中表达产物的
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SDS-PAGE图谱
三、rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清及脾淋巴细胞培养上清IL-2及IFN-γ含量的影响
经rBCG-Sj26GST疫苗免疫的小鼠,其血清IL-2的浓度为267 pg/ml±130 pg/ml，明显高于对照组(45 pg/ml±15 pg/ml，P<0.01)和载体组(52 pg/ml±29 pg/ml，P<0.05),脾淋巴细胞培养上清IL-2的浓度为264 pg/ml，较对照组(184 pg/ml)高44%,较载体组(178 pg/ml)高48%，较BCG组(185 pg/ml)高42%,但差异无显著意义(P>0.05)(表2);血清IFN-γ的浓度为1 970 pg/ml,较对照组(1 645 pg/ml)高20%，较载体组(1 649 pg/ml)高19%，较BCG组(1 738 pg/ml)高13%,但差异无显著意义(P>0.05)(表3) 。
, 百拇医药 表1 rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠脾淋巴细胞转化功能和
腹腔巨噬细胞活性的影响(
±s) 组 别
鼠数
刺激指数
NO(nmol/ml)
对照组
7
1.61±0.28
183±33
载体组
7
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1.48±0.30
203±56
BCG组
7
1.42±0.26
264±141
rBCG-Sj26GST组
7
2.26±0.43*
357± 84△▲
注：与对照组、载体组和BCG组比较*t=2.46, 2.75, 2.93，P<0.05；与对照组和载体组比较△t=5.11, 4.03，P<0.01；与BCG组比较▲t=1.50，P>0.05表2 rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清和脾淋巴细胞培养上清
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白细胞介素-2的影响(pg/ml，±s) 组 别
鼠数
血清白细胞
介素-2
培养上清
白细胞介素-2
对照组
7
45± 15
184±141
载体组
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7
52± 29
179± 99
BCG组
7
189±121
185±120
rBCG-Sj26GST组
7
267±130*
264±181△
注：与对照组比较*t=3.16，P<0.01；△t=0.92，P>0.05；与载体组比较*t=3.03，P<0.05；△t=1.02,P>0.05；与BCG组比较*t=0.94，P>0.05；△t=0.95，P>0.05表3 rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清干扰素-γ
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含量的影响(pg/ml，±s) 组 别
鼠数
血清干扰素-γ
对照组
7
1 645±201
载体组
7
1 649±348
BCG组
7
, http://www.100md.com 1 738±199
rBCG-Sj26GST组
7
1 970±331*
注：与对照组、载体组和BCG组比较*t=2.13, 1.69, 1.56，P>0.05讨论
BCG以其免疫佐剂作用强、安全,被认为是发展成为一种活重组疫苗的理想载体,近年科学家们已将多种外源基因导入BCG中表达[6]。但要使外源基因在BCG中表达,首要条件是所用表达质粒含有能被分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶所识别的启动子。人结核杆菌HSP70启动子是一种高效可控启动子,在受到热及过氧化物等处理时能启动其下游基因的转录,而且当BCG在体内被巨噬细胞吞噬后,可活化HSP70启动子。我们在构建rBCG-Sj26GST疫苗时也选用了人结核杆菌HSP70启动子。结果证明,这种启动子能启动Sj26GST基因在BCG中高效表达,表达的Sj26GST蛋白占菌体总蛋白的15%左右。
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重组的BCG疫苗接种后,通过补体和单核巨噬细胞表面甘露糖受体结合而被吞噬,并在其中生存和复制,表达重组的Sj26GST抗原和BCG自身蛋白,分泌或释放到吞噬体内,经抗原提呈细胞(APC)提取处理后,形成的抗原肽-MHCⅡ类分子或抗原肽-MHCⅠ类分子复合物被高尔基体运送到APC表面,分别供CD4+或CD8+T细胞的TCR识别,许多CD分子和粘附分子也参与抗原提呈与信息传递过程。T细胞活化后,增殖分化形成效应性 Th细胞,其中Th1分泌IL-2和IFN-γ在细胞介导的免疫中发挥作用,IL-2和IFN- γ能增强抗原递呈过程,内源性IFN-γ可促使T细胞分化为Th1细胞,产生更多的IFN-γ, 起到一种正反馈调控作用。而Th2则分泌IL-4、IL-5和IL-10，在抗体的产生中发挥作用[7]。本结果显示,用rBCG-Sj26GST疫苗以106CFU的剂量经皮下免疫BALB/c小鼠后,血清IL-2的含量明显高于对照组和载体组,与BCG组相比较差异无显著意义；脾淋巴细胞培养上清IL-2的含量分别较对照组高44%,较载体组高48%，较BCG组高42%；血清IFN-γ的浓度较对照组高20%,较载体组高19%，较BCG组高13%。提示，rBCG-Sj26GST疫苗能有效刺激宿主细胞产生IL-2和IFN-γ。
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近年的研究表明,巨噬细胞产生的NO在抗感染中起着重要作用。IFN-γ、IL-1、 IL-2、TNF-α、GM-CSF以及LPS、BCG等均可单独或联合刺激巨噬细胞产生NO。NO及其衍生物统称为活性氮介质,在多种抗感染和非特异性免疫中发挥作用[7]。本结果显示,rBCG-Sj26GST疫苗可明显增高BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO的含量(P<0.01)。表明巨噬细胞的吞噬活性明显增强,有利于杀灭病原体。
基金项目：总理基金(94-Y-19)和国家自然科学基金(39480022)资助项目
参考文献
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, 百拇医药
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4，程继忠,郑波,肖红,等.结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究.中华微生物学和免疫学杂志,1998,18:337-341.
5，沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术.武汉:湖北省科学出版社,1998.261,277.
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6，Murray PJ, Aldovini A, Young RA. Manipulation and potentiation of antimycobacterial immunity using recombinant bacille Calmette- Guerin strains that secrete cytokines. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:934-939.
7，Yang J, Mitsuyama M. An essential role for endogenous interferon-γ in the genenation of protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Immunology, 1997,91:529-535.
(收稿日期：1999-06-02), 百拇医药
单位：武汉，同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室 430030
关键词：血吸虫；日本；疫苗；合成；基因表达
中华医学杂志000602 【摘要】 目的 构建含日本血吸虫相对分子质量为26 000的抗原(Sj26GST)基因的重组卡介菌(rBCG)疫苗,观察其对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法 采用分子生物学技术,将Sj26GST cDNA克隆到人结核杆菌热休克蛋白(HSP)70启动子下游,构成融合基因,再将此融合基因亚克隆到E.coli-分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000中,构成重组质粒pBCG-Sj26,然后转化卡介苗(BCG),构成血吸虫重组BCG-Sj26GST(rBCG-Sj26GST)疫苗,经热诱导,在BCG中表达Sj26GST抗原。用rBCG-Sj26GST疫苗皮下免疫BALB/c小鼠,以淋巴细胞刺激指数 (SI)反映细胞增殖能力,以NO释放量检测巨噬细胞吞噬活性,以ELISA试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素(IL)-2和干扰素(IFN)-γ的含量。结果 HSP70启动子与Sj26GST cDNA融合基因已被克隆到pBCG-2000穿梭表达质粒中,相对分子质量为26 000处可见明显的表达蛋白带, 其表达量占菌体总蛋白量的15%。rBCG-Sj26GST疫苗以106菌落形成单位(CFU)经皮下免疫小鼠后, 其脾SI为2.26±0.43，与对照组(1.61±0.28)，载体组(1.48±0.30)和BCG组(1.42±0.26)比较，P<0.05;巨噬细胞NO的含量为357 nmol/ml±84 nmol/ml，与对照组(183 nmol/ml±33 nmol/ml)和载体组(203 nmol/ml±56 nmol/ml)比较，P<0.01；小鼠血清IL-2的含量为267 pg/ml±130 pg/ml，高于对照组(45 pg/ml±15 pg/ml，P<0.01)和载体组(52 pg/ml±29 pg/ml，P<0.05);小鼠血清IFN-γ和脾淋巴细胞培养上清IL-2的含量分别比对照组增高20%和44%, 均有升高趋势。结论 重组的Sj26GST基因能在BCG中高效表达;rBCG-Sj26GST疫苗具有较强的免疫原性,能明显增强BALB/c小鼠的免疫应答反应。
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Construction of recombinant BCG bearing Schistosoma japonicum 26Ku antigen gene and study on its immunogenicity on mice
DAI Wuxing HUANGFU Yongmu ZHENG Bo et al
(Department of Medical Molecular Biology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University,Wuhan 430030, China)
【Abstract】 Objective To construct recombinant BCG vaccine bearing Schistosoma japonicum 26Ku glutathione S-transferase (Sj26GST) gene and determine its immunogenicity on BALB/c mice. Methods Using techniques of molecular biology, human mycobacterium tuberculosis HSP70 promoter and Sj26GST gene were linked to produce a fused gene. The fused gene was cloned into an E.coli-Mycobacterium shuttle plasmid pBCG-2000 to construct an E. coli-Mycobacterium expression shuttle plasmid pBCG-Sj26 that could express Sj26GST gene. Then, the pBCG-Sj26 was introduced by electroporation into mycobacterium bovis BCG to construct a recombinant BCG vaccine bearing Sj26GST gene ( rBCG- Sj26GST). The expression of Sj26GST gene in BCG was induced by heating. The lymphocyte stimulating index (SI), macrophage activity and IL-2, IFN-γ levels of the serum and culture supernatant of spleen lymphocytes were tested after immunization of BALB/c mice with rBCG-Sj26GST vaccine. Results The fused gene of HSP70 promoter and Sj26GST cDNA was inserted into an E. coli- Mycobacterium shuttle expression plasmid by analysing electrophoresis results on PCR products using plasmid pBCG-Sj26 as a templet. The content of rSj26GST contained 15% of total bacterial protein of BCG. The SI of the experimental group was 2.26±0.43, which was significantly higher than those in the control group (1.61±0.28, P<0.05), vector group (1.48±0.30, P<0.05) and BCG group (1.42±0.26, P<0.05). The macrophage NO level of the experimental group was (357.42±84.11) nmol/ml which was significantly higher than those in the control group (183 nmol/ml±33 nmol/ml, P<0.01) and vector group (203 nmol/ml±56 nmol/ml, P<0.01). The serum IL-2 level of the experimental group was (267 pg/ml±130 pg/ml), which was significantly higher than those in the control group (45 pg/ml±15 pg/ml, P<0.01) and vector group (52 pg/ml±29 pg/ ml, P<0.05). Compared with the control group, the serum IFN-γ level increased by 20%, the IL-2 level of the culture supernatant of spleen lymphocytes increased by 44%. Conclusions The foreign gene encoding Sj26 GST can be expressed in BCG. rBCG- Sj26GST vaccine may induce stronger immune response in BALB/c mice than in control, vector and BCG groups.
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血吸虫病是世界上严重危害人类健康的主要寄生虫病之一, 因此世界卫生组织已把发展血吸虫病疫苗作为首要目标[1]。在血吸虫所具有免疫保护作用的候选抗原中,尤以日本血吸虫相对分子质量为26 000和曼氏血吸虫相对分子质量为28 000的抗原分子更加引人注目。我们采用分子生物学技术,将日本血吸虫相对分子质量为26 000抗原基因克隆入大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pBCG- 2000中,转化卡介苗(BCG),构成日本血吸虫重组BCG疫苗,并用此疫苗免疫BALB/c小鼠, 为阐明此疫苗抗感染的机制提供实验依据。
材料与方法
一、材料
1.实验动物:雄性BALB/c小鼠,体重18 g±1 g,购自本校实验动物中心。
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2.菌种、质粒、工具酶、引物及主要试剂:E.coli DH5α为本室收藏;质粒pBCG- 2000为本室构建;BCG丹麦株,为北京生物制品研究所提供;质粒pGEX( 含日本血吸虫菲律宾株Sj26GST全长cDNA序列)由美国Wang博士赠送;质粒pMT70( 含人结核杆菌热休克蛋白70的启动子序列)由英国DB Lowrie提供;Middle Brook 7H9 Broh(M7H9) 培养基(0713-17-9)和Middle Brook ADC Enrichment(0714-62)均购自美国Difco公司; 刀豆素A(ConA)、小牛血清、DNA限制性内切酶、修饰酶、dNTP以及DNA和蛋白质相对分子质量标准均购于北京华美生物工程公司;RPMI-1640购于美国Sigma公司;MTT购于瑞士Fluka公司;白细胞介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ检测试剂盒购于美国Endogen公司;HSP启动子和Sj26GST基因寡核苷酸引物分别由上海Sangon生物工程有限公司和本校分子生物学开放实验室合成。
二、方法
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1.HSP70启动子和Sj26GST基因的PCR扩增:首先合成两对寡核苷酸引物:(1)5′-TACGAA-TTCTAGACCGCACG-3′;(2)5′-CCCGACCGCAGGATC-CATGGTG-3′;(3)5′-CCGCTGCAGATGTCCCCTATA-CTAGGTTAT-3′;(4)5′-GTCGTCGACTTATTTTGGAGG-ATGGTCGC-3′。以(1)、(2)为引物,质粒 pMT-70为模板合成长度约为150 bp的HSP70的启动子片段;以(3)、(4)为引物,质粒pGEX为模板合成654 bp的Sj26GST全长cDNA序列。
2.重组DNA技术：参照文献[2]。
3.分枝杆菌的培养、转化与诱导表达：参照文献[3]。
4.SDS-PAGE及蛋白质密度扫描:BCG在生长至对数生长期时(需4周左右),收菌前3 d,每天45℃热诱导45 min,然后离心收获细菌,将BCG悬浮于预冷的磷酸盐缓冲液中,进行超声粉碎,取20 μl用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,考马斯亮蓝染色。SDS-PAGE结果用图像分析系统和岛津薄层扫描仪在波长560 nm处扫描分析。
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5.动物免疫:雄性BALB/c小鼠28只,随机分成4组,每组7只。第1组为空白对照组, 每只鼠皮下注射生理盐水0.1 ml;第2组为空载体组,每只鼠皮下注射含pBCG-2000质粒(不含HSP70启动子和相对分子质量为26 000 GST cDNA)的重组耻垢分枝杆菌0.1 ml(106CFU);第3组为BCG组,每只鼠皮下注射BCG 0.1 ml(106CFU);第4组为实验组,每只鼠皮下注射重组卡介苗(rBCG)-Sj26GST疫苗0.1 ml(106CFU)。免疫8周时,断头处死小鼠,取血、取腹腔巨噬细胞和脾脏进行试验。
6.淋巴细胞转化试验与巨噬细胞NO的测定：参照文献[4]进行。
7.IL-2及IFN-γ的测定:断头取血分离血清,鼠脾淋巴细胞IL-2及IFN-γ的诱生培养参照文献[5]进行。采用ELISA试剂盒测定IL-2和IFN-γ,按说明书操作,在DG3022酶标仪于波长450 nm测A值,检测标准品,血清及脾淋巴细胞培养上清标本。 以标准品的吸光度对浓度绘制标准曲线,求血清及淋巴细胞培养上清中IL-2及IFN-γ的含量。
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8.统计学处理:差异显著性检验采用t检验。
结果
一、rBCG-Sj26GST疫苗的构建及鉴定
如图1所示,将编码Sj26GST的cDNA片段按正确的方向克隆入质粒pMT-70人结核杆菌HSP70启动子下游,然后再将HSP70启动子和目的基因一起克隆到pBCG-2000中, 构成能在大肠杆菌一分枝杆菌表达的pBCG-Sj26质粒。为说明重组体中含有正确连接的 HSP70启动子与Sj26GST基因,且大小与理论值一致,以引物(1)、(4)为引物, 质粒pBCG -Sj26为模板,经PCR扩增合成长度为800 bp左右HSP70-Sj26GST cDNA片段(图2)。表明HSP70启动子与Sj26GST cDNA融合基因已被克隆到穿梭表达质粒中。将pBCG-Sj26质粒转化到BCG中表达,表达的Sj26GST蛋白占BCG总蛋白的15%(图3)。
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E：EcoR Ⅰ；S：Sal Ⅰ；Sm：Sma Ⅱ；Xh：Xho Ⅰ；P：Pst Ⅰ；N：Nco Ⅰ；X：Xba Ⅰ；B：BamH Ⅰ；Ev：EcoRV；H：Hind Ⅱ；K：Kpn Ⅰ；Sc：Sca Ⅰ；Bg：Bgl Ⅰ；Hp：Hpa Ⅰ；Sa：Sac Ⅰ；OriE：大肠杆菌质粒复制起始点；OriM：分枝杆菌质粒复制起始点；Phsp70：人结核杆菌Hsp70启动子；GST：谷胱甘肽S转移酶
图1 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-Sj26的构建
二、rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠淋巴细胞转化功能及巨噬细胞吞噬活性的影响
由表1可见，用rBCG-Sj26GST疫苗按106 CFU经皮下注射免疫BALB/c小鼠,其脾淋巴细胞刺激指数(SI)为2.26±0.43，与对照组(1.61±0.28)，载体组(1.48±0.30)和BCG组(1.42±0.26)相比，差异具有显著意义(P<0.05)；rBCG-Sj26GST组巨噬细胞释放的NO明显高于对照组和载体组(P<0.01),与BCG组相比,其含量虽差异无显著意义(P>0.05),但仍增高35%。
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1.分子量标准；2、3.HSP70启动子；4、5.Sj26GST基因；6、7.HSP70启动子与Sj26GST基因
图2 日本血吸虫26KuGST基因PCR产物
电泳结果
1.分子量标准；2.E.coli DH5α菌体总蛋白；3.Ecoli DH5α(含pGEX)经IPTG诱导后的菌体总蛋白；4.BCG(含pBCG-2000)经热诱导后破菌沉淀部分的蛋白；5.BCG(含pBCG-Sj26)经热诱导后破菌沉淀部分的蛋白；6.BCG(含pBCG-2000)经热诱导后破菌上清部分的蛋白；7.BCG(含pBCG-Sj26)经热诱导后破菌上清部分的蛋白
图3 Sj26GST基因在BCG中表达产物的
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SDS-PAGE图谱
三、rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清及脾淋巴细胞培养上清IL-2及IFN-γ含量的影响
经rBCG-Sj26GST疫苗免疫的小鼠,其血清IL-2的浓度为267 pg/ml±130 pg/ml，明显高于对照组(45 pg/ml±15 pg/ml，P<0.01)和载体组(52 pg/ml±29 pg/ml，P<0.05),脾淋巴细胞培养上清IL-2的浓度为264 pg/ml，较对照组(184 pg/ml)高44%,较载体组(178 pg/ml)高48%，较BCG组(185 pg/ml)高42%,但差异无显著意义(P>0.05)(表2);血清IFN-γ的浓度为1 970 pg/ml,较对照组(1 645 pg/ml)高20%，较载体组(1 649 pg/ml)高19%，较BCG组(1 738 pg/ml)高13%,但差异无显著意义(P>0.05)(表3) 。
, 百拇医药 表1 rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠脾淋巴细胞转化功能和
腹腔巨噬细胞活性的影响(
±s) 组 别鼠数
刺激指数
NO(nmol/ml)
对照组
7
1.61±0.28
183±33
载体组
7
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1.48±0.30
203±56
BCG组
7
1.42±0.26
264±141
rBCG-Sj26GST组
7
2.26±0.43*
357± 84△▲
注：与对照组、载体组和BCG组比较*t=2.46, 2.75, 2.93，P<0.05；与对照组和载体组比较△t=5.11, 4.03，P<0.01；与BCG组比较▲t=1.50，P>0.05表2 rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清和脾淋巴细胞培养上清
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白细胞介素-2的影响(pg/ml，
±s) 组 别鼠数
血清白细胞
介素-2
培养上清
白细胞介素-2
对照组
7
45± 15
184±141
载体组
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7
52± 29
179± 99
BCG组
7
189±121
185±120
rBCG-Sj26GST组
7
267±130*
264±181△
注：与对照组比较*t=3.16，P<0.01；△t=0.92，P>0.05；与载体组比较*t=3.03，P<0.05；△t=1.02,P>0.05；与BCG组比较*t=0.94，P>0.05；△t=0.95，P>0.05表3 rBCG-Sj26GST疫苗对小鼠血清干扰素-γ
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含量的影响(pg/ml，
±s) 组 别鼠数
血清干扰素-γ
对照组
7
1 645±201
载体组
7
1 649±348
BCG组
7
, http://www.100md.com 1 738±199
rBCG-Sj26GST组
7
1 970±331*
注：与对照组、载体组和BCG组比较*t=2.13, 1.69, 1.56，P>0.05讨论
BCG以其免疫佐剂作用强、安全,被认为是发展成为一种活重组疫苗的理想载体,近年科学家们已将多种外源基因导入BCG中表达[6]。但要使外源基因在BCG中表达,首要条件是所用表达质粒含有能被分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶所识别的启动子。人结核杆菌HSP70启动子是一种高效可控启动子,在受到热及过氧化物等处理时能启动其下游基因的转录,而且当BCG在体内被巨噬细胞吞噬后,可活化HSP70启动子。我们在构建rBCG-Sj26GST疫苗时也选用了人结核杆菌HSP70启动子。结果证明,这种启动子能启动Sj26GST基因在BCG中高效表达,表达的Sj26GST蛋白占菌体总蛋白的15%左右。
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重组的BCG疫苗接种后,通过补体和单核巨噬细胞表面甘露糖受体结合而被吞噬,并在其中生存和复制,表达重组的Sj26GST抗原和BCG自身蛋白,分泌或释放到吞噬体内,经抗原提呈细胞(APC)提取处理后,形成的抗原肽-MHCⅡ类分子或抗原肽-MHCⅠ类分子复合物被高尔基体运送到APC表面,分别供CD4+或CD8+T细胞的TCR识别,许多CD分子和粘附分子也参与抗原提呈与信息传递过程。T细胞活化后,增殖分化形成效应性 Th细胞,其中Th1分泌IL-2和IFN-γ在细胞介导的免疫中发挥作用,IL-2和IFN- γ能增强抗原递呈过程,内源性IFN-γ可促使T细胞分化为Th1细胞,产生更多的IFN-γ, 起到一种正反馈调控作用。而Th2则分泌IL-4、IL-5和IL-10，在抗体的产生中发挥作用[7]。本结果显示,用rBCG-Sj26GST疫苗以106CFU的剂量经皮下免疫BALB/c小鼠后,血清IL-2的含量明显高于对照组和载体组,与BCG组相比较差异无显著意义；脾淋巴细胞培养上清IL-2的含量分别较对照组高44%,较载体组高48%，较BCG组高42%；血清IFN-γ的浓度较对照组高20%,较载体组高19%，较BCG组高13%。提示，rBCG-Sj26GST疫苗能有效刺激宿主细胞产生IL-2和IFN-γ。
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近年的研究表明,巨噬细胞产生的NO在抗感染中起着重要作用。IFN-γ、IL-1、 IL-2、TNF-α、GM-CSF以及LPS、BCG等均可单独或联合刺激巨噬细胞产生NO。NO及其衍生物统称为活性氮介质,在多种抗感染和非特异性免疫中发挥作用[7]。本结果显示,rBCG-Sj26GST疫苗可明显增高BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO的含量(P<0.01)。表明巨噬细胞的吞噬活性明显增强,有利于杀灭病原体。
基金项目：总理基金(94-Y-19)和国家自然科学基金(39480022)资助项目
参考文献
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4，程继忠,郑波,肖红,等.结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究.中华微生物学和免疫学杂志,1998,18:337-341.
5，沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术.武汉:湖北省科学出版社,1998.261,277.
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7，Yang J, Mitsuyama M. An essential role for endogenous interferon-γ in the genenation of protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Immunology, 1997,91:529-535.
(收稿日期：1999-06-02), 百拇医药