轮状病毒疫苗与转基因植物
作者：朱进 张云 郭恒彬 唐家琪
单位：朱进(210002 解放军南京军区军事医学研究所流行病学研究室)；张云(210002 解放军南京军区军事医学研究所流行病学研究室)；郭恒彬(210002 解放军南京军区军事医学研究所流行病学研究室)；唐家琪(210002 解放军南京军区军事医学研究所流行病学研究室)
关键词：
中华预防医学杂志000221 轮状病毒(rotavirus, RV)为呼肠病毒科轮状病毒属病毒。只有具备内外双层衣壳的光滑型的病毒才具有传染性。这双层颗粒中含有RNA聚合酶和其他一些能合成mRNA的酶[1]。RV基因组为包含11个片段的双股RNA(dsRNA)，位于病毒体的核心。每一个片段各编码1种蛋白，VP1～4，VP6和VP7 6种结构蛋白，其中VP4经胰蛋白酶裂解可产生具有增强病毒感染性的VP5和VP8；5种非结构蛋白为NSP1～NSP5[2]。
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轮状病毒感染病变部位在小肠上皮组织，表现为绒毛变短且脱落、线粒体肿胀、内质网池膨胀、单核细胞浸润固有层等。人们推测，这种细胞损害加上细胞失去对液体和电解质控制的能力，可造成严重腹泻。但轮状病毒11种蛋白质中没有一种基因产物明确与毒力有关，而这一关系可能对疾病的治疗或疫苗研制、区分毒力株与减毒株或了解减毒机理有一定作用。
轮状病毒是婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体。全世界3岁以下的儿童中，90%受到RV感染[3、4] ，每年死于RV感染婴幼儿超过800万。成人轮状病毒感染引起胃肠炎爆发，不过一般见到的都是亚临床症状。RV感染还可以引起许多其他疾病[5]。迄今，对RV感染最有力的预防和控制措施，仍是发展有效的疫苗。
轮状病毒疫苗的研制工作进展很快，取得了一些突破性成果。首先，人们认识到原发性感染可诱导抗轮状病毒的自然免疫力，从而保护儿童抵抗严重疾病。其次，该病毒可通过细胞培养加以增殖，使人们有能力制备出疫苗毒种。第三，人和动物病毒株可诱导交叉保护力，可以利用对人类天然减毒或无毒的动物病毒株作为第一代异型候选疫苗加以试验。在某些人群中，由动物病毒株制备的口服活疫苗十分安全有效，保护率可达80%以上，但是在另一些人群中则没有效果。这种差异部分归咎于流行株的血清型不同，及动物株有时不能激发异型保护。
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轮状病毒11个双链RNA节段中有2个编码外壳蛋白，即VP4血凝素突起和VP7糖蛋白，它们是病毒中和反应的主要目标。用这4型病毒共同感染细胞，在选择压力下病毒基因节段会发生重排，人们即可从重排后的病毒中挑选出合适的疫苗候选株。候选株中含有来源于动物病毒的10个基因节段和单个编码一种外壳蛋白的基因，后者源于所有4个主要人类病毒株。把这些重配物混合起来即可形成四价疫苗，给儿童口服接种后可预防严重轮状病毒腹泻，有效率可达80%以上，与由自然感染获得的保护率相似[6]。
轮状病毒重组多肽疫苗的研究主要是运用基因工程方法,表达1个或多个病毒抗原蛋白或抗原表位作亚单位疫苗，即保留了其抗原表位的空间构象，又能被宿主免疫系统识别。外壳蛋白VP4作为同源抗原具有良好的免疫特性，但并不能诱导良好的异源中和抗体，而外壳蛋白VP7在诱导异源性中和抗体方面发挥着重要作用。VP7能有效地刺激肠道初次局部免疫反应，特别是经胃肠外途经接种该抗原更是如此。要获得确实有效的RV疫苗也许需要研制VP4和VP7联合组成的重组疫苗，同时更应注重研究细胞免疫在抗感染中的机制，以调动全面免疫反应来有效地控制野毒株的感染。
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目前，基因工程表达的轮状病毒蛋白主要是VP4，而且多是由大肠杆菌表达系统表达。该表达系统使需要糖基化的外壳蛋白VP7表达受到限制，而且联合表达时外源基因较大，一般表达系统都不能满足要求。植物基因转化技术的发展和完善，为该问题的解决提供了途径。
随着分子生物学技术的高速发展和植物细胞培养及再生方法的完善，人类在成功改变植物遗传性状的同时，尝试将转基因植物转变为人类所需昂贵药品的廉价的“生产工厂”[7]。最近的研究表明，将细菌性和病毒性病原体抗原的编码基因，导入植物细胞，能够表达出较好保留天然免疫原性的抗原，这些研究结果为转基因植物作为疫苗等药品的生产系统提供了良好的基础。
利用转基因植物生产基因工程疫苗已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位、链球菌属突变株表面蛋白 、鼻病毒抗原和艾滋病病毒抗原等10多种疫苗。用转基因植物生产的疫苗保持了重组蛋白的理化特性和生物活性，有的提纯后用作疫苗，有的则不经提纯就能作为一种食品疫苗口服使用，这些重组蛋白基因可长期贮存于种子中，便于疫苗的运输和推广。因此转基因植物作为廉价的疫苗生产系统，有可能代替发酵系统生产疫苗等药品。
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用转基因植物生产重组蛋白具有以下优势：①在真核细胞表达系统中，与动物细胞比较，培养条件简单，便于遗传操作的进行，可降低成本，大量生产抗原；②植物培养细胞具有全能性，能够再生植株，可通过大面积栽培转基因植株来获得非常廉价的免疫试剂；③转基因植物中的外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组，进而生产一种方便、高效的多联口服疫苗；④转基因植株的种子易于贮存，有利于重组蛋白的生产和运输；⑤植物病毒不感染人类，用植物细胞生产重组蛋白更为安全[8]；⑥植物细胞有与动物细胞相似的结构和功能， 有利于重组蛋白的正确装配和表达。
1995年Mason将乙型肝炎表面抗原基因转入马铃薯细胞中表达，用薯块饲喂小鼠后，在小鼠体内检测到特异性保护抗体，包括黏膜抗体，分泌到循环系统中抵御病毒的侵染。美国Prodigene公司自称是第1个销售转基因植物生产重组蛋白的公司， 同时声称用转基因植物研制可食用疫苗的工作已步入正轨，人们进食这种疫苗后，可对食物中所含抗原产生免疫反应。如服用转基因植物表达的霍乱弧菌B亚单位作为口服疫苗，能抵抗霍乱和产肠毒素性大肠杆菌。Prodigene公司还用转基因植物为Sigma化学公司生产诊断试剂，其中56种已申请或获得专利。
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利用转基因植物表达人类病毒蛋白，生产疫苗抗原并保留其天然免疫原性的蛋白质构象，这为疫苗的“生物制药”提供了可能。通过改变植物的遗传物质，生产大量而廉价的药物，从而保护发展中国家的儿童免受传统杀手如病菌性腹泻和霍乱等的危害。利用植物细胞表达系统生产治疗性和诊断性蛋白，较哺乳动物细胞或微生物制备节省了昂贵的培养和发酵系统开支，却能获得天然活性的重组蛋白，1995年Moffat等指出，利用转基因植物开发新型疫苗等药品，是一种有效的经济来源， 从长远观点看，植物将在未来的疫苗和药物市场中占主导地位[9，10]。
当然用转基因植物生产疫苗等药品也存在一些问题有待解决，首先是如何有效地提高外源蛋白的表达量，表达量最高可达可溶性蛋白的14%，但大多数蛋白的表达量不高，其理化性质和生物活性与动物和细菌来源的蛋白之间存在一些差异。其次，植物糖基化模式与动物糖基化模式的不同是否会影响其抗原的特异性，目前还未见报道，有待于进一步研究。从植物细胞中提纯特定蛋白的纯化工艺也需完善，有效去除混杂在其中的植物碱和植物毒素也是生产中不可忽视的问题之一[11]。
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参考文献
[1]赵长安，刘作义. 轮状病毒感染的研究现状. 国外医学流行病学与传染病学分册，1998，25：145-148.
[2]Bishop RF. Development of candidate rotavirusv vaccines. Vaccine, 1993, 11:247-254.
[3]Estes MK,Cohen J. Rotavirus gene structure and function. Microbiol Rev,1989,53:410-449.
[4]Kapikian AZ, Chanock RM. Rotavirus. In: Fields BN，Knipe DM，eds. Virology. 2nd ed. USA:Raven Press,1990. 1353-1404.
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[5]Bishop RF. Natural history of human rotavirus infections. In: Kapikian AZ, ed, Viral infections of the gastrointerstinal tract. New York: Marcel Dekker Inc, 1994. 131-167.
[6]Mason HS,Lam DM, Arntzen CJ. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plant. Proc Natl Acad Sci U S A,1992,89:11745-11749.
[7]Arakawa T, Chong DK, Langride WH. Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin B subunit vaccine . Nat Biotechnol,1998,16:292-297.
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[8]王新国，张国华，肖成祖. 植物生物反应器生产异源蛋白. 生物技术通讯，1999，3：217-226.
[9]Haq TA, Mason HS, Clements JD,et al. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. Science, 1995, 268: 714-716.
[10]Mason HS, Arntzen CJ. Transgenic plants as vaccine production systems. Trends Biotechnol, 1995, 13:388-392.
[11]Hunt AG. Plant cells do not properly recognize animal gene polyadenylation sequence. Plant Mol Biol, 1987,8:23-26.
收稿日期：1999-06-25, http://www.100md.com
单位：朱进(210002 解放军南京军区军事医学研究所流行病学研究室)；张云(210002 解放军南京军区军事医学研究所流行病学研究室)；郭恒彬(210002 解放军南京军区军事医学研究所流行病学研究室)；唐家琪(210002 解放军南京军区军事医学研究所流行病学研究室)
关键词：
中华预防医学杂志000221 轮状病毒(rotavirus, RV)为呼肠病毒科轮状病毒属病毒。只有具备内外双层衣壳的光滑型的病毒才具有传染性。这双层颗粒中含有RNA聚合酶和其他一些能合成mRNA的酶[1]。RV基因组为包含11个片段的双股RNA(dsRNA)，位于病毒体的核心。每一个片段各编码1种蛋白，VP1～4，VP6和VP7 6种结构蛋白，其中VP4经胰蛋白酶裂解可产生具有增强病毒感染性的VP5和VP8；5种非结构蛋白为NSP1～NSP5[2]。
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轮状病毒感染病变部位在小肠上皮组织，表现为绒毛变短且脱落、线粒体肿胀、内质网池膨胀、单核细胞浸润固有层等。人们推测，这种细胞损害加上细胞失去对液体和电解质控制的能力，可造成严重腹泻。但轮状病毒11种蛋白质中没有一种基因产物明确与毒力有关，而这一关系可能对疾病的治疗或疫苗研制、区分毒力株与减毒株或了解减毒机理有一定作用。
轮状病毒是婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体。全世界3岁以下的儿童中，90%受到RV感染[3、4] ，每年死于RV感染婴幼儿超过800万。成人轮状病毒感染引起胃肠炎爆发，不过一般见到的都是亚临床症状。RV感染还可以引起许多其他疾病[5]。迄今，对RV感染最有力的预防和控制措施，仍是发展有效的疫苗。
轮状病毒疫苗的研制工作进展很快，取得了一些突破性成果。首先，人们认识到原发性感染可诱导抗轮状病毒的自然免疫力，从而保护儿童抵抗严重疾病。其次，该病毒可通过细胞培养加以增殖，使人们有能力制备出疫苗毒种。第三，人和动物病毒株可诱导交叉保护力，可以利用对人类天然减毒或无毒的动物病毒株作为第一代异型候选疫苗加以试验。在某些人群中，由动物病毒株制备的口服活疫苗十分安全有效，保护率可达80%以上，但是在另一些人群中则没有效果。这种差异部分归咎于流行株的血清型不同，及动物株有时不能激发异型保护。
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轮状病毒11个双链RNA节段中有2个编码外壳蛋白，即VP4血凝素突起和VP7糖蛋白，它们是病毒中和反应的主要目标。用这4型病毒共同感染细胞，在选择压力下病毒基因节段会发生重排，人们即可从重排后的病毒中挑选出合适的疫苗候选株。候选株中含有来源于动物病毒的10个基因节段和单个编码一种外壳蛋白的基因，后者源于所有4个主要人类病毒株。把这些重配物混合起来即可形成四价疫苗，给儿童口服接种后可预防严重轮状病毒腹泻，有效率可达80%以上，与由自然感染获得的保护率相似[6]。
轮状病毒重组多肽疫苗的研究主要是运用基因工程方法,表达1个或多个病毒抗原蛋白或抗原表位作亚单位疫苗，即保留了其抗原表位的空间构象，又能被宿主免疫系统识别。外壳蛋白VP4作为同源抗原具有良好的免疫特性，但并不能诱导良好的异源中和抗体，而外壳蛋白VP7在诱导异源性中和抗体方面发挥着重要作用。VP7能有效地刺激肠道初次局部免疫反应，特别是经胃肠外途经接种该抗原更是如此。要获得确实有效的RV疫苗也许需要研制VP4和VP7联合组成的重组疫苗，同时更应注重研究细胞免疫在抗感染中的机制，以调动全面免疫反应来有效地控制野毒株的感染。
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目前，基因工程表达的轮状病毒蛋白主要是VP4，而且多是由大肠杆菌表达系统表达。该表达系统使需要糖基化的外壳蛋白VP7表达受到限制，而且联合表达时外源基因较大，一般表达系统都不能满足要求。植物基因转化技术的发展和完善，为该问题的解决提供了途径。
随着分子生物学技术的高速发展和植物细胞培养及再生方法的完善，人类在成功改变植物遗传性状的同时，尝试将转基因植物转变为人类所需昂贵药品的廉价的“生产工厂”[7]。最近的研究表明，将细菌性和病毒性病原体抗原的编码基因，导入植物细胞，能够表达出较好保留天然免疫原性的抗原，这些研究结果为转基因植物作为疫苗等药品的生产系统提供了良好的基础。
利用转基因植物生产基因工程疫苗已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位、链球菌属突变株表面蛋白 、鼻病毒抗原和艾滋病病毒抗原等10多种疫苗。用转基因植物生产的疫苗保持了重组蛋白的理化特性和生物活性，有的提纯后用作疫苗，有的则不经提纯就能作为一种食品疫苗口服使用，这些重组蛋白基因可长期贮存于种子中，便于疫苗的运输和推广。因此转基因植物作为廉价的疫苗生产系统，有可能代替发酵系统生产疫苗等药品。
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用转基因植物生产重组蛋白具有以下优势：①在真核细胞表达系统中，与动物细胞比较，培养条件简单，便于遗传操作的进行，可降低成本，大量生产抗原；②植物培养细胞具有全能性，能够再生植株，可通过大面积栽培转基因植株来获得非常廉价的免疫试剂；③转基因植物中的外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组，进而生产一种方便、高效的多联口服疫苗；④转基因植株的种子易于贮存，有利于重组蛋白的生产和运输；⑤植物病毒不感染人类，用植物细胞生产重组蛋白更为安全[8]；⑥植物细胞有与动物细胞相似的结构和功能， 有利于重组蛋白的正确装配和表达。
1995年Mason将乙型肝炎表面抗原基因转入马铃薯细胞中表达，用薯块饲喂小鼠后，在小鼠体内检测到特异性保护抗体，包括黏膜抗体，分泌到循环系统中抵御病毒的侵染。美国Prodigene公司自称是第1个销售转基因植物生产重组蛋白的公司， 同时声称用转基因植物研制可食用疫苗的工作已步入正轨，人们进食这种疫苗后，可对食物中所含抗原产生免疫反应。如服用转基因植物表达的霍乱弧菌B亚单位作为口服疫苗，能抵抗霍乱和产肠毒素性大肠杆菌。Prodigene公司还用转基因植物为Sigma化学公司生产诊断试剂，其中56种已申请或获得专利。
, 百拇医药
利用转基因植物表达人类病毒蛋白，生产疫苗抗原并保留其天然免疫原性的蛋白质构象，这为疫苗的“生物制药”提供了可能。通过改变植物的遗传物质，生产大量而廉价的药物，从而保护发展中国家的儿童免受传统杀手如病菌性腹泻和霍乱等的危害。利用植物细胞表达系统生产治疗性和诊断性蛋白，较哺乳动物细胞或微生物制备节省了昂贵的培养和发酵系统开支，却能获得天然活性的重组蛋白，1995年Moffat等指出，利用转基因植物开发新型疫苗等药品，是一种有效的经济来源， 从长远观点看，植物将在未来的疫苗和药物市场中占主导地位[9，10]。
当然用转基因植物生产疫苗等药品也存在一些问题有待解决，首先是如何有效地提高外源蛋白的表达量，表达量最高可达可溶性蛋白的14%，但大多数蛋白的表达量不高，其理化性质和生物活性与动物和细菌来源的蛋白之间存在一些差异。其次，植物糖基化模式与动物糖基化模式的不同是否会影响其抗原的特异性，目前还未见报道，有待于进一步研究。从植物细胞中提纯特定蛋白的纯化工艺也需完善，有效去除混杂在其中的植物碱和植物毒素也是生产中不可忽视的问题之一[11]。
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参考文献
[1]赵长安，刘作义. 轮状病毒感染的研究现状. 国外医学流行病学与传染病学分册，1998，25：145-148.
[2]Bishop RF. Development of candidate rotavirusv vaccines. Vaccine, 1993, 11:247-254.
[3]Estes MK,Cohen J. Rotavirus gene structure and function. Microbiol Rev,1989,53:410-449.
[4]Kapikian AZ, Chanock RM. Rotavirus. In: Fields BN，Knipe DM，eds. Virology. 2nd ed. USA:Raven Press,1990. 1353-1404.
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[5]Bishop RF. Natural history of human rotavirus infections. In: Kapikian AZ, ed, Viral infections of the gastrointerstinal tract. New York: Marcel Dekker Inc, 1994. 131-167.
[6]Mason HS,Lam DM, Arntzen CJ. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plant. Proc Natl Acad Sci U S A,1992,89:11745-11749.
[7]Arakawa T, Chong DK, Langride WH. Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin B subunit vaccine . Nat Biotechnol,1998,16:292-297.
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[8]王新国，张国华，肖成祖. 植物生物反应器生产异源蛋白. 生物技术通讯，1999，3：217-226.
[9]Haq TA, Mason HS, Clements JD,et al. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. Science, 1995, 268: 714-716.
[10]Mason HS, Arntzen CJ. Transgenic plants as vaccine production systems. Trends Biotechnol, 1995, 13:388-392.
[11]Hunt AG. Plant cells do not properly recognize animal gene polyadenylation sequence. Plant Mol Biol, 1987,8:23-26.
收稿日期：1999-06-25, http://www.100md.com