EIA基因对肿瘤细胞放射敏感性的影响
作者：张大昕 千新来 赵清正 余子豪
单位：张大昕(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所，放疗科，放射生物室，北京100021)；千新来(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所，放疗科，放射生物室，北京100021)；赵清正(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所，放疗科，放射生物室，北京100021)；余子豪(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所，放疗科，放射生物室，北京100021)
关键词：EIA基因；辐射增敏；肿瘤细胞
摘 要
摘 要：目的：利用外源性基因改变肿瘤原有的放射耐受性使其对放疗敏感，从而为提高肿瘤放射治疗疗效提供实验依据。方法：利用本实验室构建的含腺病毒(Ad5)早期表达基因EIA的pCDNA3-E1A重组质粒转染肺腺癌Anip-973细胞，G418筛选后，经PCR，RT-PCR和免疫细胞化学染色鉴定，获得含EIA的阳性克隆。将未转染的Anip-973细胞、转染空载体质粒的Anip-973细胞和转染EIA的Anip-973细胞取0、1、2、3、5、7、10GY剂量点，用6MV的X线单次照射以制作放射存活曲线；5GY单次照射后不同时间用MTT法测细胞存活。结果：①转染后的阳性克隆细胞PCR，RT-PCR和免疫细胞化学染色结果说明：EIA已整合到细胞基因组中并且稳定表达。②细胞放射存活曲线结果显示：未转染的Anip-973细胞Do=1.14，Dq=1.53；空载体转染后的Anip-973细胞Do=1.13，Dq=1.44；EIA转染后的Anip-973细胞Do=1.02，Dq=0.8。未转染及空载体转染后的Anip-973细胞照射后细胞存活无明显差异，而EIA转染后的Anip-973细胞照射后细胞存活明显下降，存活曲线的肩区变窄，Dq值降低。③5GY照射后不同时间转染前后的细胞存活以14小时最低，未转染的Anip-973细胞与转染EIA的Anip-973细胞14小时存活率分别为：69.5%、41.5%。经t检验均有显著差异。结论：本实验的结果证实EIA使Anip-973细胞照射后的间期死亡和增殖死亡均提高，使细胞的放射敏感性增加。
, 百拇医药
分类号：R73-76 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0197-03
Effect of EIA gene on tumor cell radiosensitivity
ZHANG Da-xin QIAN Xin-lai ZHAO Qing-zheng et al.
(Department of Radiation Oncology， Cancer Hospital， Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College， Beijing 100021， P.R.China. )
Abstract：Objective： To test if EIA gene is able to increase radiosensitivity of tumor cells. Methods： pcDNA3 vector with EIA gene (pcDNA3-EIA) was transfected into human lung cancer cells (Anip-973)， then the transfected cells were selected using G418， the positive colones were identified by PCR， RT-PCR and immunocytochemical methods， Anip-973 cells， and cells transfected with pcDNA3 vector (Anip973-vect cells) and transfected with pcDNA3-EIA (Anip973-E1A-cells) were irradiated with 0GY， 1GY， 2GY， 3GY， 5GY， 7GY， 10GY respectively using 6MV X ray. Above three cell lines were also given 5GY irradiation respectively， survival ratios of these cells were analyzed timely with MTT method. Results： PCR， RT-*PCR and immunocytochemical method confirmed that EIA gene has integrated into positive transfected cells and stably expressed. Cell radiation-survival curve showed that Do and Dq value in Anip-973 cell， Anip973-vect cells and Anip973-E1A were 1.14， 1.13， 1.02 and 1.53， 1.44， 0.8， respectively. The curve of Anip-973 cells and Anip973-vect cells did not show difference， but Anip973-EIA cells showed narrow shoulder region， and steeply fell. 5GY-irradiated cells showed the lowest survival at 14 hour， survival rate in Anip-973 cells and Anip973-EIA cells were 69.5% and 41.5%(P< 0.05). Conclusions： Both interphase death and proliferative death of the tumor cells were enhanced significantly by EIA gene. Thus， introducing EIA gene into tumor cells may be a useful approach to improve the effect of radiotherapy.
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Key words：EIA gene； Radiosensitization； Tumor cell▲
随着分子生物学的发展，人们越来越多的认识到，肿瘤的放射敏感性与其内在的分子生物学机制密切相关。目前，已发现许多癌基因和抑癌基因的异常表达可影响肿瘤细胞的程序性死亡、放射敏感性和预后，但是有些基因与肿瘤的放射敏感性和预后的确切关系还不清楚[1]。因此，有必要对肿瘤放射敏感性的分子生物学机制做进一步的研究，以确定肿瘤对放射治疗抗拒的内在原因，同时利用分子生物学的研究成果对肿瘤的放射敏感性进行调控，以提高肿瘤的治疗效果。本文报告利用腺病毒早期表达基因EIA转染人肺腺癌细胞，观察了EIA转染后该细胞的放射敏感性变化。
1 材料和方法
1.1 细胞及培养
采用具有p53突变型的人肺腺癌细胞系Anip-973(哈尔滨医科大学细胞生物教研室提供)[2]。培养条件为含10%小牛血清的PRMI-1640培养基，5%CO2孵箱37℃。
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1.2 细胞转染
取70%融合态的Anip-973细胞，将含EIA的pCDNA3-E1A重组质粒(本实验室构建)[3]及空载体pCDNA3质粒分别与脂质体1∶3混和后，无血清条件下培养10小时，加20%血清继续培养到24小时，换含10%小牛血清的1640培养48小时后加G418筛选，待单个克隆形成后取单克隆细胞G418继续筛选扩增。
1.3转染后的阳性克隆鉴定
1.3.1 PCR检测转染后细胞的neo基因：基因组DNA提取后定量将特定引物和底物混和成反应混合物，neo基因引物为：引物1：5-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3；引物2：5-CCGCTCAGAAGAACTCGTC-3。反应条件为：95℃变性1分钟→60℃退火1分钟→72℃延伸2分钟，32个循环后72℃延伸10分钟。
, http://www.100md.com 1.3.2 RT-PCR检测转染后细胞的EIA表达：细胞总RNA的提取按Trizol试剂盒说明书，cDNA第一条链的合成按GIBcol-BRL公司说明书，将制备好的cDNA及特定引物制成反应混合物。EIA基因的引物为：引物1：5-CGGAGGTGTTATTACCGAAG-3：引物2：5-TCGTCACTGGGTGGAAAGCC-3。反应条件为：93℃变性1分钟→59℃退火1分钟→72℃延伸2分钟，30个循环，最后72℃延伸5分钟。将得到的扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
1.4 免疫细胞化学染色
采用S-P法检测转染前后Anip-973细胞EIA基因的蛋白表达情况。
1.5 照射条件
用6MV的X线室温照射细胞，源皮距100cm，照射细胞培养瓶/板上放置1.5cm厚的蜡板。
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1.6 照射细胞存活曲线
设0GY、1GY、2GY、3GY、5GY、7GY、10GY剂量点，细胞消化后制成悬液，接种细胞，每个剂量点3瓶细胞，待细胞贴壁后照射。照射后细胞培养13天，无水乙醇固定细胞，按>50个细胞为一个克隆计数克隆，计算细胞存活率，计算机按单靶多击模型拟合，绘制细胞存活曲线，求Do值、Dq值。
1.7 MTT法测单次照射后细胞存活
96孔板接种细胞，每孔2×104个，每个时间点6孔，培养48小时后照射。未照射和照射后细胞在5%CO2孵箱37℃孵育后，按时间顺序以10∶1的体积加MTT(5mg/ml)，作用4小时后吸弃培养液，每孔加0.2ml的DMSO使细胞裂解，37℃孵育待紫色固体凝粒溶解均匀后，酶标仪测OD490值。用各时间点的OD值除以培养48小时未照射对照组的OD值得各时间点的存活率。
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2 结果
2.1 转染后的阳性克隆细胞鉴定结果
PCR及RTPCR产物电泳结果见图1A和1B，EIA蛋白表达见图1C。说明EIA已整合到细胞基因组中并且稳定表达。
图1A 扩增neo基因PCR产物的琼脂糖凝胶
电泳分析结果
1：Anip973DNA;2：Anip973-vectDNA;
3、4：Anip973-E1ADNA;5：Conteol;
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6：lambdaDNA/HindⅢMarkers
图1B E1A基因的RT-PCR扩增片段琼脂糖凝胶
电泳分析结果
1：Control;2、4、7:Anip973-E1A；3：Anip973；
5：Anip973-vect;6：阴性对照；
8：pBR322DNA/BstN1Markers
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图1C 转染后E1A蛋白表达免疫细胞化学染色结果(×400)
2.2 细胞存活曲线
未转染的Anip-973细胞和EIA转染后的Anip-973细胞及空载体pCDNA3转染后的Anip-973细胞照射后的细胞存活曲线：见图2。
图2 Anip-973未转达染及转染EIA和
空栽体后放射生存曲线
未转染的Anip-973细胞Do=1.14，Dq=1.53；空载体转染后的Anip-973细胞Do=1.13，Dq=1.44；EIA转染后的Anip-973细胞Do=1.02，Dq=0.8。未转染的Anip-973细胞和空载体转染后的Anip-973细胞照射后细胞存活无明显差异，而EIA转染后的Anip-973细胞照射后细胞存活明显下降，存活曲线的肩区变窄，Dq值降低。
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2.3 5GY照射后不同时间转染前后的细胞存活情况
见图3。未转染的Anip-973细胞与转染EIA的Anip-973细胞14小时存活率为：69.5%、41.5%。经t检验均有显著差异，t值和P值分别为t=4.303，P=0.020。结合结果2说明：EIA使照射后的细胞无论是间期死亡还是增殖死亡均增加。
图3 5GY照射后不同时间存活率
3 讨论
EIA是人腺病毒早期表达基因，转录后产生12S和13S两种mRNA，经过不同的拼接翻译成243R和289R两种主要的蛋白。转染后，EIA在多种细胞中能够稳定表达[4]。本文所使用的EIA为EIA289R。EIA使肿瘤细胞对化疗药物、射线及细胞因子诱导的凋亡更加敏感，被EIA转染了的细胞照射后的生长率比未转染的细胞明显降低，放射所至的DNA破坏程度也明显高于未转染的细胞，发生凋亡的比例也明显高于未转染的细胞。本文结果发现EIA转染后使细胞照射后的存活率下降，放射存活曲线的肩区下降，即亚致死性损伤的修复能力降低；5GY照射后不同时间细胞存活能力结果说明EIA使照射后的间期死亡和增殖死亡都增加。Anip-973细胞的p53是突变型的(mtp53)[2]，由于p53与凋亡有关，因此，有人研究了EIA引起的凋亡是否经过p53的介导。目前认为，EIA可以通过p53依赖性和p53非依赖性方式诱导凋亡。
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Lowe等[5]用wtp53(野生型)、mtp53(突变型)和p53(-)的鼠胚纤维母细胞(MEFs)观察了表达EIA的细胞被照射后凋亡程度与p53状态的关系。结果发现wtp53(+)并表达EIA的细胞，照射后很快进入了凋亡，表现出对射线敏感；wtp53(+)而EIA(-)的细胞，照射后出现了明显的G1期延迟；p53(-)、EIA(-)的细胞，照射后仍然有DNA的合成，并通过G1期在G2期/M期聚集(这种改变的程度比p53(+)细胞高，比EIA(+)细胞低)，因此推测EIA引起的凋亡是p53依赖性的。进一步的研究证明，p53依赖性凋亡是由EIA243R引起的，发现用12SEIA转染后，功能性p53蛋白质水下上升[6]。EIA289R可引起p53依赖性凋亡和p53非依赖性凋亡，即在p53(-)、wtp53(+)和mtp53(+)的三类细胞中均能引起凋亡[7]。Sanchez等认为，不管p53的状态以及H-ras等其它癌基因的状态或表达如何，EIA289R，243R均能使细胞对DNA损伤的药物和射线敏感性提高4～10倍[8]。EIA289R引起的细胞放射敏感性增高可能还有其它途径和因子的参与。
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本实验的结果证实EIA使Anip-973细胞照射后的间期死亡和增殖死亡均提高，使细胞的放射敏感性增加。其放射增敏的机理正在研究中。
基金项目：本课题部分受国家自然科学基金(批准号：39770822)资助
通讯作者：赵清正：Tel：86-10-67781331 Fax：86-10-67713359
参考文献：
[1]Muschel RJ， Soto ED， McKenna WG， et al. Radiosensitization and apoptosis [J]. Oncogene， 1998.17(25)： 3359～ 3363.
[2]于世辉.肺腺癌细胞系AGZY83a和Anip-973基因部分外显子序列分析 [C]. 黑龙江省遗传学会1992年年会论文集，P5～6.
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[3]石宇，赵清正，陈燕 .腺病毒EIA基因高效真核表达载体的构建与鉴定[J].中华放射肿瘤学杂 志，1999，8(2)：106～108.
[4]石宇，赵清正.腺病毒EIA基因研究进展 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志，1999，6：158～160. [5]Sanchez PR， Lieonart M， Cajal SR. Lack of correlation between p53 protein level and sensitivity of DNA-damaging agents in keratinocytes carrying adenovirus EIA mutants [J]. Oncogene， 1995， 11： 675～ 682.
[6]Lowe SW， Ruley HE， Jacks T， et al. p53 dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents [J]. Cell， 1993， 74： 957～ 967.
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[7]Querido E， Teokoro JG， Branton PE. Adenovirus EIA proteins induced apoptosis by both p53-independent and p53 dependent mechanisms[J].Oncogene， 1995， 11： 467～ 474.
[8]Sanchez-Prieto R， Quintanilla M， Cano A， et al. Carcinoma cell lines become sensitive to DNA-damaging agents by the expression of the adenovirus EIA gene[J]. Oncogene,1996,13： 1083～ 1092.
收稿日期：1999-10-28
修稿日期：2000-01-18, http://www.100md.com
单位：张大昕(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所，放疗科，放射生物室，北京100021)；千新来(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所，放疗科，放射生物室，北京100021)；赵清正(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所，放疗科，放射生物室，北京100021)；余子豪(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所，放疗科，放射生物室，北京100021)
关键词：EIA基因；辐射增敏；肿瘤细胞
摘 要
摘 要：目的：利用外源性基因改变肿瘤原有的放射耐受性使其对放疗敏感，从而为提高肿瘤放射治疗疗效提供实验依据。方法：利用本实验室构建的含腺病毒(Ad5)早期表达基因EIA的pCDNA3-E1A重组质粒转染肺腺癌Anip-973细胞，G418筛选后，经PCR，RT-PCR和免疫细胞化学染色鉴定，获得含EIA的阳性克隆。将未转染的Anip-973细胞、转染空载体质粒的Anip-973细胞和转染EIA的Anip-973细胞取0、1、2、3、5、7、10GY剂量点，用6MV的X线单次照射以制作放射存活曲线；5GY单次照射后不同时间用MTT法测细胞存活。结果：①转染后的阳性克隆细胞PCR，RT-PCR和免疫细胞化学染色结果说明：EIA已整合到细胞基因组中并且稳定表达。②细胞放射存活曲线结果显示：未转染的Anip-973细胞Do=1.14，Dq=1.53；空载体转染后的Anip-973细胞Do=1.13，Dq=1.44；EIA转染后的Anip-973细胞Do=1.02，Dq=0.8。未转染及空载体转染后的Anip-973细胞照射后细胞存活无明显差异，而EIA转染后的Anip-973细胞照射后细胞存活明显下降，存活曲线的肩区变窄，Dq值降低。③5GY照射后不同时间转染前后的细胞存活以14小时最低，未转染的Anip-973细胞与转染EIA的Anip-973细胞14小时存活率分别为：69.5%、41.5%。经t检验均有显著差异。结论：本实验的结果证实EIA使Anip-973细胞照射后的间期死亡和增殖死亡均提高，使细胞的放射敏感性增加。
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分类号：R73-76 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)03-0197-03
Effect of EIA gene on tumor cell radiosensitivity
ZHANG Da-xin QIAN Xin-lai ZHAO Qing-zheng et al.
(Department of Radiation Oncology， Cancer Hospital， Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College， Beijing 100021， P.R.China. )
Abstract：Objective： To test if EIA gene is able to increase radiosensitivity of tumor cells. Methods： pcDNA3 vector with EIA gene (pcDNA3-EIA) was transfected into human lung cancer cells (Anip-973)， then the transfected cells were selected using G418， the positive colones were identified by PCR， RT-PCR and immunocytochemical methods， Anip-973 cells， and cells transfected with pcDNA3 vector (Anip973-vect cells) and transfected with pcDNA3-EIA (Anip973-E1A-cells) were irradiated with 0GY， 1GY， 2GY， 3GY， 5GY， 7GY， 10GY respectively using 6MV X ray. Above three cell lines were also given 5GY irradiation respectively， survival ratios of these cells were analyzed timely with MTT method. Results： PCR， RT-*PCR and immunocytochemical method confirmed that EIA gene has integrated into positive transfected cells and stably expressed. Cell radiation-survival curve showed that Do and Dq value in Anip-973 cell， Anip973-vect cells and Anip973-E1A were 1.14， 1.13， 1.02 and 1.53， 1.44， 0.8， respectively. The curve of Anip-973 cells and Anip973-vect cells did not show difference， but Anip973-EIA cells showed narrow shoulder region， and steeply fell. 5GY-irradiated cells showed the lowest survival at 14 hour， survival rate in Anip-973 cells and Anip973-EIA cells were 69.5% and 41.5%(P< 0.05). Conclusions： Both interphase death and proliferative death of the tumor cells were enhanced significantly by EIA gene. Thus， introducing EIA gene into tumor cells may be a useful approach to improve the effect of radiotherapy.
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Key words：EIA gene； Radiosensitization； Tumor cell▲
随着分子生物学的发展，人们越来越多的认识到，肿瘤的放射敏感性与其内在的分子生物学机制密切相关。目前，已发现许多癌基因和抑癌基因的异常表达可影响肿瘤细胞的程序性死亡、放射敏感性和预后，但是有些基因与肿瘤的放射敏感性和预后的确切关系还不清楚[1]。因此，有必要对肿瘤放射敏感性的分子生物学机制做进一步的研究，以确定肿瘤对放射治疗抗拒的内在原因，同时利用分子生物学的研究成果对肿瘤的放射敏感性进行调控，以提高肿瘤的治疗效果。本文报告利用腺病毒早期表达基因EIA转染人肺腺癌细胞，观察了EIA转染后该细胞的放射敏感性变化。
1 材料和方法
1.1 细胞及培养
采用具有p53突变型的人肺腺癌细胞系Anip-973(哈尔滨医科大学细胞生物教研室提供)[2]。培养条件为含10%小牛血清的PRMI-1640培养基，5%CO2孵箱37℃。
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1.2 细胞转染
取70%融合态的Anip-973细胞，将含EIA的pCDNA3-E1A重组质粒(本实验室构建)[3]及空载体pCDNA3质粒分别与脂质体1∶3混和后，无血清条件下培养10小时，加20%血清继续培养到24小时，换含10%小牛血清的1640培养48小时后加G418筛选，待单个克隆形成后取单克隆细胞G418继续筛选扩增。
1.3转染后的阳性克隆鉴定
1.3.1 PCR检测转染后细胞的neo基因：基因组DNA提取后定量将特定引物和底物混和成反应混合物，neo基因引物为：引物1：5-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3；引物2：5-CCGCTCAGAAGAACTCGTC-3。反应条件为：95℃变性1分钟→60℃退火1分钟→72℃延伸2分钟，32个循环后72℃延伸10分钟。
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1.4 免疫细胞化学染色
采用S-P法检测转染前后Anip-973细胞EIA基因的蛋白表达情况。
1.5 照射条件
用6MV的X线室温照射细胞，源皮距100cm，照射细胞培养瓶/板上放置1.5cm厚的蜡板。
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1.6 照射细胞存活曲线
设0GY、1GY、2GY、3GY、5GY、7GY、10GY剂量点，细胞消化后制成悬液，接种细胞，每个剂量点3瓶细胞，待细胞贴壁后照射。照射后细胞培养13天，无水乙醇固定细胞，按>50个细胞为一个克隆计数克隆，计算细胞存活率，计算机按单靶多击模型拟合，绘制细胞存活曲线，求Do值、Dq值。
1.7 MTT法测单次照射后细胞存活
96孔板接种细胞，每孔2×104个，每个时间点6孔，培养48小时后照射。未照射和照射后细胞在5%CO2孵箱37℃孵育后，按时间顺序以10∶1的体积加MTT(5mg/ml)，作用4小时后吸弃培养液，每孔加0.2ml的DMSO使细胞裂解，37℃孵育待紫色固体凝粒溶解均匀后，酶标仪测OD490值。用各时间点的OD值除以培养48小时未照射对照组的OD值得各时间点的存活率。
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2 结果
2.1 转染后的阳性克隆细胞鉴定结果
PCR及RTPCR产物电泳结果见图1A和1B，EIA蛋白表达见图1C。说明EIA已整合到细胞基因组中并且稳定表达。
图1A 扩增neo基因PCR产物的琼脂糖凝胶
电泳分析结果
1：Anip973DNA;2：Anip973-vectDNA;
3、4：Anip973-E1ADNA;5：Conteol;
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6：lambdaDNA/HindⅢMarkers
图1B E1A基因的RT-PCR扩增片段琼脂糖凝胶
电泳分析结果
1：Control;2、4、7:Anip973-E1A；3：Anip973；
5：Anip973-vect;6：阴性对照；
8：pBR322DNA/BstN1Markers
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图1C 转染后E1A蛋白表达免疫细胞化学染色结果(×400)
2.2 细胞存活曲线
未转染的Anip-973细胞和EIA转染后的Anip-973细胞及空载体pCDNA3转染后的Anip-973细胞照射后的细胞存活曲线：见图2。
图2 Anip-973未转达染及转染EIA和
空栽体后放射生存曲线
未转染的Anip-973细胞Do=1.14，Dq=1.53；空载体转染后的Anip-973细胞Do=1.13，Dq=1.44；EIA转染后的Anip-973细胞Do=1.02，Dq=0.8。未转染的Anip-973细胞和空载体转染后的Anip-973细胞照射后细胞存活无明显差异，而EIA转染后的Anip-973细胞照射后细胞存活明显下降，存活曲线的肩区变窄，Dq值降低。
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2.3 5GY照射后不同时间转染前后的细胞存活情况
见图3。未转染的Anip-973细胞与转染EIA的Anip-973细胞14小时存活率为：69.5%、41.5%。经t检验均有显著差异，t值和P值分别为t=4.303，P=0.020。结合结果2说明：EIA使照射后的细胞无论是间期死亡还是增殖死亡均增加。
图3 5GY照射后不同时间存活率
3 讨论
EIA是人腺病毒早期表达基因，转录后产生12S和13S两种mRNA，经过不同的拼接翻译成243R和289R两种主要的蛋白。转染后，EIA在多种细胞中能够稳定表达[4]。本文所使用的EIA为EIA289R。EIA使肿瘤细胞对化疗药物、射线及细胞因子诱导的凋亡更加敏感，被EIA转染了的细胞照射后的生长率比未转染的细胞明显降低，放射所至的DNA破坏程度也明显高于未转染的细胞，发生凋亡的比例也明显高于未转染的细胞。本文结果发现EIA转染后使细胞照射后的存活率下降，放射存活曲线的肩区下降，即亚致死性损伤的修复能力降低；5GY照射后不同时间细胞存活能力结果说明EIA使照射后的间期死亡和增殖死亡都增加。Anip-973细胞的p53是突变型的(mtp53)[2]，由于p53与凋亡有关，因此，有人研究了EIA引起的凋亡是否经过p53的介导。目前认为，EIA可以通过p53依赖性和p53非依赖性方式诱导凋亡。
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Lowe等[5]用wtp53(野生型)、mtp53(突变型)和p53(-)的鼠胚纤维母细胞(MEFs)观察了表达EIA的细胞被照射后凋亡程度与p53状态的关系。结果发现wtp53(+)并表达EIA的细胞，照射后很快进入了凋亡，表现出对射线敏感；wtp53(+)而EIA(-)的细胞，照射后出现了明显的G1期延迟；p53(-)、EIA(-)的细胞，照射后仍然有DNA的合成，并通过G1期在G2期/M期聚集(这种改变的程度比p53(+)细胞高，比EIA(+)细胞低)，因此推测EIA引起的凋亡是p53依赖性的。进一步的研究证明，p53依赖性凋亡是由EIA243R引起的，发现用12SEIA转染后，功能性p53蛋白质水下上升[6]。EIA289R可引起p53依赖性凋亡和p53非依赖性凋亡，即在p53(-)、wtp53(+)和mtp53(+)的三类细胞中均能引起凋亡[7]。Sanchez等认为，不管p53的状态以及H-ras等其它癌基因的状态或表达如何，EIA289R，243R均能使细胞对DNA损伤的药物和射线敏感性提高4～10倍[8]。EIA289R引起的细胞放射敏感性增高可能还有其它途径和因子的参与。
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本实验的结果证实EIA使Anip-973细胞照射后的间期死亡和增殖死亡均提高，使细胞的放射敏感性增加。其放射增敏的机理正在研究中。
基金项目：本课题部分受国家自然科学基金(批准号：39770822)资助
通讯作者：赵清正：Tel：86-10-67781331 Fax：86-10-67713359
参考文献：
[1]Muschel RJ， Soto ED， McKenna WG， et al. Radiosensitization and apoptosis [J]. Oncogene， 1998.17(25)： 3359～ 3363.
[2]于世辉.肺腺癌细胞系AGZY83a和Anip-973基因部分外显子序列分析 [C]. 黑龙江省遗传学会1992年年会论文集，P5～6.
, http://www.100md.com
[3]石宇，赵清正，陈燕 .腺病毒EIA基因高效真核表达载体的构建与鉴定[J].中华放射肿瘤学杂 志，1999，8(2)：106～108.
[4]石宇，赵清正.腺病毒EIA基因研究进展 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志，1999，6：158～160. [5]Sanchez PR， Lieonart M， Cajal SR. Lack of correlation between p53 protein level and sensitivity of DNA-damaging agents in keratinocytes carrying adenovirus EIA mutants [J]. Oncogene， 1995， 11： 675～ 682.
[6]Lowe SW， Ruley HE， Jacks T， et al. p53 dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents [J]. Cell， 1993， 74： 957～ 967.
, 百拇医药
[7]Querido E， Teokoro JG， Branton PE. Adenovirus EIA proteins induced apoptosis by both p53-independent and p53 dependent mechanisms[J].Oncogene， 1995， 11： 467～ 474.
[8]Sanchez-Prieto R， Quintanilla M， Cano A， et al. Carcinoma cell lines become sensitive to DNA-damaging agents by the expression of the adenovirus EIA gene[J]. Oncogene,1996,13： 1083～ 1092.
收稿日期：1999-10-28
修稿日期：2000-01-18, http://www.100md.com