人肺腺癌A549/DDP耐药细胞减弱顺铂诱导的细胞凋亡
作者：刘文哲 胡义德 李金瀚 许楚宏 陈娜娜
单位：胡义德(第三军医大学新桥医院全军呼吸研究所，重庆 400037)；刘文哲 许楚宏(广州赤岗一七七中心医院肿瘤科，广东 广州 510317)；李金瀚 陈娜娜(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)
关键词：肺肿瘤；多药抗药性；顺铂；细胞凋亡；bcl-2基因
癌症000411
【摘要】目的：探讨人肺腺癌A549/DDP耐药细胞的多药抗药机理。方法:应用形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、原位DNA断裂点的末端标记法观察细胞凋亡的状况，用免疫组化法检测bcl-2基因的表达。结果:癌细胞在顺铂作用下产生了典型的凋亡形态学改变。3μg/ml、5μg/ml、7μg/ml顺铂作用48小时，A549细胞DNA裂解片断呈现典型的阶梯状排列条带；而在5μg/ml、7μg/ml顺铂作用48小时，A549/DDP细胞才呈现相似的DNA条带。在3μg/ml顺铂作用12小时、18小时、24小时，A549/DDP的凋亡指数分别小于A549的凋亡指数。A549/DDPbcl-2基因的表达高于A549细胞。结论：A549/DDP可抵抗顺铂诱导的细胞凋亡，这可能与其细胞bcl-2基因过度表达有关。bcl-2基因过度表达可能是A549/DDP细胞抗凋亡及抗药机理之一。
, 百拇医药
中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0325-03
Cisplatin-induced apoptosis was reduced in cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549
LIU Wen-zhe
(Oncology Department,177 Central Hospital PLA,Guangzhou 510317,P.R.China)
HU Yi-de
(Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military MedicalUniversity, Chongqing 400037,P.R.China)
, http://www.100md.com
LI Jin-han
(Oncology Department, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515,P.R.China)
【Abstract】 Objective： To investigate multidrug resistant mechanisms in A549/DDP cell line.Methods： Cell morphology, agarose gel electrophoresis and DNA 3 -end-labeling method were used to observe the apoptosis. The bcl-2 protein was detected by immunohistochemical staining. Results： Cells treated with 3 μ g/ml cisplatin appeared typical morphological changes of apoptosis. Nuclear DNA of A549 cells treated with cisplatin of 3 μ g/ml,5 μ g/ml or 7 μ g/ml for 48 hours displayed ladder bands ,while nuclear DNA of A549/DDP cells treated with 5 μ g/ml and 7 μ g/ml cisplatin for 48 hours displayed ladder bands. The apoptosis index of A549/DDP cells was lower than that of A549 cells at 12h, 18h and 24 h time points after exposing to 3 μ g/ml cisplatin. The expression of bcl-2 gene in A549/DDP cells was higher than that in A549 cells.Conclusions:The A549/DDP cells undergo less apoptosis induced by cisplatin, which might be related to bcl-2 gene overexpression. The overexpression of bcl-2 gene may be one of the important mechanisms, for reduced apoptosis and multidrug resistance in A549/DDP cells.
, 百拇医药
Key words: Lung cancer; Multidrug resistance; Cisplatin; Apoptosis; bcl-2 gene
化疗是肺癌综合治疗的重要手段之一。但由于肺癌细胞内在的和/或获得性多药抗药性(Multidrugresistance,MDR)的形成，使抗癌药物对其化疗的疗效下降，最终导致化疗失败[1]。目前，关于肺癌多药抗药性形成的机制尚不甚清楚[2]。研究表明，细胞凋亡(Apoptosis)与恶性肿瘤的发生、发展与疗效密切相关[3]。本实验以人肺腺癌A549细胞系的多药抗药细胞系桝549/DDP[4]为研究对象，初步探讨了顺铂(Cisplatin,DDP)诱导A549细胞凋亡效应、抗凋亡现象及其机制，揭示了肺癌细胞MDR的本质之一是抵抗抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡，现报道如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1细胞系与细胞培养
人肺腺癌A549细胞系由第三军医大学新桥医院呼吸研究所惠赠。A549/DDP由1μg/mlDDP周期性作用A549细胞诱导而来，对DDP的抗药指数(resistanceindex,RI)为18.9，对卡铂和鬼臼乙叉甙呈交叉抗药[4]。细胞均培养在含10%小牛血清、青链霉素各100u/ml的RPMI-1640培养液中，在37.0℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2主要试剂与仪器
原位DNA断裂点的3′-羟基末端标记试剂盒购自北京天象人生物工程有限公司；兔抗人bcl-2多克隆抗体和免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；电泳仪为北京东方仪器厂生产，台式常温高速离心机为上海医用分析仪器厂生产，CQL图像分析仪为北京昌盛医用设备公司产品。
, 百拇医药
1.3形态学观察
细胞经顺铂作用后，定时用胰酶消化并收集，细胞离心涂片，4%多聚甲醛固定，HE染色，光镜观察。
1.4DNA凋亡片断分析
按参考文献[5]介绍的方法进行。
1.5原位DNA断裂点3′-羟基末端标记法测凋亡指数(apoptoticindex,AI)
胰酶消化并收集每组细胞涂片，4%多聚甲醛固定；0.3%H2O2室温作用30分钟，磷酸缓冲液(PBS)漂洗；0.1%TritonX-1004℃条件下孵育2分钟，PBS漂洗；配制含末端脱氧核苷酸基转移酶和荧光素标记的dUTP反应混合液，滴加后于37.0℃孵育60分钟，PBS漂洗;再滴加连接过氧化物酶的抗荧光素抗体，37.0℃温育30分钟；滴加3.3-二氨基联苯胺(DAB)和H2O2，见到棕黄色的阳性物出现后终止反应，苏木精复染，二甲苯透明，树胶封片。每相同处理组细胞共接种3瓶，每瓶涂片5张，每张涂片随机取多个高倍视野，记数100个肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比即凋亡指数AI，15张涂片AI的平均值(
±s)代表该组的细胞凋亡指数。采用两样本均数比较的t检验比较两细胞系AI的差别。
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1.6免疫组化法测bcl-2基因的表达
步骤按SP染色试剂盒中的介绍进行。用CQL图像分析仪测定阳性染色片中细胞的吸光度(A)。每细胞系选取3张片，每张片随机取多个视野，共测100个细胞，检测结果以±s表示。采用两样本均数比较的t检验进行统计分析。
2 结果
2.1形态学变化
细胞经3μg/mlDDP作用24小时至96小时，主要病理变化先后为细胞缩小，胞膜完整，有些细胞起泡，胞浆嗜碱性，核染色质致密固缩，核染色质断裂，形成凋亡小体。随着作用时间增加，发生上述相同形态改变的细胞比例增加，呈时间依赖性。发生上述相同形态改变时，DDP作用A549/DDP细胞的时间长于作用A549细胞的时间。
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2.2DNA凋亡片断形成
A549细胞在3μg/mlDDP作用48小时和72小时，均出现典型的阶梯状排列的DNA条带；而A549/DDP在相同浓度DDP作用72小时，仍未出现阶梯状DNA条带(图1)。A549细胞在3μg/ml、5μg/ml、7μg/mlDDP作用48小时均出现典型的DNA阶梯；A549/DDP在5μg/ml、7μg/mlDDP作用48小时出现阶梯状排列的DNA条带，而在3μg/ml浓度下，A549/DDP细胞无阶梯状排列的DNA条带出现(图2)。
2.3凋亡指数变化
采用原位DNA断裂点3'-羟基末端标记法标出的阳性细胞呈黄棕色，每一细胞着色深浅不一，有些细胞的黄棕色物聚集成深棕色的斑块；阳性细胞小于阴性细胞；阴性细胞被苏木精染成蓝色，染色质疏松呈网作用48小时的A549/DDP状。3μg/mlDDP作用不同时间的凋亡指数如表1。
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表1 3μg/mlDDP作用A549和A549/DDP细胞不同时间的平均凋亡指数(AI) 时间(小时)
AI※(%)(±s)
后者与前者之比(%)
P
A549
A549/DDP
0
0.267±0.594Π
0.200±0.561Π
74.9
, 百拇医药
>0.25
6
0.400±0.736Π
0.333±0.617Π
83.3
>0.25
12
2.733±3.195Π
0.400±0.632Π
14.6
<0.01
18
, http://www.100md.com
7.267±1.163Π
1.867±0.834Π
25.7
<0.001
24
14.330±1.175Π
6.200±0.775Π
43.3
<0.001
※AI=(阳性细胞数/细胞总数)×100%Π代表15次测量的结果
, 百拇医药
1.A549无DDP对照；2，3，4分别为3μg/mlDDP作用24h,48h,72h的A549；5.A549/DDP无DDP对照；6,7,8分别为3μg/mlDDP作用24h,48h,72h的A549/DDP
图1相同浓度DDP作用不同时间的A549和A549/DDP细胞总DNA电泳图
1.A549无DDP对照；2,3,4分别为3μg/ml,5μg/ml,7μg/mlDDP作用48小时的A549；5.A549/DDP无DDP对照；6,7,8分别为3μg/ml,5μg/ml,7μg/mlDDP
图2不同浓度DDP作用相同时间的A549和A549/DDP细胞总DNA电泳图
由表1可知：3μg/mlDDP作用0小时和6小时，A549和A549/DDPAI的差异不显著(P>0.25);3μg/mlDDP作用12小时、18小时和24小时，A549和A549/DDPAI的差异显著(P<0.01)，A549的AI大于相同作用时间A549/DDP的AI.
, 百拇医药
2.4bcl-2蛋白表达的变化
bcl-2抗体在1∶25稀释度时阳性结果最显著。在A549和A549/DDP细胞浆中均可见颗粒样分布的深浅不一的棕黄色物质，各细胞着色深浅不一，但A549/DDP细胞较A549细胞明显深染。而两细胞系的阴性对照片中细胞均无棕黄色颗粒样物，只见被苏木精染成蓝色的细胞核。A549和A549/DDP细胞棕黄色物质的平均吸光度见表2。经两样本均数比较的t检验进行比较，P<0.01按α＝0.05标准,说明A549/DDP bcl-2基因的表达与A549的表达与A549的表达有显著差别,A549/DDP细胞bcl-2基因的表达高于A549细胞.
表2 细胞内bcl-2蛋白的平均吸光度(
) 细胞系
A(±s)
, 百拇医药
上项与下项之比(%)
P
A549
0.0420±0.0298※
A549/DDP
0.0679±0.0225※
61.99
<0.001
※代表100次测量的结果
3 讨论
A549/DDP细胞对DDP的抗药指数为18.9,对鬼臼乙叉甙和与DDP属同类抗肿瘤药的卡铂有交叉抗药性；在脱离DDP继续培养6月，其对DDP的抗药指数仍保持60%，说明A549/DDP的抗药性能稳定，用它作为研究对象，保证了结果的可靠性。
, 百拇医药
本研究应用光镜和DNA电泳，观察到顺铂作用于A549和A549/DDP细胞后，产生了凋亡特有的形态学变化，DNA电泳图中出现了阶梯状排列的DNA条带，说明顺铂诱导了细胞凋亡，而且在3μg/mlDDP作用下产生相同的形态学改变时,A549/DDP的时间长于A549；在3μg/mlDDP作用下出现阶梯状排列DNA条带的时间，A549/DDP的要长于A549；DDP作用下出现阶梯状排列DNA条带的浓度，A549/DDP的要高于A549。以上这些均说明A549/DDP细胞可抵抗DDP诱导的细胞凋亡，这与MigashitaT等[6]的报道是一致的。
原位DNA断裂点的3′-羟基末端标记法是凋亡早期的重要检测方法之一，在细胞出现典型的凋亡形态改变之前就可以标出凋亡的细胞，并在单个细胞水平检测凋亡，以此可以测出凋亡指数。本研究的结果表明：在3μg/ml顺铂作用12小时、18小时和24小时，A549/DDP的凋亡指数分别为A549细胞凋亡指数的14.6%、25.7%和43.3%，进一步证实了A549/DDP细胞可抵抗DDP诱导的细胞凋亡这一结论。由此可以说抵抗抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡可能是肺癌细胞MDR的本质之一。
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bcl-2基因是调节细胞凋亡重要的原癌基因之一，它能抑制许多凋亡信号如：糖皮质激素、放射线、抗肿瘤药物等引起的细胞凋亡。本研究的结果表明：A549/DDP细胞bcl-2基因表达高于A549细胞，这提示A549/DDP细胞抵抗细胞凋亡可能与其bcl-2基因过度表达有关，bcl-2基因过度表达可能是A549/DDP细胞抗凋亡的机理之一。A549/DDP细胞是对顺铂、卡铂和鬼臼乙叉甙抗药的多药抗药细胞系，其bcl-2基因过度表达可能也是A549/DDP细胞MDR的重要机理之一。bcl-2基因是如何调节抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡的，有待于以后继续深入研究。
通讯作者：刘文哲 Tel:86-20-84219338-3169 Fax:86-20-84219338-6177 E-mail:hongws@163.net
[参考文献]
[1]Garney DN. The biology of lung cancer [J]. Curr Opin Oncol, 1992,4:292～ 298.
, 百拇医药
[2]Binaschi M,Supino R,Gambetta RA, et al. MRP gene overe-xpression in a human doxorubicin-resistant SCLC cell line:alterations in celluar pharmacokin-etics and in pattern of cross-resistance [J]. Int J Cancer ,1995,62,84～ 89.
[3]Kerr JF,Winterford CM,Harmon BV.Apoptosis.its significance in cancer and cancer therapy [J]. Cancer, 1994,15:2013～ 2026.
[4]刘文哲，李金瀚，胡义德，等.顺铂诱导人肺腺癌A549细胞系多重抗药性的形成[J].中国肿瘤临床与康复，1999，1：13～16.
, 百拇医药
[5]Fan W, Eeverett ET, Tan C,et al. Glucocorticoid-mediated inhibition of taxol-induced apoptosis in leiomyosarcoma cells [J]. Cell pharmacol, 1994,1:205～ 214.
[6]Migashita T,Reed JC. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy-induced apoptosis in human leukemia cell line [J]. Blood, 1993,81:151～ 157.
收稿日期：1999-09-27
修回日期：1999-11-26, http://www.100md.com
单位：胡义德(第三军医大学新桥医院全军呼吸研究所，重庆 400037)；刘文哲 许楚宏(广州赤岗一七七中心医院肿瘤科，广东 广州 510317)；李金瀚 陈娜娜(第一军医大学药物研究所，广东 广州 510515)
关键词：肺肿瘤；多药抗药性；顺铂；细胞凋亡；bcl-2基因
癌症000411
【摘要】目的：探讨人肺腺癌A549/DDP耐药细胞的多药抗药机理。方法:应用形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、原位DNA断裂点的末端标记法观察细胞凋亡的状况，用免疫组化法检测bcl-2基因的表达。结果:癌细胞在顺铂作用下产生了典型的凋亡形态学改变。3μg/ml、5μg/ml、7μg/ml顺铂作用48小时，A549细胞DNA裂解片断呈现典型的阶梯状排列条带；而在5μg/ml、7μg/ml顺铂作用48小时，A549/DDP细胞才呈现相似的DNA条带。在3μg/ml顺铂作用12小时、18小时、24小时，A549/DDP的凋亡指数分别小于A549的凋亡指数。A549/DDPbcl-2基因的表达高于A549细胞。结论：A549/DDP可抵抗顺铂诱导的细胞凋亡，这可能与其细胞bcl-2基因过度表达有关。bcl-2基因过度表达可能是A549/DDP细胞抗凋亡及抗药机理之一。
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中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(2000)04-0325-03
Cisplatin-induced apoptosis was reduced in cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549
LIU Wen-zhe
(Oncology Department,177 Central Hospital PLA,Guangzhou 510317,P.R.China)
HU Yi-de
(Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military MedicalUniversity, Chongqing 400037,P.R.China)
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LI Jin-han
(Oncology Department, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515,P.R.China)
【Abstract】 Objective： To investigate multidrug resistant mechanisms in A549/DDP cell line.Methods： Cell morphology, agarose gel electrophoresis and DNA 3 -end-labeling method were used to observe the apoptosis. The bcl-2 protein was detected by immunohistochemical staining. Results： Cells treated with 3 μ g/ml cisplatin appeared typical morphological changes of apoptosis. Nuclear DNA of A549 cells treated with cisplatin of 3 μ g/ml,5 μ g/ml or 7 μ g/ml for 48 hours displayed ladder bands ,while nuclear DNA of A549/DDP cells treated with 5 μ g/ml and 7 μ g/ml cisplatin for 48 hours displayed ladder bands. The apoptosis index of A549/DDP cells was lower than that of A549 cells at 12h, 18h and 24 h time points after exposing to 3 μ g/ml cisplatin. The expression of bcl-2 gene in A549/DDP cells was higher than that in A549 cells.Conclusions:The A549/DDP cells undergo less apoptosis induced by cisplatin, which might be related to bcl-2 gene overexpression. The overexpression of bcl-2 gene may be one of the important mechanisms, for reduced apoptosis and multidrug resistance in A549/DDP cells.
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Key words: Lung cancer; Multidrug resistance; Cisplatin; Apoptosis; bcl-2 gene
化疗是肺癌综合治疗的重要手段之一。但由于肺癌细胞内在的和/或获得性多药抗药性(Multidrugresistance,MDR)的形成，使抗癌药物对其化疗的疗效下降，最终导致化疗失败[1]。目前，关于肺癌多药抗药性形成的机制尚不甚清楚[2]。研究表明，细胞凋亡(Apoptosis)与恶性肿瘤的发生、发展与疗效密切相关[3]。本实验以人肺腺癌A549细胞系的多药抗药细胞系桝549/DDP[4]为研究对象，初步探讨了顺铂(Cisplatin,DDP)诱导A549细胞凋亡效应、抗凋亡现象及其机制，揭示了肺癌细胞MDR的本质之一是抵抗抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡，现报道如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1细胞系与细胞培养
人肺腺癌A549细胞系由第三军医大学新桥医院呼吸研究所惠赠。A549/DDP由1μg/mlDDP周期性作用A549细胞诱导而来，对DDP的抗药指数(resistanceindex,RI)为18.9，对卡铂和鬼臼乙叉甙呈交叉抗药[4]。细胞均培养在含10%小牛血清、青链霉素各100u/ml的RPMI-1640培养液中，在37.0℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2主要试剂与仪器
原位DNA断裂点的3′-羟基末端标记试剂盒购自北京天象人生物工程有限公司；兔抗人bcl-2多克隆抗体和免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；电泳仪为北京东方仪器厂生产，台式常温高速离心机为上海医用分析仪器厂生产，CQL图像分析仪为北京昌盛医用设备公司产品。
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1.3形态学观察
细胞经顺铂作用后，定时用胰酶消化并收集，细胞离心涂片，4%多聚甲醛固定，HE染色，光镜观察。
1.4DNA凋亡片断分析
按参考文献[5]介绍的方法进行。
1.5原位DNA断裂点3′-羟基末端标记法测凋亡指数(apoptoticindex,AI)
胰酶消化并收集每组细胞涂片，4%多聚甲醛固定；0.3%H2O2室温作用30分钟，磷酸缓冲液(PBS)漂洗；0.1%TritonX-1004℃条件下孵育2分钟，PBS漂洗；配制含末端脱氧核苷酸基转移酶和荧光素标记的dUTP反应混合液，滴加后于37.0℃孵育60分钟，PBS漂洗;再滴加连接过氧化物酶的抗荧光素抗体，37.0℃温育30分钟；滴加3.3-二氨基联苯胺(DAB)和H2O2，见到棕黄色的阳性物出现后终止反应，苏木精复染，二甲苯透明，树胶封片。每相同处理组细胞共接种3瓶，每瓶涂片5张，每张涂片随机取多个高倍视野，记数100个肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比即凋亡指数AI，15张涂片AI的平均值(
±s)代表该组的细胞凋亡指数。采用两样本均数比较的t检验比较两细胞系AI的差别。, 百拇医药
1.6免疫组化法测bcl-2基因的表达
步骤按SP染色试剂盒中的介绍进行。用CQL图像分析仪测定阳性染色片中细胞的吸光度(A)。每细胞系选取3张片，每张片随机取多个视野，共测100个细胞，检测结果以
±s表示。采用两样本均数比较的t检验进行统计分析。2 结果
2.1形态学变化
细胞经3μg/mlDDP作用24小时至96小时，主要病理变化先后为细胞缩小，胞膜完整，有些细胞起泡，胞浆嗜碱性，核染色质致密固缩，核染色质断裂，形成凋亡小体。随着作用时间增加，发生上述相同形态改变的细胞比例增加，呈时间依赖性。发生上述相同形态改变时，DDP作用A549/DDP细胞的时间长于作用A549细胞的时间。
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2.2DNA凋亡片断形成
A549细胞在3μg/mlDDP作用48小时和72小时，均出现典型的阶梯状排列的DNA条带；而A549/DDP在相同浓度DDP作用72小时，仍未出现阶梯状DNA条带(图1)。A549细胞在3μg/ml、5μg/ml、7μg/mlDDP作用48小时均出现典型的DNA阶梯；A549/DDP在5μg/ml、7μg/mlDDP作用48小时出现阶梯状排列的DNA条带，而在3μg/ml浓度下，A549/DDP细胞无阶梯状排列的DNA条带出现(图2)。
2.3凋亡指数变化
采用原位DNA断裂点3'-羟基末端标记法标出的阳性细胞呈黄棕色，每一细胞着色深浅不一，有些细胞的黄棕色物聚集成深棕色的斑块；阳性细胞小于阴性细胞；阴性细胞被苏木精染成蓝色，染色质疏松呈网作用48小时的A549/DDP状。3μg/mlDDP作用不同时间的凋亡指数如表1。
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表1 3μg/mlDDP作用A549和A549/DDP细胞不同时间的平均凋亡指数(AI) 时间(小时)
AI※(%)(
±s)后者与前者之比(%)
P
A549
A549/DDP
0
0.267±0.594Π
0.200±0.561Π
74.9
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>0.25
6
0.400±0.736Π
0.333±0.617Π
83.3
>0.25
12
2.733±3.195Π
0.400±0.632Π
14.6
<0.01
18
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7.267±1.163Π
1.867±0.834Π
25.7
<0.001
24
14.330±1.175Π
6.200±0.775Π
43.3
<0.001
※AI=(阳性细胞数/细胞总数)×100%Π代表15次测量的结果
, 百拇医药
1.A549无DDP对照；2，3，4分别为3μg/mlDDP作用24h,48h,72h的A549；5.A549/DDP无DDP对照；6,7,8分别为3μg/mlDDP作用24h,48h,72h的A549/DDP
图1相同浓度DDP作用不同时间的A549和A549/DDP细胞总DNA电泳图
1.A549无DDP对照；2,3,4分别为3μg/ml,5μg/ml,7μg/mlDDP作用48小时的A549；5.A549/DDP无DDP对照；6,7,8分别为3μg/ml,5μg/ml,7μg/mlDDP
图2不同浓度DDP作用相同时间的A549和A549/DDP细胞总DNA电泳图
由表1可知：3μg/mlDDP作用0小时和6小时，A549和A549/DDPAI的差异不显著(P>0.25);3μg/mlDDP作用12小时、18小时和24小时，A549和A549/DDPAI的差异显著(P<0.01)，A549的AI大于相同作用时间A549/DDP的AI.
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2.4bcl-2蛋白表达的变化
bcl-2抗体在1∶25稀释度时阳性结果最显著。在A549和A549/DDP细胞浆中均可见颗粒样分布的深浅不一的棕黄色物质，各细胞着色深浅不一，但A549/DDP细胞较A549细胞明显深染。而两细胞系的阴性对照片中细胞均无棕黄色颗粒样物，只见被苏木精染成蓝色的细胞核。A549和A549/DDP细胞棕黄色物质的平均吸光度见表2。经两样本均数比较的t检验进行比较，P<0.01按α＝0.05标准,说明A549/DDP bcl-2基因的表达与A549的表达与A549的表达有显著差别,A549/DDP细胞bcl-2基因的表达高于A549细胞.
表2 细胞内bcl-2蛋白的平均吸光度(
) 细胞系A(
±s), 百拇医药
上项与下项之比(%)
P
A549
0.0420±0.0298※
A549/DDP
0.0679±0.0225※
61.99
<0.001
※代表100次测量的结果
3 讨论
A549/DDP细胞对DDP的抗药指数为18.9,对鬼臼乙叉甙和与DDP属同类抗肿瘤药的卡铂有交叉抗药性；在脱离DDP继续培养6月，其对DDP的抗药指数仍保持60%，说明A549/DDP的抗药性能稳定，用它作为研究对象，保证了结果的可靠性。
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本研究应用光镜和DNA电泳，观察到顺铂作用于A549和A549/DDP细胞后，产生了凋亡特有的形态学变化，DNA电泳图中出现了阶梯状排列的DNA条带，说明顺铂诱导了细胞凋亡，而且在3μg/mlDDP作用下产生相同的形态学改变时,A549/DDP的时间长于A549；在3μg/mlDDP作用下出现阶梯状排列DNA条带的时间，A549/DDP的要长于A549；DDP作用下出现阶梯状排列DNA条带的浓度，A549/DDP的要高于A549。以上这些均说明A549/DDP细胞可抵抗DDP诱导的细胞凋亡，这与MigashitaT等[6]的报道是一致的。
原位DNA断裂点的3′-羟基末端标记法是凋亡早期的重要检测方法之一，在细胞出现典型的凋亡形态改变之前就可以标出凋亡的细胞，并在单个细胞水平检测凋亡，以此可以测出凋亡指数。本研究的结果表明：在3μg/ml顺铂作用12小时、18小时和24小时，A549/DDP的凋亡指数分别为A549细胞凋亡指数的14.6%、25.7%和43.3%，进一步证实了A549/DDP细胞可抵抗DDP诱导的细胞凋亡这一结论。由此可以说抵抗抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡可能是肺癌细胞MDR的本质之一。
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bcl-2基因是调节细胞凋亡重要的原癌基因之一，它能抑制许多凋亡信号如：糖皮质激素、放射线、抗肿瘤药物等引起的细胞凋亡。本研究的结果表明：A549/DDP细胞bcl-2基因表达高于A549细胞，这提示A549/DDP细胞抵抗细胞凋亡可能与其bcl-2基因过度表达有关，bcl-2基因过度表达可能是A549/DDP细胞抗凋亡的机理之一。A549/DDP细胞是对顺铂、卡铂和鬼臼乙叉甙抗药的多药抗药细胞系，其bcl-2基因过度表达可能也是A549/DDP细胞MDR的重要机理之一。bcl-2基因是如何调节抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡的，有待于以后继续深入研究。
通讯作者：刘文哲 Tel:86-20-84219338-3169 Fax:86-20-84219338-6177 E-mail:hongws@163.net
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收稿日期：1999-09-27
修回日期：1999-11-26, http://www.100md.com