p16基因转染对CNE-2细胞放射敏感性的研究
作者：罗京伟 梁克 徐国镇 赵清正 殷蔚伯 高黎
单位：100021北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科(罗京伟、徐国镇、殷蔚伯、高黎)；放射生物室(梁克、赵清正)
关键词：p16基因；转染；CNE-2细胞系；细胞凋亡；放射敏感性
中华放射肿瘤学杂志990411 【摘要】 目的 探讨外源性p16基因转染人鼻咽癌细胞系CNE-2后对其放射敏感性的影响。方法 通过脂质体介导的基因转染方法将野生型p16基因、空载体分别转入该基因突变的CNE-2细胞中，同时设置不加任何质粒的CNE-2细胞作为对照。3组细胞在相同的实验条件下，分别接受0，2，4，6，8，10Gy照射，经培养后计算细胞贴壁率再换算成存活率，按照多击单靶模型进行数学拟合，获存活曲线，求出D0值等参数；利用流式细胞仪(FCM)检测细胞增殖周期的分布情况；利用Hoechst 33342及TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果 p16基因的导入使D0，Dq值明显下降；CNE-2细胞阻滞在G1期，S期细胞明显减少，凋亡明显增加。结论 外源性p16基因导入CNE-2细胞可引起放射敏感性增加，同时伴有G1期阻滞及诱导凋亡发生。
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Effects of exogenous p16 gene on radiosensitivity of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2
LUO Jingwei*, LIANG Ke, XU Guozhen, et al. * Department of Radiation Oncology, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing 100021
【Abstract】 Objective To study the effects of exogenous p16 gene on radiosensitivity of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2. Methods Exogenous p16 gene was transfected into CNE-2 cells by lipofectin . After G418 selection, we obtained p16 stably expressed NPC cell clones,CNE-2-p16. Survival curves were made to evaluate the radiosensitivity. The results were compared with primary CNE-2 and CNE-2-vect cell lines. At the same time ,flow cytometry(FCM)and Apoptotic Index(AI) were done to study the effects of p16 gene on cell cycles and AI. Results Immunohistochemical detection showed CNE-2-p16 cells express p16 protein which indicated exogenous p16 gene had been transfected into CNE-2 cells successfully and expressed actively. Assay of FCM to CNE-2-p16 cells showed arrest in G1 phase, decrease in percentage of S phase cell significantly . Apoptotic index of CNE-2-p16 lines increased significantly by assay of Tunel and fluorescent methods. Analysis of survival curves and related data showed radiosensitivity of CNE-2-p16 lines increased significantly. Conclusions These results support the concepts that p16 gene is a suppressor gene, and plays an important role in NPC. The study of p16 gene transfection reveals that p16 can inhibit growth , induce the apoptosis and increase radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2.
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【Key words】 p16 gene; Transfection; CNE-2 cell line; Apoptosis; Radiosensitivity
p16抑癌基因无论在人原发性鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)，还是在离体培养的细胞系中，均存在着高频率的失活与缺失，因此p16基因就成为NPC发生、发展过程中的一个重要的候选抑癌基因[1]。目前的研究表明，通过基因转染的方法，将p16抑癌基因导入人体肿瘤细胞系中，如脑胶质瘤、肺癌、胃癌、黑色素瘤等细胞中，均显示p16基因通过直接抑制细胞增殖周期而阻滞肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞的致瘤性[2-6]。有关p16抑癌基因对NPC肿瘤细胞生物学行为的影响，尤其是对放射敏感性的影响，国内外均未见报道。因此，作者将外源性p16基因导入该基因突变的人鼻咽癌细胞系CNE-2中，研究p16基因对CNE-2细胞放射敏感性的影响，为今后NPC的临床试验性基因治疗奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 质粒：pcDNA3-p16是具有细胞肥大病毒(CMV)启动子的人p16cDNA(0.5kB)真核表达型质粒，pcDNA3是具有CMV启动子但不含p16-cDNA3的质粒，称之为空载体(Vect)，二者均由赵清正教授惠赠。
1.2 细胞系及基因转染：CNE-2细胞为人鼻咽低分化鳞癌细胞系，已知有p16基因突变而造成其表达产物的缺失，由中国医学科学院肿瘤医院放射生物室提供。培养条件为DMEM培养基，其中含10%的胎牛血清，培养基中各含100μg/mL的青霉素、链霉素及质量浓度为0.15g/L的谷氨酰胺。在37℃培养箱中密闭培养，隔天换液，平均每周用质量浓度为2.5g/L的胰酶消化分瓶1次。照射时选择处于指数生长期的细胞(换液后24小时)。采用脂质体介导的基因转染方法将两种质粒导入CNE-2细胞中，G418筛选(400μg/mL)，同时用CNE-2细胞作对照。筛选约2周，对照细胞全部死亡，降低G418浓度至100μg/mL维持，直至阳性克隆出现，所形成的克隆分别命名为CNE-2-p16及CNE-2-vect。
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1.3 鉴定：挑取阳性克隆细胞，传代增殖后利用免疫组织化学染色的方法检测CNE-2-p16细胞有无p16蛋白的产生来鉴定转染是否成功。p16多克隆抗体为美国Santa cruz公司产品，工作浓度为1：100。采用ABC法进行染色。
1.4 流式细胞仪(FCM)测定细胞周期各时相的变化：具体按照文献[3]的方法进行。
1.5 凋亡的测定：利用细胞荧光染色(Hoechst 33342)和脱氧核苷酰转移酶末端标记(TDT-mediated dUTP nick end labelling，TUNEL)两种方法来检测凋亡的发生。具体步骤按照宝灵曼公司生产的凋亡试剂盒说明书进行。
1.6 存活曲线的制作：将处于指数生长期的3组细胞即CNE-2，CNE-2-vect，CNE-2-p16细胞分别以0，2，4，6，8，10Gy照射(6MV X射线，剂量率为3Gy/min)。每剂量组按一定比例的细胞数接种3个平皿，培养2～3周后得到各剂量组克隆形成数，计算细胞贴壁率并换算成细胞存活份数。按照多击单靶模型S=1-[1-exp(-D/D0)]N拟合存活曲线，并求出参数D0，Dq值等。
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1.7 统计学方法：对FCM检测的3组细胞增殖周期的改变进行组间差异的t检验。
2 结果
2.1 p16基因转染的CNE-2细胞生长情况：p16转染组形成克隆的时间长，2周后仅见小的克隆生长，其生长速度缓慢，5周始才形成较明显的克隆，而且细胞间隙增大；CNE-2-vect及CNE-2组2周时即可形成明显的克隆，提示前者的生长明显受到抑制。
2.2 外源性p16基因在CNE-2的表达情况：免疫组织化学检测结果显示CNE-2-p16细胞p16蛋白阳性，表明外源性p16基因已经整合入CNE-2细胞并表达，而CNE-2-vect组及对照组CNE-2细胞，p16的检测均阴性(见图1、图2)。
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图1 CNE-2-p16细胞p16蛋白免疫组化染色阳性结果，可见细胞核呈明显的黄褐色，同时胞浆也出现黄褐色，但明显弱于细胞核(×400)
图2 CNE-2,CNE-2-vect细胞p16蛋白免疫组化染色服用性结果，细胞核及细胞浆均呈蓝色(×200)
2.3 外源性p16基因对CNE-2细胞增殖周期的影响：将p16基因转染、G418筛选所获得的阳性克隆混合培养约1个月，达到所需要的细胞数量时，和对照组CNE-2-vect及CNE-2细胞在同一时间内按照相同数量级消化传代，24小时后3组细胞同步上机检测。FCM检测结果显示导入外源性p16基因可引起明显的G1期阻滞，同对照组细胞相比，前者G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少，经t检验显示组间差异有显著意义(P<0.05)，详见表1。
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表1 p16基因对CNE-2细胞增殖周期各时相的影响(%) 细胞系
G1/G0期
S期
G2/M期
CNE-2
34.63±1.47
37.20±0.61
28.17±2.08
CNE-2-vect
37.23±0.81
32.87±2.89
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29.90±2.15
CME-2-p16
54.57±3.31▲
21.80±1.48▲
23.67±2.46
注：▲：CNE-2-p16与CNE-2-vect,CNE-2相比，P<0.05
2.4 外源性p16基因对CNE-2细胞凋亡的影响：两种方法检测凋亡的结果均显示p16基因使CNE-2细胞凋亡明显增加(见表2)。
表2 3组细胞经两种方法检测的凋亡百分率(%) 细胞种类
, http://www.100md.com 细胞荧光染色法
TUNEL法
均值
CNE-2
4.2
5.4
4.8
CNE-2-vect
9.0
9.4
9.2
CNE-2-p16
19.0
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22.0
20.5
细胞种类
细胞荧光染色法
TUNEL法
均值
CNE-2
4.2
5.4
4.8
CNE-2-vect
9.0
9.4
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9.2
CNE-2-p16
19.0
22.0
20.5
2.5 外源性p16基因对CNE-2细胞放射敏感性的影响：图3为3组细胞即CNE-2，CNE-2-vect，CNE-2-p16经多击单靶模型拟合后的存活曲线，表3为其相关参数。表3 3组细胞多击单靶模型拟合的相关参数 细胞种类
D0值(Gy)
Dq值(Gy)
N值
CNE-2
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0.97
2.48
12.78
CNE-2-vect
0.99
1.84
6.34
CNE-2-p16
0.86
0.54
1.89
, http://www.100md.com 图3 CNE-2，CNE-2-vect，CNE-2-p16细胞的存活曲线
由存活曲线可以看出CNE-2，CNE-2-vect均有一较明显的“肩宽”，而且在各个剂量点的存活份数都相近，D0值也相近(表3)，表明2个组细胞的放射敏感性相似。而CNE-2-p16细胞组的“肩宽”明显缩小变窄，且在各个剂量点的存活份数均明显低于CNE-2，CNE-2-vect细胞组，表明CNE-2-vect细胞的放射敏感性较其它2个组为高，其增敏比为3.41(Dq值比)，1.15(D0值比)。其不同增敏比求法反映了不同的增敏机制，D0值比反映了射线在造成相同生物效应时所需剂量比值(平均致死剂量的高低比较)，反映的是不同细胞对射线的敏感程度。Dq值比反映了细胞对射线亚致死性损伤修复能力高低的比较。本研究用多击单靶模型分析结果表明，p16抑癌基因导入CNE-2细胞后所增加的放射敏感性，是通过抑制亚致死损伤修复而实现的。
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3 讨论
目前的研究认为癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发病的分子机制。因此从基因水平上去替代、阻抑、控制和攻击细胞中有缺陷的或有害的基因，从而达到肿瘤治疗的目的，就成为现代医学和生物学中一个前沿研究领域。目前已进入临床I期试验的基因治疗，如野生性p53基因在晚期肺癌、头颈部鳞癌等部分肿瘤患者中的近期治疗效果令人鼓舞[7]。作为我国高发的恶性肿瘤NPC，在这方面的研究就显得较为落后。因为目前已肯定的抑癌基因中的Rb,p21等在NPC中完全正常，而在肿瘤的基因治疗中占举足轻重的p53抑癌基因在原发性NPC中的突变率也甚低，尽管免疫组化检测的突变性p53蛋白的阳性率较高(可达50%～80%)，但在基因水平上p53的突变率仅为6%左右。其原因可能是EB病毒与野生性p53蛋白结合而使其丧失活性所致[8-10]。因此，这些抑癌基因在NPC中的作用可能有限，试图利用这几个抑癌基因去探讨日后NPC的基因治疗可能不会有较大的突破。
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p16抑癌基因无论在原发性NPC中还是在NPC细胞系中，其蛋白水平和基因水平检测结果均显示，p16基因均有高频率的失活，而且其作用机制为直接抑制细胞周期，因而其在NPC中的作用就显得较其它抑癌基因更为重要[1，11]。目前的研究业已表明在NPC中由于突变、缺失、高甲基化而导致p16基因的低表达或不表达，其与肿瘤的发生、发展有着重要的关系。作者通过导入外源性p16基因的方法，使得p16基因的表达得以恢复，以便研究其在NPC生物学行为中的作用及对放射敏感性的影响。在实验中，为鉴定p16基因是否导入CNE-2细胞系中，作者采用免疫组织化学方法来鉴定经p16转染、G418筛选生长后的克隆细胞。其它实验是采用孙梅等[4]的方法，将所获得的细胞(包括鉴定的细胞)混合培养后进行FCM、凋亡检测及放射敏感性等研究。这样一方面保证了免疫组化鉴定的可靠性，另一方面又避免了由于反复传代引起的外源基因的丢失，并且不影响以下所进行实验的可靠性。
p16基因主要是通过G1期阻滞而发挥其作用的。本实验证实导入外源性p16基因的CNE-2细胞同对照组相比，其G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少。导入外源性p16基因明显地增加了凋亡的发生，无论是采用Hoeschst 33342还是TUNEL方法，均得出了相同的结果。同时，实验还发现p16基因具有放射增敏作用，有关这方面的研究尚未见报道。
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综上所述，研究结果再次证实了p16基因通过G1期阻滞而抑制肿瘤细胞的增殖能力，而且明确了p16基因可诱导肿瘤细胞凋亡的发生，首次发现了p16基因具有放射增敏作用。增敏的机制可能与p16基因引起的S期细胞比例下降、凋亡增加及对射线的亚致死性损伤修复能力的下降等有关。因此，它为进一步深入探讨NPC中p16基因的功能及临床基因治疗的可行性提供了新的试验依据。
志谢 衷心感谢董秀癑老师对放射增敏数据的计算机处理。
注释：基金项目：本课题部分受国家自然科学基金资助项目(39500043)
参考文献
1 Gulley ML, Nicholls JM, Schneider BG, et al. Nasopharyngeal carcinomas frequently lack the p16/MTS1 tumor suppressor protein but consistently express the retinoblastoma gene product. AJP ,1998,152(3):865-869.
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2 Arap W, Nishikawa R, Furnari FB, et al. Replacement of the p16/CDKN2 gene suppresses human glioma cell growth. Cancer Res,1995, 55(6):1351.
3 付晓颖,曹世龙,冉瑞琼,等. p16基因重组质粒的构建及其对人肺癌细胞的抑制. 中国肿瘤生物治疗杂志, 1998,5(1):9-12.
4 孙梅，吕有勇. 外源性p16基因表达可抑制人胃癌细胞的恶性增殖. 中华肿瘤杂志, 1997, 19(6):410-413.
5 程金科，林晨，邢嵘, 等.腺病毒介导p16基因转移及诱导黑色素瘤细胞凋亡. 中华肿瘤杂志,1999，21(2)：89-92.
6 Jin X, Nguyen D, Zhang WW, et al. Cell cycle arrest and inhibition of tumor cell proliferation by the p16INK4 gene mediated by adenovirus vector . Cancer Res,1995,55(15):3250.
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7 Hargest R, Williamson R. Prophylactic gene therapy for cancer. Gene Therapy, 1996,3(1):97.
8 Spruck CH, Tsao YC, Huang DP, et al. Absence of p53 gene mutation in primary nasopharyngeal carcinomas. Cancer Res,1992,52(17):4787-4790.
9 李满枝，陈军，江慧民. 鼻咽癌中p53基因突变的研究. 癌症, 1998, 17(3):246-248.
10 Sun Y, Hegamyer G, Colburn NH. Nasopharyngeal carcinoma shows no detectable retinoblastoma susceptibility gene alteration. Oncogene,1993,8(3):791-795.
11 Geradts J, Kratzke RA, Niehans GA, et al. Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2/multiple tumor suppressor gene 1(CDKN2/MST1) product p16INK4A in archival human solid tumors: correlation with retinoblastoma protein expression. Cancer Res, 1995,55(24):6006-6011.
收稿：1999-05-18 修回：1999-08-05, 百拇医药
单位：100021北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科(罗京伟、徐国镇、殷蔚伯、高黎)；放射生物室(梁克、赵清正)
关键词：p16基因；转染；CNE-2细胞系；细胞凋亡；放射敏感性
中华放射肿瘤学杂志990411 【摘要】 目的 探讨外源性p16基因转染人鼻咽癌细胞系CNE-2后对其放射敏感性的影响。方法 通过脂质体介导的基因转染方法将野生型p16基因、空载体分别转入该基因突变的CNE-2细胞中，同时设置不加任何质粒的CNE-2细胞作为对照。3组细胞在相同的实验条件下，分别接受0，2，4，6，8，10Gy照射，经培养后计算细胞贴壁率再换算成存活率，按照多击单靶模型进行数学拟合，获存活曲线，求出D0值等参数；利用流式细胞仪(FCM)检测细胞增殖周期的分布情况；利用Hoechst 33342及TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果 p16基因的导入使D0，Dq值明显下降；CNE-2细胞阻滞在G1期，S期细胞明显减少，凋亡明显增加。结论 外源性p16基因导入CNE-2细胞可引起放射敏感性增加，同时伴有G1期阻滞及诱导凋亡发生。
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Effects of exogenous p16 gene on radiosensitivity of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2
LUO Jingwei*, LIANG Ke, XU Guozhen, et al. * Department of Radiation Oncology, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing 100021
【Abstract】 Objective To study the effects of exogenous p16 gene on radiosensitivity of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2. Methods Exogenous p16 gene was transfected into CNE-2 cells by lipofectin . After G418 selection, we obtained p16 stably expressed NPC cell clones,CNE-2-p16. Survival curves were made to evaluate the radiosensitivity. The results were compared with primary CNE-2 and CNE-2-vect cell lines. At the same time ,flow cytometry(FCM)and Apoptotic Index(AI) were done to study the effects of p16 gene on cell cycles and AI. Results Immunohistochemical detection showed CNE-2-p16 cells express p16 protein which indicated exogenous p16 gene had been transfected into CNE-2 cells successfully and expressed actively. Assay of FCM to CNE-2-p16 cells showed arrest in G1 phase, decrease in percentage of S phase cell significantly . Apoptotic index of CNE-2-p16 lines increased significantly by assay of Tunel and fluorescent methods. Analysis of survival curves and related data showed radiosensitivity of CNE-2-p16 lines increased significantly. Conclusions These results support the concepts that p16 gene is a suppressor gene, and plays an important role in NPC. The study of p16 gene transfection reveals that p16 can inhibit growth , induce the apoptosis and increase radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2.
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【Key words】 p16 gene; Transfection; CNE-2 cell line; Apoptosis; Radiosensitivity
p16抑癌基因无论在人原发性鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)，还是在离体培养的细胞系中，均存在着高频率的失活与缺失，因此p16基因就成为NPC发生、发展过程中的一个重要的候选抑癌基因[1]。目前的研究表明，通过基因转染的方法，将p16抑癌基因导入人体肿瘤细胞系中，如脑胶质瘤、肺癌、胃癌、黑色素瘤等细胞中，均显示p16基因通过直接抑制细胞增殖周期而阻滞肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞的致瘤性[2-6]。有关p16抑癌基因对NPC肿瘤细胞生物学行为的影响，尤其是对放射敏感性的影响，国内外均未见报道。因此，作者将外源性p16基因导入该基因突变的人鼻咽癌细胞系CNE-2中，研究p16基因对CNE-2细胞放射敏感性的影响，为今后NPC的临床试验性基因治疗奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 质粒：pcDNA3-p16是具有细胞肥大病毒(CMV)启动子的人p16cDNA(0.5kB)真核表达型质粒，pcDNA3是具有CMV启动子但不含p16-cDNA3的质粒，称之为空载体(Vect)，二者均由赵清正教授惠赠。
1.2 细胞系及基因转染：CNE-2细胞为人鼻咽低分化鳞癌细胞系，已知有p16基因突变而造成其表达产物的缺失，由中国医学科学院肿瘤医院放射生物室提供。培养条件为DMEM培养基，其中含10%的胎牛血清，培养基中各含100μg/mL的青霉素、链霉素及质量浓度为0.15g/L的谷氨酰胺。在37℃培养箱中密闭培养，隔天换液，平均每周用质量浓度为2.5g/L的胰酶消化分瓶1次。照射时选择处于指数生长期的细胞(换液后24小时)。采用脂质体介导的基因转染方法将两种质粒导入CNE-2细胞中，G418筛选(400μg/mL)，同时用CNE-2细胞作对照。筛选约2周，对照细胞全部死亡，降低G418浓度至100μg/mL维持，直至阳性克隆出现，所形成的克隆分别命名为CNE-2-p16及CNE-2-vect。
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1.3 鉴定：挑取阳性克隆细胞，传代增殖后利用免疫组织化学染色的方法检测CNE-2-p16细胞有无p16蛋白的产生来鉴定转染是否成功。p16多克隆抗体为美国Santa cruz公司产品，工作浓度为1：100。采用ABC法进行染色。
1.4 流式细胞仪(FCM)测定细胞周期各时相的变化：具体按照文献[3]的方法进行。
1.5 凋亡的测定：利用细胞荧光染色(Hoechst 33342)和脱氧核苷酰转移酶末端标记(TDT-mediated dUTP nick end labelling，TUNEL)两种方法来检测凋亡的发生。具体步骤按照宝灵曼公司生产的凋亡试剂盒说明书进行。
1.6 存活曲线的制作：将处于指数生长期的3组细胞即CNE-2，CNE-2-vect，CNE-2-p16细胞分别以0，2，4，6，8，10Gy照射(6MV X射线，剂量率为3Gy/min)。每剂量组按一定比例的细胞数接种3个平皿，培养2～3周后得到各剂量组克隆形成数，计算细胞贴壁率并换算成细胞存活份数。按照多击单靶模型S=1-[1-exp(-D/D0)]N拟合存活曲线，并求出参数D0，Dq值等。
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1.7 统计学方法：对FCM检测的3组细胞增殖周期的改变进行组间差异的t检验。
2 结果
2.1 p16基因转染的CNE-2细胞生长情况：p16转染组形成克隆的时间长，2周后仅见小的克隆生长，其生长速度缓慢，5周始才形成较明显的克隆，而且细胞间隙增大；CNE-2-vect及CNE-2组2周时即可形成明显的克隆，提示前者的生长明显受到抑制。
2.2 外源性p16基因在CNE-2的表达情况：免疫组织化学检测结果显示CNE-2-p16细胞p16蛋白阳性，表明外源性p16基因已经整合入CNE-2细胞并表达，而CNE-2-vect组及对照组CNE-2细胞，p16的检测均阴性(见图1、图2)。
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图1 CNE-2-p16细胞p16蛋白免疫组化染色阳性结果，可见细胞核呈明显的黄褐色，同时胞浆也出现黄褐色，但明显弱于细胞核(×400)
图2 CNE-2,CNE-2-vect细胞p16蛋白免疫组化染色服用性结果，细胞核及细胞浆均呈蓝色(×200)
2.3 外源性p16基因对CNE-2细胞增殖周期的影响：将p16基因转染、G418筛选所获得的阳性克隆混合培养约1个月，达到所需要的细胞数量时，和对照组CNE-2-vect及CNE-2细胞在同一时间内按照相同数量级消化传代，24小时后3组细胞同步上机检测。FCM检测结果显示导入外源性p16基因可引起明显的G1期阻滞，同对照组细胞相比，前者G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少，经t检验显示组间差异有显著意义(P<0.05)，详见表1。
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表1 p16基因对CNE-2细胞增殖周期各时相的影响(%) 细胞系
G1/G0期
S期
G2/M期
CNE-2
34.63±1.47
37.20±0.61
28.17±2.08
CNE-2-vect
37.23±0.81
32.87±2.89
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29.90±2.15
CME-2-p16
54.57±3.31▲
21.80±1.48▲
23.67±2.46
注：▲：CNE-2-p16与CNE-2-vect,CNE-2相比，P<0.05
2.4 外源性p16基因对CNE-2细胞凋亡的影响：两种方法检测凋亡的结果均显示p16基因使CNE-2细胞凋亡明显增加(见表2)。
表2 3组细胞经两种方法检测的凋亡百分率(%) 细胞种类
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TUNEL法
均值
CNE-2
4.2
5.4
4.8
CNE-2-vect
9.0
9.4
9.2
CNE-2-p16
19.0
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22.0
20.5
细胞种类
细胞荧光染色法
TUNEL法
均值
CNE-2
4.2
5.4
4.8
CNE-2-vect
9.0
9.4
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9.2
CNE-2-p16
19.0
22.0
20.5
2.5 外源性p16基因对CNE-2细胞放射敏感性的影响：图3为3组细胞即CNE-2，CNE-2-vect，CNE-2-p16经多击单靶模型拟合后的存活曲线，表3为其相关参数。表3 3组细胞多击单靶模型拟合的相关参数 细胞种类
D0值(Gy)
Dq值(Gy)
N值
CNE-2
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0.97
2.48
12.78
CNE-2-vect
0.99
1.84
6.34
CNE-2-p16
0.86
0.54
1.89
, http://www.100md.com 图3 CNE-2，CNE-2-vect，CNE-2-p16细胞的存活曲线
由存活曲线可以看出CNE-2，CNE-2-vect均有一较明显的“肩宽”，而且在各个剂量点的存活份数都相近，D0值也相近(表3)，表明2个组细胞的放射敏感性相似。而CNE-2-p16细胞组的“肩宽”明显缩小变窄，且在各个剂量点的存活份数均明显低于CNE-2，CNE-2-vect细胞组，表明CNE-2-vect细胞的放射敏感性较其它2个组为高，其增敏比为3.41(Dq值比)，1.15(D0值比)。其不同增敏比求法反映了不同的增敏机制，D0值比反映了射线在造成相同生物效应时所需剂量比值(平均致死剂量的高低比较)，反映的是不同细胞对射线的敏感程度。Dq值比反映了细胞对射线亚致死性损伤修复能力高低的比较。本研究用多击单靶模型分析结果表明，p16抑癌基因导入CNE-2细胞后所增加的放射敏感性，是通过抑制亚致死损伤修复而实现的。
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3 讨论
目前的研究认为癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发病的分子机制。因此从基因水平上去替代、阻抑、控制和攻击细胞中有缺陷的或有害的基因，从而达到肿瘤治疗的目的，就成为现代医学和生物学中一个前沿研究领域。目前已进入临床I期试验的基因治疗，如野生性p53基因在晚期肺癌、头颈部鳞癌等部分肿瘤患者中的近期治疗效果令人鼓舞[7]。作为我国高发的恶性肿瘤NPC，在这方面的研究就显得较为落后。因为目前已肯定的抑癌基因中的Rb,p21等在NPC中完全正常，而在肿瘤的基因治疗中占举足轻重的p53抑癌基因在原发性NPC中的突变率也甚低，尽管免疫组化检测的突变性p53蛋白的阳性率较高(可达50%～80%)，但在基因水平上p53的突变率仅为6%左右。其原因可能是EB病毒与野生性p53蛋白结合而使其丧失活性所致[8-10]。因此，这些抑癌基因在NPC中的作用可能有限，试图利用这几个抑癌基因去探讨日后NPC的基因治疗可能不会有较大的突破。
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p16抑癌基因无论在原发性NPC中还是在NPC细胞系中，其蛋白水平和基因水平检测结果均显示，p16基因均有高频率的失活，而且其作用机制为直接抑制细胞周期，因而其在NPC中的作用就显得较其它抑癌基因更为重要[1，11]。目前的研究业已表明在NPC中由于突变、缺失、高甲基化而导致p16基因的低表达或不表达，其与肿瘤的发生、发展有着重要的关系。作者通过导入外源性p16基因的方法，使得p16基因的表达得以恢复，以便研究其在NPC生物学行为中的作用及对放射敏感性的影响。在实验中，为鉴定p16基因是否导入CNE-2细胞系中，作者采用免疫组织化学方法来鉴定经p16转染、G418筛选生长后的克隆细胞。其它实验是采用孙梅等[4]的方法，将所获得的细胞(包括鉴定的细胞)混合培养后进行FCM、凋亡检测及放射敏感性等研究。这样一方面保证了免疫组化鉴定的可靠性，另一方面又避免了由于反复传代引起的外源基因的丢失，并且不影响以下所进行实验的可靠性。
p16基因主要是通过G1期阻滞而发挥其作用的。本实验证实导入外源性p16基因的CNE-2细胞同对照组相比，其G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少。导入外源性p16基因明显地增加了凋亡的发生，无论是采用Hoeschst 33342还是TUNEL方法，均得出了相同的结果。同时，实验还发现p16基因具有放射增敏作用，有关这方面的研究尚未见报道。
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综上所述，研究结果再次证实了p16基因通过G1期阻滞而抑制肿瘤细胞的增殖能力，而且明确了p16基因可诱导肿瘤细胞凋亡的发生，首次发现了p16基因具有放射增敏作用。增敏的机制可能与p16基因引起的S期细胞比例下降、凋亡增加及对射线的亚致死性损伤修复能力的下降等有关。因此，它为进一步深入探讨NPC中p16基因的功能及临床基因治疗的可行性提供了新的试验依据。
志谢 衷心感谢董秀癑老师对放射增敏数据的计算机处理。
注释：基金项目：本课题部分受国家自然科学基金资助项目(39500043)
参考文献
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收稿：1999-05-18 修回：1999-08-05, 百拇医药