凋亡相关基因与食管鳞状细胞癌放射敏感性相关关系的研究
作者：李惠翔 王尧河 石永刚 高冬玲 张云汉
单位：(450052 郑州，河南医科大学附属一院放疗科)
关键词：食管鳞状细胞癌； 凋亡相关基因； 放射敏感性
中华放射医学与防护杂志000611 【摘要】 目的 探讨凋亡相关基因bcl-2，c-myc，p53与食管鳞癌放疗敏感性的关系。方法 采用免疫组化LSAB方法检测食管癌活检组织中bcl-2，c-myc，p53基因表达水平。病人接受放射治疗，观察疗效，分析基因表达与放射敏感性的关系。结果 bcl-2蛋白表达阳性者放射敏感性明显低于表达阴性者，p53蛋白表达阳性者略差于阴性者；c-myc基因表达与放射敏感性无关。结论 bcl-2，c-myc，p53等凋亡相关基因表达产物的检测及综合分析有助于食管鳞癌放疗疗效的预测。
Study on relationship between apoptosis-related genes and radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
LI Huixiang,WANG Yaohe,SHI Yonggang,et al.
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450000,China)
【Abstract】 Objective To observing the relationship between apoptosis-ralated genes bcl-2,c-myc,p53 and the radiosensitivity of esophageel squamous cell carcinoma. Methods The expression levels of bcl-2,c-myc and p53 genes in 57 biopsy samples from patients of esophageal squamous cell carcinoma were detected with the LSAB immunohistochemistry method.All the patients were treated with radiotherapy.The radiotherapeutic effect in these patients was observed and the relation between gene expression and radiosensitivity was analyzed. Results Compared with the bcl-2-negative group,the radiosensitivity of bcl-2-positive one was lower(P<0.01).The radiosensitivity of p53-positive group was slightly lower than that of the p53-negative one (P<0.05).The c-myc protein expression was not related to radiosensitivity. Conclusion Detection and comprehensive analysis of bcl-2,c-myc and p53 protein expressions are useful in forecasting the radiotherapeutic effect on squamous cell carcinoma of esophagus.
, 百拇医药
【Key words】 Squamous cell carcinoma of esophagus; Apoptosis-related gene; Radiosensitivity
放射治疗目前仍为食管癌的主要治疗方法之一。但临床上仍存在肿瘤放射抗拒性问题。所以了解肿瘤间固有放射敏感性的差异，针对不同肿瘤患者制定合理的个体放疗方案，提高生存率是十分必要的。研究表明，诱导肿瘤细胞发生凋亡是放射治疗肿瘤的主要机理之一，凋亡是一个涉及多种基因调控的主动过程。凋亡相关基因能否作为肿瘤固有放射敏感性的标志已成为放射生物学研究的热点。因此，本文作者选择参与调节细胞凋亡的癌基因和抑癌基因bcl-2，c-myc，p53，通过检测其表达产物，研究凋亡相关基因与食管癌固有放射敏感性之间的关系并探讨其在临床中的应用价值。
材料和方法
1.病例 57例食管癌活检标本取自河南医科大学一附院病理科。常规制片，HE染色，组织学诊断均为鳞状细胞癌，病人年龄39～74岁，男性35例，女性22例。
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2.放射治疗 57例食管鳞癌患者经病理诊断证实后的一周内进行放射治疗，均为首次接受放疗。放疗方法：在模拟机下定位，以病变中心设1个胸野6 cm×15 cm，背野2个5 cm×15 cm，用日产SGPT-21型旋转式钴治疗机照射，SSD=80 cm，DT=70 Gy/40次/8周。全部患者均顺利完成治疗，放疗效果为CR39例，PR12例，PD6例。
3.基因表达产物测定 采用LSAB免疫组化方法，I抗分别为鼠抗人单克隆bcl-2、c-myc、p53抗体。抗体及LSAB试剂盒均为DAKO公司产品，操作过程基本按试剂盒说明，DAB显色。每次免疫组化操作均设立阳性对照、阴性对照、空白对照。
4.统计分析 根据放疗疗效结果和免疫组化染色结果，采用χ2检验。
结 果
1.bcl-2、c-myc、p53蛋白表达 bcl-2、c-myc、p53蛋白表达阳性率分别为38.59%、63.16%、38.59%。bcl-2阳性反应呈现于胞浆及核膜，c-myc胞浆胞核均有表达，p53为胞核着色。(见图1，2，3)。
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图1 bcl-2在食管鳞状细胞癌上的表达
图2 c-myc在食管鳞状细胞癌上的表达
图3 p53在食管鳞状细胞癌上的表达
2.bcl-2、c-myc、p53蛋白表达与放疗疗效的关系，见表1。c-myc蛋白表达的阳性组与阴性组之间，放疗疗效无明显差异(P>0.05)。p53蛋白阳性组疗效差于阴性组(P<0.05)。而bcl-2蛋白表达阳性组患者疗效明显差于阴性组(P<0.01)。
3.57例食管癌患者中，bcl-2、c-myc、p53蛋白表达仅其中一项阳性者25例(43.75%)。任其二项以上阳性者22例(38.59%)，二者疗效相比较，后者的疗效明显较差，见表2。
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表1 bcl-2、c-myc、p53蛋白表达与食管鳞癌放疗疗效的关系 组别
n(%)
CR(%)
PR(%)
PD(%)
bcl-2(+)
22(38.59)
10(45.45)
7(31.82)
5(22.73)
(-)
35(61.40)
, 百拇医药
29(82.86)
5(14.29)
1(2.86)
c-myc(+)
36(63.16)
22(61.11)
9(25)
5(13.89)
(-)
21(36.84)
17(80.95)
3(14.29)
, 百拇医药
1(4.76)
p53(+)
22(38.59)
12(54.55)
5(22.73)
5(22.73)
(-)
35(61.40)
27(77.14)
7(20)
1(2.86)
表2 bcl-2、c-myc、p53与食管癌放疗疗效的综合评价 组别
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CR
PR
PD
一项阳性
22
2
1
二项以上阳性
9
8
5
讨 论
影响肿瘤细胞固有放射敏感性的因素很多[1]，凋亡是其中之一。凋亡是一个需要基因表达、蛋白质合成的主动过程，基因水平的研究可用于筛选判断肿瘤细胞放疗敏感性的指标，尤其是与肿瘤细胞凋亡相关的癌基因和抑癌基因，其中关系比较密切的有bcl-2、c-myc、p53。
, 百拇医药
bcl-2是凋亡的抑制基因，可抑制或阻断一些生理性或非生理性因素诱导的凋亡[2，3]，机理尚不清楚。有报道[4]以逆转录病毒为载体，将bcl-2基因转到NIH3T3细胞内，可提高细胞对辐射的抗损伤效应，辐射敏感性低于对照组，并可促进细胞增殖，表明bcl-2表达产物阻断了细胞凋亡途径上的某一环节，从而显示出长寿基因的作用。本研究也发现，bcl-2表达阳性组放疗效果较阴性组差，提示bcl-2可作为预测食管鳞状细胞癌放疗敏感性的指标之一。c-myc癌基因与人类多种肿瘤的发生密切相关，c-myc基因产物具有促进增殖和引发凋亡的双向作用，其结果取决于细胞接受的其他信号。c-myc癌基因转染细胞，可呈现不同的结果。有学者认为可使放射抗性增高。有人认为单纯c-myc基因转染并不增加细胞的放射抗性，但有可能与其他癌基因所致的细胞放射抗性的增加有协同作用[5]。本实验结果显示，虽然c-myc在食管癌组织中有较高表达，但与放疗疗效不呈现相关性。反映出单一c-myc指标难以作为判断肿瘤细胞放射敏感性的指标。p53基因在放疗中的作用目前研究的较为深入，甚至称其为辐射敏感相关基因。因为DNA损伤导致的细胞凋亡必须要有p53的参加，p53基因突变是目前所知人体肿瘤中(包括食管癌)最常见的基因改变，p53基因突变后不仅丧失抑癌功能，而且具有癌基因的特征。并可能通过干扰程序性死亡增加放射抗拒性。而免疫组化检测到的是以突变型为主的p53蛋白。本实验结果也反映出p53突变提高放射抗拒性的倾向，与其他学者研究结果相符[6，7]。p53基因状态的差异可使同一病理类型的肿瘤出现放疗反应的差异，p53基因表达产物的检测有助于放疗敏感性的预测。
, 百拇医药
研究表明，单一癌基因对不同细胞转染可得到不同的结论，通过体外培养细胞所观察到的某个基因的改变对放射敏感性的影响来判定该基因在放射反应中的作用尚有局限性。辐射后细胞凋亡反应存在着异质性，其原因可能为基因调控的差异。一般说来，肿瘤细胞内存在多个癌基因的改变，细胞内各基因之间相互影响，其中任何一个基因产物的相对浓度和活性的改变都会影响细胞放射敏感性。如野生型p53基因引发凋亡有时需要c-myc基因存在，当p53基因突变时，野生型p53-myc基因对凋亡的作用将遭到破坏，使肿瘤细胞对射线的抗拒增加。Ryan[5]等在转染实验中发现bcl-2基因转染可阻止p53基因依赖的凋亡，但不是抑制生长，而当bcl-2与c-myc两种基因同时转染时，凋亡和生长抑制同时被阻断。所以，肿瘤放疗敏感性的预测及评价需观察多个相关癌基因或抑癌基因，Vincenzo[8]等在复习大量文献的基础上，提出p53基因、bcl-2基因、c-myc基因3者之间的对抗和协作是决定放射敏感性的关系点。本文结果也提示，这3项指标的检测和综合评价将比单一指标更可靠。另外，尚需结合临床、病理、个体差异等其他方面进行多因素综合分析。
, 百拇医药
参考文献
[1]陈仁武，沈瑜，殷蔚伯.癌基因的表达对细胞放射敏感性的影响.中华放射肿瘤学杂志，1992，1：248-249.
[2]Hideasu I,Eiich T,Tsuyoshi M,et al.Apoptosis of human glioma cell in response to calphosttin C,a specific protein kinase C inhibitor.J Neurosury,1995,83:1008-1010.
[3]Oreste G,Vieri B,Anna Galzolari,et al.Bcl-2 protein expression collelates with recurrence and surviral in early stage head and neck cancer treated by radiotheapy.Clinical cancer research.1996,2:216-218.
, http://www.100md.com
[4]魏汉东，瞿成奎，贺福初，等.细胞凋亡抑制基因bcl-2对NIH3T3细胞增殖及辐射敏感性的影响。中华放射医学与防护杂志，1996，16：290-292.
[5]Iliakis G,Induction and repair of DNA double strand breaks in radiation-resistant cells obtained by transformation of primary rat embryo cell with the oncogenes H-ras and V-myc.Cancer Res,1990,50:6575-6576.
[6]Lee JM,Bernstein A.p53 mutations increase resistance to ionizing radiation.PNAS USA,1993,90:5742.
[7]梁克，沈瑜.辐射敏感相关基因p53.中华放射肿瘤学杂志，1995，4：130-131.
[8]Vincenzo C,Lucia M,Mavina C,et al.Dominant oncogenes,tumor suppressors,and radiosensitivity.Cell Mol Biol Res,1995,41:161-163.
(收稿日期:1999-09-21), 百拇医药
单位：(450052 郑州，河南医科大学附属一院放疗科)
关键词：食管鳞状细胞癌； 凋亡相关基因； 放射敏感性
中华放射医学与防护杂志000611 【摘要】 目的 探讨凋亡相关基因bcl-2，c-myc，p53与食管鳞癌放疗敏感性的关系。方法 采用免疫组化LSAB方法检测食管癌活检组织中bcl-2，c-myc，p53基因表达水平。病人接受放射治疗，观察疗效，分析基因表达与放射敏感性的关系。结果 bcl-2蛋白表达阳性者放射敏感性明显低于表达阴性者，p53蛋白表达阳性者略差于阴性者；c-myc基因表达与放射敏感性无关。结论 bcl-2，c-myc，p53等凋亡相关基因表达产物的检测及综合分析有助于食管鳞癌放疗疗效的预测。
Study on relationship between apoptosis-related genes and radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
LI Huixiang,WANG Yaohe,SHI Yonggang,et al.
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450000,China)
【Abstract】 Objective To observing the relationship between apoptosis-ralated genes bcl-2,c-myc,p53 and the radiosensitivity of esophageel squamous cell carcinoma. Methods The expression levels of bcl-2,c-myc and p53 genes in 57 biopsy samples from patients of esophageal squamous cell carcinoma were detected with the LSAB immunohistochemistry method.All the patients were treated with radiotherapy.The radiotherapeutic effect in these patients was observed and the relation between gene expression and radiosensitivity was analyzed. Results Compared with the bcl-2-negative group,the radiosensitivity of bcl-2-positive one was lower(P<0.01).The radiosensitivity of p53-positive group was slightly lower than that of the p53-negative one (P<0.05).The c-myc protein expression was not related to radiosensitivity. Conclusion Detection and comprehensive analysis of bcl-2,c-myc and p53 protein expressions are useful in forecasting the radiotherapeutic effect on squamous cell carcinoma of esophagus.
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【Key words】 Squamous cell carcinoma of esophagus; Apoptosis-related gene; Radiosensitivity
放射治疗目前仍为食管癌的主要治疗方法之一。但临床上仍存在肿瘤放射抗拒性问题。所以了解肿瘤间固有放射敏感性的差异，针对不同肿瘤患者制定合理的个体放疗方案，提高生存率是十分必要的。研究表明，诱导肿瘤细胞发生凋亡是放射治疗肿瘤的主要机理之一，凋亡是一个涉及多种基因调控的主动过程。凋亡相关基因能否作为肿瘤固有放射敏感性的标志已成为放射生物学研究的热点。因此，本文作者选择参与调节细胞凋亡的癌基因和抑癌基因bcl-2，c-myc，p53，通过检测其表达产物，研究凋亡相关基因与食管癌固有放射敏感性之间的关系并探讨其在临床中的应用价值。
材料和方法
1.病例 57例食管癌活检标本取自河南医科大学一附院病理科。常规制片，HE染色，组织学诊断均为鳞状细胞癌，病人年龄39～74岁，男性35例，女性22例。
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2.放射治疗 57例食管鳞癌患者经病理诊断证实后的一周内进行放射治疗，均为首次接受放疗。放疗方法：在模拟机下定位，以病变中心设1个胸野6 cm×15 cm，背野2个5 cm×15 cm，用日产SGPT-21型旋转式钴治疗机照射，SSD=80 cm，DT=70 Gy/40次/8周。全部患者均顺利完成治疗，放疗效果为CR39例，PR12例，PD6例。
3.基因表达产物测定 采用LSAB免疫组化方法，I抗分别为鼠抗人单克隆bcl-2、c-myc、p53抗体。抗体及LSAB试剂盒均为DAKO公司产品，操作过程基本按试剂盒说明，DAB显色。每次免疫组化操作均设立阳性对照、阴性对照、空白对照。
4.统计分析 根据放疗疗效结果和免疫组化染色结果，采用χ2检验。
结 果
1.bcl-2、c-myc、p53蛋白表达 bcl-2、c-myc、p53蛋白表达阳性率分别为38.59%、63.16%、38.59%。bcl-2阳性反应呈现于胞浆及核膜，c-myc胞浆胞核均有表达，p53为胞核着色。(见图1，2，3)。
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图1 bcl-2在食管鳞状细胞癌上的表达
图2 c-myc在食管鳞状细胞癌上的表达
图3 p53在食管鳞状细胞癌上的表达
2.bcl-2、c-myc、p53蛋白表达与放疗疗效的关系，见表1。c-myc蛋白表达的阳性组与阴性组之间，放疗疗效无明显差异(P>0.05)。p53蛋白阳性组疗效差于阴性组(P<0.05)。而bcl-2蛋白表达阳性组患者疗效明显差于阴性组(P<0.01)。
3.57例食管癌患者中，bcl-2、c-myc、p53蛋白表达仅其中一项阳性者25例(43.75%)。任其二项以上阳性者22例(38.59%)，二者疗效相比较，后者的疗效明显较差，见表2。
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表1 bcl-2、c-myc、p53蛋白表达与食管鳞癌放疗疗效的关系 组别
n(%)
CR(%)
PR(%)
PD(%)
bcl-2(+)
22(38.59)
10(45.45)
7(31.82)
5(22.73)
(-)
35(61.40)
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29(82.86)
5(14.29)
1(2.86)
c-myc(+)
36(63.16)
22(61.11)
9(25)
5(13.89)
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21(36.84)
17(80.95)
3(14.29)
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1(4.76)
p53(+)
22(38.59)
12(54.55)
5(22.73)
5(22.73)
(-)
35(61.40)
27(77.14)
7(20)
1(2.86)
表2 bcl-2、c-myc、p53与食管癌放疗疗效的综合评价 组别
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CR
PR
PD
一项阳性
22
2
1
二项以上阳性
9
8
5
讨 论
影响肿瘤细胞固有放射敏感性的因素很多[1]，凋亡是其中之一。凋亡是一个需要基因表达、蛋白质合成的主动过程，基因水平的研究可用于筛选判断肿瘤细胞放疗敏感性的指标，尤其是与肿瘤细胞凋亡相关的癌基因和抑癌基因，其中关系比较密切的有bcl-2、c-myc、p53。
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bcl-2是凋亡的抑制基因，可抑制或阻断一些生理性或非生理性因素诱导的凋亡[2，3]，机理尚不清楚。有报道[4]以逆转录病毒为载体，将bcl-2基因转到NIH3T3细胞内，可提高细胞对辐射的抗损伤效应，辐射敏感性低于对照组，并可促进细胞增殖，表明bcl-2表达产物阻断了细胞凋亡途径上的某一环节，从而显示出长寿基因的作用。本研究也发现，bcl-2表达阳性组放疗效果较阴性组差，提示bcl-2可作为预测食管鳞状细胞癌放疗敏感性的指标之一。c-myc癌基因与人类多种肿瘤的发生密切相关，c-myc基因产物具有促进增殖和引发凋亡的双向作用，其结果取决于细胞接受的其他信号。c-myc癌基因转染细胞，可呈现不同的结果。有学者认为可使放射抗性增高。有人认为单纯c-myc基因转染并不增加细胞的放射抗性，但有可能与其他癌基因所致的细胞放射抗性的增加有协同作用[5]。本实验结果显示，虽然c-myc在食管癌组织中有较高表达，但与放疗疗效不呈现相关性。反映出单一c-myc指标难以作为判断肿瘤细胞放射敏感性的指标。p53基因在放疗中的作用目前研究的较为深入，甚至称其为辐射敏感相关基因。因为DNA损伤导致的细胞凋亡必须要有p53的参加，p53基因突变是目前所知人体肿瘤中(包括食管癌)最常见的基因改变，p53基因突变后不仅丧失抑癌功能，而且具有癌基因的特征。并可能通过干扰程序性死亡增加放射抗拒性。而免疫组化检测到的是以突变型为主的p53蛋白。本实验结果也反映出p53突变提高放射抗拒性的倾向，与其他学者研究结果相符[6，7]。p53基因状态的差异可使同一病理类型的肿瘤出现放疗反应的差异，p53基因表达产物的检测有助于放疗敏感性的预测。
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研究表明，单一癌基因对不同细胞转染可得到不同的结论，通过体外培养细胞所观察到的某个基因的改变对放射敏感性的影响来判定该基因在放射反应中的作用尚有局限性。辐射后细胞凋亡反应存在着异质性，其原因可能为基因调控的差异。一般说来，肿瘤细胞内存在多个癌基因的改变，细胞内各基因之间相互影响，其中任何一个基因产物的相对浓度和活性的改变都会影响细胞放射敏感性。如野生型p53基因引发凋亡有时需要c-myc基因存在，当p53基因突变时，野生型p53-myc基因对凋亡的作用将遭到破坏，使肿瘤细胞对射线的抗拒增加。Ryan[5]等在转染实验中发现bcl-2基因转染可阻止p53基因依赖的凋亡，但不是抑制生长，而当bcl-2与c-myc两种基因同时转染时，凋亡和生长抑制同时被阻断。所以，肿瘤放疗敏感性的预测及评价需观察多个相关癌基因或抑癌基因，Vincenzo[8]等在复习大量文献的基础上，提出p53基因、bcl-2基因、c-myc基因3者之间的对抗和协作是决定放射敏感性的关系点。本文结果也提示，这3项指标的检测和综合评价将比单一指标更可靠。另外，尚需结合临床、病理、个体差异等其他方面进行多因素综合分析。
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参考文献
[1]陈仁武，沈瑜，殷蔚伯.癌基因的表达对细胞放射敏感性的影响.中华放射肿瘤学杂志，1992，1：248-249.
[2]Hideasu I,Eiich T,Tsuyoshi M,et al.Apoptosis of human glioma cell in response to calphosttin C,a specific protein kinase C inhibitor.J Neurosury,1995,83:1008-1010.
[3]Oreste G,Vieri B,Anna Galzolari,et al.Bcl-2 protein expression collelates with recurrence and surviral in early stage head and neck cancer treated by radiotheapy.Clinical cancer research.1996,2:216-218.
, http://www.100md.com
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[5]Iliakis G,Induction and repair of DNA double strand breaks in radiation-resistant cells obtained by transformation of primary rat embryo cell with the oncogenes H-ras and V-myc.Cancer Res,1990,50:6575-6576.
[6]Lee JM,Bernstein A.p53 mutations increase resistance to ionizing radiation.PNAS USA,1993,90:5742.
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[8]Vincenzo C,Lucia M,Mavina C,et al.Dominant oncogenes,tumor suppressors,and radiosensitivity.Cell Mol Biol Res,1995,41:161-163.
(收稿日期:1999-09-21), 百拇医药