顺铂诱导人肝癌细胞凋亡机理研究
作者：王昌俊 钱伯文 陈伟
单位：王昌俊 广州市中医医院(广州市 510310)；钱伯文 上海中医药大学；陈伟 上海中医药大学
关键词：
顺铂诱导人肝癌细胞凋亡机理研究
顺铂是多种化疗方案的核心药物，在对人卵巢癌细胞和大鼠肝癌细胞的研究中，发现其具有诱导凋亡的作用。本实验从细胞形态、DNA裂解片段、细胞周期、DNA断裂点末端标记，凋亡相关基因观察顺铂诱导人肝癌细胞凋亡的作用机理。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及药物
人肝癌细胞SMMC-7721，引自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco产品)，37℃，5%CO2条件下培养。顺氯氨铂(cisplatin，DDP齐鲁制药厂出品，批号：960601)，用含10%正常大鼠血清的RPMI-1640培养液配制，DDP终浓度为10μl/ml。
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1.2 形态学观察
丫啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察。
1.3 DNA裂解片段分析
2×106细胞，70%乙醇固定，置-20℃24小时以上。1000rpm/分钟离心5分钟，去除固定液，用约0.5ml的PBS重悬细胞。转入Eppendorf管中，同法离心，去上清，细胞用40μ1PC缓冲液重悬，37℃l小时。1000rpm/分钟离心5分钟，吸上清于新的Eppendorf管中加入1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液混匀，加2倍体积的无水乙醇，-20℃30分钟。15000rpm/分钟离心，去上清，真空抽干。加入0.25%NP40溶液3μl，1mg/mlRNaseA溶液3μl，37℃30分钟。加入3μl蛋白酶K溶液，37℃30分钟。加入12μl样品稀释液，含溴化乙锭1.5%琼脂糖电泳。
1.4 细胞周期DNA含量分析
, 百拇医药
PI-FCM。
1.5 原位DNA断裂点末端标记(TUNEL-FCM)
收集细胞，用含1%甲醛PBS冰上固定15分钟，离心除去甲醛固定液，PBS洗，加0.5ml/管PBS混匀，缓缓加入-20℃70%乙醇，置-20℃保存。检测前离心除去固定液，PBS洗，加入穿透液(1%Triton-X100，1%柠檬酸)100μl/管，4℃2分钟，PBS洗去固定液，加入TUNEL标记混合液25μl/管，另设阴性对照管，只加25μl缓冲液，37℃，湿盒，避光60分钟，上机检测，记录绿色荧光。
1.6 基因蛋白检测
收集细胞70%乙醇固定，置-20℃保存，检测前2000rpm/分钟离心除去固定液，PBS洗2次，加入一抗：1:100稀释的鼠抗人p53或1:50稀释的bcl-2、p21ras，37℃20分钟，另设阴性对照管不加一抗，PBS洗1次，加1:10稀释的羊抗鼠IgG-FITC25μl/管，4℃，45分钟，PBS洗1次，用PBS调成1×106/ml单细胞悬液，流式细胞仪上机测试，记录绿荧光。
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2 结果
DDP处理细胞后，相邻细胞失去彼此连结，收缩变圆，轮廓更加清晰，细胞贴壁能力减弱，易从培养瓶壁上脱落下来，体积缩小，细胞核染色质浓缩。AO染色，对照组呈黄绿色均匀荧光，DDP组细胞内可见致密浓染的黄绿色荧光甚或见黄绿色粹片。DNA凝胶电泳DDP组和对照组在入胶处都有一亮带，其后，DDP组可见明显“梯形”条带，而对照组未见“梯形”带。TUNEL-FCM分析，DDP组有较高的阳性标记率，24小时时比例最高(84.07%)，对照组亦有部分细胞被标记，但比例较小(3.68%)(表1)。
表1 TUNEL-FCM分析阳性标记率(%)
组别
24小时
36小时
48小时
, 百拇医药
对照组
3.68
6.60
16.37
DDP组
84.07
50.92
50.91
DNA直方图上，DDP组G1峰前出现的亚二倍体峰(Sub-G1峰)较小(0.39%)，G0/G1期(25.29%)，尤其是G2/M细胞(0)明显减少，而S期细胞比例显著增加(表2)。
p53、bcl-2、p21ras在SMMC-7721细胞加都有不同程度表达，DDP作用24小时后，p53表达增强，bcl-2、p21ras表达降低(表3)。 表2 DDP作用24小时细胞周期(PI-FCM)分析(%)
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组别
AP
G-/G1
S
G2/M
对照组
0
63.07
26.31
10.61
DDP组
0.39
25.29
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74.71
0
表3 DDP对人肝癌细胞基因表达的影响
组别
阳性蛋白标记率(%)
p53
bcl-2
p21ras
12小时
24小时
12小时
24小时
, 百拇医药
12小时
24小时
对照组
3.48
15.40
4.98
81.86
1.06
25.86
DDP组
2.72
31.82
7.18
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61.50
1.14
7.39
3 小结
细胞周期与细胞凋亡的关系方面，有认为只有G0/G1期细胞发生凋亡，但更多学者认为细胞周期各时相皆可发生凋亡，不同细胞株具有不同的周期特异性。DDP处理人肝癌SMMC-7721细胞后，S期细胞增加，G2/M期细胞减少(0)，细胞被阻滞于S期，与阿霉素诱导人肝HCC-9402细胞凋亡结果一致。TUNEL法通过末端转移酶将生物素或荧光素连接的dUTP标记到DNA断裂端的3′-OH上，可在显微镜下观察或用流式细胞仪检测到早期，还未发生明显形态学改变的凋亡细胞，全面反映细胞凋亡发生情况。SMMC-7721细胞存在自然凋亡现象，但比例很小，DDP组凋亡比例较高，TUNEL-FCM结果(阳性标记)显著高于细胞周期分析凋亡细胞比例(AP峰)，可能由于细胞周期分析AP峰显示的是G1期凋亡细胞，若调亡细胞处于S期或G2/M期，其基础DNA含量高于G0/G1期细胞，即使有DNA的溢出，也不一定进入亚G1期，而TUNEL法揭示了整个细胞群的凋亡状况，说明除G0/G1外，处于其他期的细胞亦有凋亡发生。
, 百拇医药
细胞凋亡作为一种特殊的生命现象，其功能活动受促凋亡基因与抗凋亡基因的协同调控。bcl-2增加细胞对各种凋亡刺激因子的抗性，通过抑制氧化过程及其它基因蛋白产物的作用阻滞多种原因所致的凋亡发生。许多通过引起DNA损伤而诱导肿瘤细胞凋亡产生的化疗药物，其作用在p53的调控下才能顺利完成。野生型p53可诱导DNA受损细胞进入G1静止期，抑制细胞增殖，直到DNA损伤修复，如果修复失败，p53就诱导凋亡。p53具有抑制肝癌促进子和诱导细胞凋亡双重作用，表鬼臼毒素及丝裂霉素C可使人肝癌PLC/PRF/5细胞核p53蛋白增加，细胞呈凋亡特征性改变。wtp53导入AFP阳性肝癌细胞，可明显抑制肝癌细胞增殖，增加化疗药物敏感性。ras降低凋亡发生的机制可能与使核酸内切酶失活有关。人肝癌SMMC-7721细胞中有p53、bcl-2和ras表达，DDP处理后，p53蛋白表达增强，而bcl-2和ras蛋白表达减弱，说明DDP诱导人肝癌细胞分化和凋亡的机制可能是通过影响癌基因和抑癌基因表达而实现的。
(中科院上海细胞生物研究所流式细胞室高奇蓉、吴直江研究员在FCM方面给予了帮助和指导，谨此致谢)
本文课题受上海市教委科技发展基金和上海市博士点建设基金资助
(1999-04-06收稿), http://www.100md.com
单位：王昌俊 广州市中医医院(广州市 510310)；钱伯文 上海中医药大学；陈伟 上海中医药大学
关键词：
顺铂诱导人肝癌细胞凋亡机理研究
顺铂是多种化疗方案的核心药物，在对人卵巢癌细胞和大鼠肝癌细胞的研究中，发现其具有诱导凋亡的作用。本实验从细胞形态、DNA裂解片段、细胞周期、DNA断裂点末端标记，凋亡相关基因观察顺铂诱导人肝癌细胞凋亡的作用机理。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及药物
人肝癌细胞SMMC-7721，引自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco产品)，37℃，5%CO2条件下培养。顺氯氨铂(cisplatin，DDP齐鲁制药厂出品，批号：960601)，用含10%正常大鼠血清的RPMI-1640培养液配制，DDP终浓度为10μl/ml。
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1.2 形态学观察
丫啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察。
1.3 DNA裂解片段分析
2×106细胞，70%乙醇固定，置-20℃24小时以上。1000rpm/分钟离心5分钟，去除固定液，用约0.5ml的PBS重悬细胞。转入Eppendorf管中，同法离心，去上清，细胞用40μ1PC缓冲液重悬，37℃l小时。1000rpm/分钟离心5分钟，吸上清于新的Eppendorf管中加入1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液混匀，加2倍体积的无水乙醇，-20℃30分钟。15000rpm/分钟离心，去上清，真空抽干。加入0.25%NP40溶液3μl，1mg/mlRNaseA溶液3μl，37℃30分钟。加入3μl蛋白酶K溶液，37℃30分钟。加入12μl样品稀释液，含溴化乙锭1.5%琼脂糖电泳。
1.4 细胞周期DNA含量分析
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PI-FCM。
1.5 原位DNA断裂点末端标记(TUNEL-FCM)
收集细胞，用含1%甲醛PBS冰上固定15分钟，离心除去甲醛固定液，PBS洗，加0.5ml/管PBS混匀，缓缓加入-20℃70%乙醇，置-20℃保存。检测前离心除去固定液，PBS洗，加入穿透液(1%Triton-X100，1%柠檬酸)100μl/管，4℃2分钟，PBS洗去固定液，加入TUNEL标记混合液25μl/管，另设阴性对照管，只加25μl缓冲液，37℃，湿盒，避光60分钟，上机检测，记录绿色荧光。
1.6 基因蛋白检测
收集细胞70%乙醇固定，置-20℃保存，检测前2000rpm/分钟离心除去固定液，PBS洗2次，加入一抗：1:100稀释的鼠抗人p53或1:50稀释的bcl-2、p21ras，37℃20分钟，另设阴性对照管不加一抗，PBS洗1次，加1:10稀释的羊抗鼠IgG-FITC25μl/管，4℃，45分钟，PBS洗1次，用PBS调成1×106/ml单细胞悬液，流式细胞仪上机测试，记录绿荧光。
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2 结果
DDP处理细胞后，相邻细胞失去彼此连结，收缩变圆，轮廓更加清晰，细胞贴壁能力减弱，易从培养瓶壁上脱落下来，体积缩小，细胞核染色质浓缩。AO染色，对照组呈黄绿色均匀荧光，DDP组细胞内可见致密浓染的黄绿色荧光甚或见黄绿色粹片。DNA凝胶电泳DDP组和对照组在入胶处都有一亮带，其后，DDP组可见明显“梯形”条带，而对照组未见“梯形”带。TUNEL-FCM分析，DDP组有较高的阳性标记率，24小时时比例最高(84.07%)，对照组亦有部分细胞被标记，但比例较小(3.68%)(表1)。
表1 TUNEL-FCM分析阳性标记率(%)
组别
24小时
36小时
48小时
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对照组
3.68
6.60
16.37
DDP组
84.07
50.92
50.91
DNA直方图上，DDP组G1峰前出现的亚二倍体峰(Sub-G1峰)较小(0.39%)，G0/G1期(25.29%)，尤其是G2/M细胞(0)明显减少，而S期细胞比例显著增加(表2)。
p53、bcl-2、p21ras在SMMC-7721细胞加都有不同程度表达，DDP作用24小时后，p53表达增强，bcl-2、p21ras表达降低(表3)。 表2 DDP作用24小时细胞周期(PI-FCM)分析(%)
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组别
AP
G-/G1
S
G2/M
对照组
0
63.07
26.31
10.61
DDP组
0.39
25.29
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74.71
0
表3 DDP对人肝癌细胞基因表达的影响
组别
阳性蛋白标记率(%)
p53
bcl-2
p21ras
12小时
24小时
12小时
24小时
, 百拇医药
12小时
24小时
对照组
3.48
15.40
4.98
81.86
1.06
25.86
DDP组
2.72
31.82
7.18
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61.50
1.14
7.39
3 小结
细胞周期与细胞凋亡的关系方面，有认为只有G0/G1期细胞发生凋亡，但更多学者认为细胞周期各时相皆可发生凋亡，不同细胞株具有不同的周期特异性。DDP处理人肝癌SMMC-7721细胞后，S期细胞增加，G2/M期细胞减少(0)，细胞被阻滞于S期，与阿霉素诱导人肝HCC-9402细胞凋亡结果一致。TUNEL法通过末端转移酶将生物素或荧光素连接的dUTP标记到DNA断裂端的3′-OH上，可在显微镜下观察或用流式细胞仪检测到早期，还未发生明显形态学改变的凋亡细胞，全面反映细胞凋亡发生情况。SMMC-7721细胞存在自然凋亡现象，但比例很小，DDP组凋亡比例较高，TUNEL-FCM结果(阳性标记)显著高于细胞周期分析凋亡细胞比例(AP峰)，可能由于细胞周期分析AP峰显示的是G1期凋亡细胞，若调亡细胞处于S期或G2/M期，其基础DNA含量高于G0/G1期细胞，即使有DNA的溢出，也不一定进入亚G1期，而TUNEL法揭示了整个细胞群的凋亡状况，说明除G0/G1外，处于其他期的细胞亦有凋亡发生。
, 百拇医药
细胞凋亡作为一种特殊的生命现象，其功能活动受促凋亡基因与抗凋亡基因的协同调控。bcl-2增加细胞对各种凋亡刺激因子的抗性，通过抑制氧化过程及其它基因蛋白产物的作用阻滞多种原因所致的凋亡发生。许多通过引起DNA损伤而诱导肿瘤细胞凋亡产生的化疗药物，其作用在p53的调控下才能顺利完成。野生型p53可诱导DNA受损细胞进入G1静止期，抑制细胞增殖，直到DNA损伤修复，如果修复失败，p53就诱导凋亡。p53具有抑制肝癌促进子和诱导细胞凋亡双重作用，表鬼臼毒素及丝裂霉素C可使人肝癌PLC/PRF/5细胞核p53蛋白增加，细胞呈凋亡特征性改变。wtp53导入AFP阳性肝癌细胞，可明显抑制肝癌细胞增殖，增加化疗药物敏感性。ras降低凋亡发生的机制可能与使核酸内切酶失活有关。人肝癌SMMC-7721细胞中有p53、bcl-2和ras表达，DDP处理后，p53蛋白表达增强，而bcl-2和ras蛋白表达减弱，说明DDP诱导人肝癌细胞分化和凋亡的机制可能是通过影响癌基因和抑癌基因表达而实现的。
(中科院上海细胞生物研究所流式细胞室高奇蓉、吴直江研究员在FCM方面给予了帮助和指导，谨此致谢)
本文课题受上海市教委科技发展基金和上海市博士点建设基金资助
(1999-04-06收稿), http://www.100md.com