丙型肝炎病毒E1，E2/NS1，NS5蛋白基因在大肠杆菌内的表达及其产物的初步应用
作者：刘双虎 张铮 胡国龄 谭德明 任培上
单位：410008 长沙，湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所
关键词：肝炎病毒，丙型；基因表达
中华传染病杂志980102 【摘要】 目的 在体外表达及纯化HCV不同功能区的病毒蛋白，用于研究HCV各功能区抗体的临床意义。方法 将HCV E1，E2/NS1，NS5区的部分基因片段克隆到表达质粒PMAL-CRI中MBP编码基因的下游，在大肠杆菌中进行表达。结果 表达的融合蛋白MBP-E1，MBP-E2/NS1，MBP-NS5的分子量分别为57000、65000、62000，Western Blot分析表明这些融合蛋白具有HCV的抗原活性。将这三种融合蛋白纯化后作为抗原检测了丙型肝炎患者血清95份，其中抗-HCV E1阳性率为10.5%，抗-HCV E2/NS1为63.2%，抗-HCV NS5为53.7%。结论 本实验表达的HCV融合蛋白在HCV感染的血清学诊断中具有一定的价值。
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Expression of E1,E2/NS1,NS5 genes of hepatitis C virus in E.coli and preliminary use of the expressed proteins Liu Shuanghu, Zhang Zheng, Hu Guoling, et al. Department of Infectious Diseases, the Affiliated Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】 Objective In order to study the clinical significance of various antibodies against different regions of HCV genome, the proteins in different regions of HCV were expressed and purified in vitro. Methods Fragments of E1,E2/NS1 and NS5 of HCV genes were cloned into expression vector PMAL-CRI and the fusion proteins MBP-E1,MBP-E2/NS1 and MBP-NS5 were expressed in E.coli. Results The molecular weights of MBP-E1,MBP-E2/NS1 and MBP-NS5 were 57000,65000 and 62000 respectively. Western blot analysis showed these fusion proteins presented the specific HCV antigenicity and were used to detect 95 serum specimens of hepatitis C patients by ELISA after purification. The positive ratio of anti-HCV E1,anti-HCV E1/NS1 and anti-HCV NS5 were 10.5%,63.2% and 53.7% respectively. Conclusion These fusion proteins are useful in the serodiagnosis of HCV infection.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis C viruses Gene expression
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎的重要病原，其基因组为单股正链RNA，长约9400bp，编码的蛋白有核心蛋白，包膜蛋白(E1，E2/NS1)，非结构蛋白(NS2，NS3，NS4，NS5)。表达和纯化这些蛋白，可以用于研究HCV不同功能区抗体的临床意义。本实验利用基因重组技术在大肠杆菌中表达了部分E1，E2/NS1，NS5蛋白，并进行了纯化和应用于临床检验，对其临床意义进行了初步探讨。
材料和方法
一、标本来源
本实验室自1993年以来-20℃保存的丙型肝炎患者血清95份，诊断依据患者的输血史和临床表现，以及抗-HCV阳性(用上海科华实业公司提供的第二代抗-HCV试剂盒检测)和/或HCV RNA阳性(用华美生物工程公司提供的试剂检测)，其它肝炎病毒标志物为阴性。在本院血库取抗-HCV阴性的正常献血员血清80份，血清无菌分离后置-20℃保存。
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二、菌株和质粒
大肠杆菌JM109为本实验室保存菌种，表达质粒PMAL-CRI(New England Biolabs, USA)是表达含麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白载体，重组质粒PUC19-HCV-E1，PUC19-HCV-E2/NS1和PUC19-HCV-NS5分别含有HCV E1，E2/NS1，NS5区的部分基因，由本实验室克隆[1]。
三、表达克隆的构建与鉴定
质粒及HCV E1、E2/NS1、NS5基因片段的制备，纯化，限制性内切酶反应，DNA连接，质粒的转化及表达克隆的筛选均参照文献[2]进行。
四、融合蛋白的表达及Western Blot分析
挑取表达克隆接种于10ml LB培养基，37℃水浴摇床培养过夜后，转种于500ml LB培养基，37℃摇床培养到A550为0.6时加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，继续培养3小时。离心收集细菌，经样品处理液处理后，用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳，电转印到硝酸纤维膜上，2%小牛血清白蛋白封闭，抗-HCV阳性混合血清和酶标抗体先后温育，再加入显色剂显色。
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五、融合蛋白的纯化
离心收集的菌体经超声波破碎后，用Amyrose resin层析试剂盒(New England Biolabs,USA)对表达的融合蛋白进行亲和层析(按说明书进行)。
六、ELISA检测血清抗-HCV
按常规方法将纯化的三种融合蛋白分别以适当浓度包被于酶标板上，用含20%小牛血清的PBS封闭后置4℃保存，用间接ELISA测定标本中抗-HCV，以酶标仪测定A值。
结果
一、表达克隆的构建及鉴定
用限制性内切酶EcoRI,HindⅢ从重组质粒PUC19-HCV-E1，PUC19-HCV-E2/NS1，PUC19-HCV-NS5中分别切出HCV E1，E2/NS1和NS5基因片段，重组到PMAL-CRI质粒MBP表达基因的下游，转化入大肠杆菌JM109，经IPTG/Xgal平皿选择菌落和酶切分析后，确定HCV E1，E2/NS1，NS5的表达克隆，分别命名为：PMAL-E1/JM109(PE1/JM109)，PMAL-E2/NS1/JM109(PE2/NS1/JM109)PMAL-NS5/JM109(PNS5/JM109)，以大肠杆菌JM109及转化了PMAL-CRI空载质粒的大肠杆菌(PMAL/JM109)作为表达的对照菌株。
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二、融合蛋白的表达、纯化及Western Blot分析
HCV E1、E2/NS1及NS5基因克隆片段与表达质粒PMAL-CRI重组后进行表达，可分别产生MBP与E1(MBP-E1)，MBP与E2/NS1(MBP-E2/NS1)，MBP与NS5(MBP-NS5)蛋白的融合蛋白，PMAL/JM109只表达MBP。经SDS-PAGE证实(图1)，MBP分子量为46000，MBP-E1为57000，MBP-E2/NS1为65000，MBP-NS5为62000。Western Blot分析表明这三种融合蛋白均可与抗-HCV阳性血清起反应，形成明显的显色带，而与抗-HCV阴性血清无反应(图2)，单纯MBP与抗HCV阳性血清无反应。PNS5/JM109克隆除表达了62000蛋白外，还有一条可与抗-HCV阳性血清起反应的44000蛋白。经Amyrose resin亲和层析后，可去掉其它杂蛋白，得到纯化的融合蛋白(图1)。
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1：JM109，2：PMAL/JM109，3：蛋白质标准分子量(自上至下为94 000,67 000,40 000,30 000,18 000),4、6、8：纯化前的表达产物(4：PE1/JM109，6：PE2/NS1/JM109，8：PNS5/JM109)，5、7、9：纯化后的表达产物(5：PE1/JM109，7：PE2/NS1/JM109，9：PNS5/JM109)。图1 表达产物纯化前与纯化后的SDS-PAGE分析
1：标准蛋白分子量(同图1)，2、3、4、5：表达产物与抗-HCV阳性血清反应(2：PNS5/JM109，3：PE1/JM109，4：PE2/NS1/JM109，5：PMAL/JM109)，6、7、8：表达产物与抗-HCV阴性血清反应(6：PNS5/JM109，7：PE1/JM109，8：PE2/NS1/JM109)。图2 表达产物的Western Blot分析
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三、融合蛋白对血清标本ELISA检验
1.检测80份抗-HCV阴性的正常献血员血清，确定阳性临界值为+2s，其中抗-HCV E1的阳性临界值为0.364，抗-HCV E2/NS1为0.336，抗-HCV NS5为0.342。分别检测抗-HAV，抗-HBc，抗-HEV及类风湿因子阳性血清各5份，其A值均在阳性临界值以下，提示本方法特异性强。
2.检测95份已确诊为丙型肝炎患者的血清，其阳性率如下：抗-HCV E1为10.5%(10/95)，抗-HCV E2/NS1为63.2%(60/95)，抗-HCV NS5为53.7%(51/95)。
讨论
本实验利用基因重组技术在大肠杆菌内表达了HCV E1，E2/NS1及NS5与MBP的融合蛋白。经Western Blot证实，这三种融合蛋白可与抗-HCV阳性血清起反应，而与抗-HCV阴性血清无反应，单纯的MBP与抗-HCV阳性血清无反应，这些结果表明这三种融合蛋白具有HCV的抗原活性。利用Amyrose resin亲和层析技术，可使这三种融合蛋白得到纯化。因此，这三种既有HCV的抗原活性，又能得到纯化的融合蛋白，在HCV感染的血清学诊断中可能有一定的价值。
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表达MBP-NS5蛋白的克隆除表达了预期大小的62000蛋白带外，还有一条也可与抗-HCV阳性血清起反应的44000蛋白带，这条蛋白可能是62000蛋白的降解产物。影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的原因有很多，如无效翻译，过早终止和蛋白质不稳定等[2]。本实验出现的情况具体是那一种原因有待进一步研究。 本实验利用纯化后的三种融合蛋白建立了间接ELISA检测抗-HCV的方法，具有良好的特异性及敏感性，检测已确诊为丙型肝炎患者的血清95份，其检出率如下：抗-HCV E1为10.5%(10/95)，抗-HCV NS5为53.7%(51/95)，这两种结果与文献报道的一致[3，4]。其中抗-HCV NS5检出率较高，在HCV血清学诊断中可能有重要的价值。汪兴太等[5]发现有单独NS5区抗体阳性的丙肝患者，说明在抗-HCV诊断试剂盒中有必要加入NS5抗原以提高抗-HCV检出率。而抗-HCV E2/NS1达63.2%(60/95)，在HCV的诊断中也可能有一定作用，但本实验结果高于国外的文献报道[6]，其原因可能有(1)本实验所用的E2/NS1克隆基因片段未包括E2/NS1区5′端的高变区，所表达的蛋白质中可能包含有较稳定的共同抗原决定簇；(2)E2/NS1基因虽然变异性大，但在同一地区的个体间可能具有相对的稳定性，用同一地区克隆的E2/NS1基因表达的蛋白作为抗原检测同一地区的患者，其检出率可能偏高。本实验所克隆的E2/NS1基因来自湖南地区的HCV感染者[1]，检测的患者也全部是湖南地区的，这可能是本实验抗-HCV E2/NS1检出率相对较高的原因之一。
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本课题受湖南省科委研基金资助
参考文献
1 谭德明，胡国龄，有马晖胜，等.丙型肝炎病毒分子克隆和DNA序列分析.中华医学杂志，1993，73：332-334.
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Lab,1989.
3 Kohara M, Tsukiyama K, Maki N, et al. Expression and characterization of glycoprotein gp35 of hepatitis C virus using recombinant vaccinia virus. J Gen Virol,1992,73：2313-2318.
, http://www.100md.com
4 Saracco G, Abate ML, Baldi M, et al. Hepatitis C virus markers in patients with long-term biochemical and histological remission of chronic hepatitis. Liver,1994,14：65-70.
5 汪兴太，王佑春，孙德贵，等.初次及再次感染HCV后不同功能区抗体的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1994，14：69-72.
6 Spete RR, Alexander D, Rugroded MB, et al. Characterization of the hepatitis C virus E2/NS1 gene product expressed in mammalian cells. Virology,1992,188：819-830., 百拇医药
单位：410008 长沙，湖南医科大学附属湘雅医院传染病研究所
关键词：肝炎病毒，丙型；基因表达
中华传染病杂志980102 【摘要】 目的 在体外表达及纯化HCV不同功能区的病毒蛋白，用于研究HCV各功能区抗体的临床意义。方法 将HCV E1，E2/NS1，NS5区的部分基因片段克隆到表达质粒PMAL-CRI中MBP编码基因的下游，在大肠杆菌中进行表达。结果 表达的融合蛋白MBP-E1，MBP-E2/NS1，MBP-NS5的分子量分别为57000、65000、62000，Western Blot分析表明这些融合蛋白具有HCV的抗原活性。将这三种融合蛋白纯化后作为抗原检测了丙型肝炎患者血清95份，其中抗-HCV E1阳性率为10.5%，抗-HCV E2/NS1为63.2%，抗-HCV NS5为53.7%。结论 本实验表达的HCV融合蛋白在HCV感染的血清学诊断中具有一定的价值。
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Expression of E1,E2/NS1,NS5 genes of hepatitis C virus in E.coli and preliminary use of the expressed proteins Liu Shuanghu, Zhang Zheng, Hu Guoling, et al. Department of Infectious Diseases, the Affiliated Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】 Objective In order to study the clinical significance of various antibodies against different regions of HCV genome, the proteins in different regions of HCV were expressed and purified in vitro. Methods Fragments of E1,E2/NS1 and NS5 of HCV genes were cloned into expression vector PMAL-CRI and the fusion proteins MBP-E1,MBP-E2/NS1 and MBP-NS5 were expressed in E.coli. Results The molecular weights of MBP-E1,MBP-E2/NS1 and MBP-NS5 were 57000,65000 and 62000 respectively. Western blot analysis showed these fusion proteins presented the specific HCV antigenicity and were used to detect 95 serum specimens of hepatitis C patients by ELISA after purification. The positive ratio of anti-HCV E1,anti-HCV E1/NS1 and anti-HCV NS5 were 10.5%,63.2% and 53.7% respectively. Conclusion These fusion proteins are useful in the serodiagnosis of HCV infection.
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【Key words】 Hepatitis C viruses Gene expression
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎的重要病原，其基因组为单股正链RNA，长约9400bp，编码的蛋白有核心蛋白，包膜蛋白(E1，E2/NS1)，非结构蛋白(NS2，NS3，NS4，NS5)。表达和纯化这些蛋白，可以用于研究HCV不同功能区抗体的临床意义。本实验利用基因重组技术在大肠杆菌中表达了部分E1，E2/NS1，NS5蛋白，并进行了纯化和应用于临床检验，对其临床意义进行了初步探讨。
材料和方法
一、标本来源
本实验室自1993年以来-20℃保存的丙型肝炎患者血清95份，诊断依据患者的输血史和临床表现，以及抗-HCV阳性(用上海科华实业公司提供的第二代抗-HCV试剂盒检测)和/或HCV RNA阳性(用华美生物工程公司提供的试剂检测)，其它肝炎病毒标志物为阴性。在本院血库取抗-HCV阴性的正常献血员血清80份，血清无菌分离后置-20℃保存。
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二、菌株和质粒
大肠杆菌JM109为本实验室保存菌种，表达质粒PMAL-CRI(New England Biolabs, USA)是表达含麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白载体，重组质粒PUC19-HCV-E1，PUC19-HCV-E2/NS1和PUC19-HCV-NS5分别含有HCV E1，E2/NS1，NS5区的部分基因，由本实验室克隆[1]。
三、表达克隆的构建与鉴定
质粒及HCV E1、E2/NS1、NS5基因片段的制备，纯化，限制性内切酶反应，DNA连接，质粒的转化及表达克隆的筛选均参照文献[2]进行。
四、融合蛋白的表达及Western Blot分析
挑取表达克隆接种于10ml LB培养基，37℃水浴摇床培养过夜后，转种于500ml LB培养基，37℃摇床培养到A550为0.6时加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，继续培养3小时。离心收集细菌，经样品处理液处理后，用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳，电转印到硝酸纤维膜上，2%小牛血清白蛋白封闭，抗-HCV阳性混合血清和酶标抗体先后温育，再加入显色剂显色。
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五、融合蛋白的纯化
离心收集的菌体经超声波破碎后，用Amyrose resin层析试剂盒(New England Biolabs,USA)对表达的融合蛋白进行亲和层析(按说明书进行)。
六、ELISA检测血清抗-HCV
按常规方法将纯化的三种融合蛋白分别以适当浓度包被于酶标板上，用含20%小牛血清的PBS封闭后置4℃保存，用间接ELISA测定标本中抗-HCV，以酶标仪测定A值。
结果
一、表达克隆的构建及鉴定
用限制性内切酶EcoRI,HindⅢ从重组质粒PUC19-HCV-E1，PUC19-HCV-E2/NS1，PUC19-HCV-NS5中分别切出HCV E1，E2/NS1和NS5基因片段，重组到PMAL-CRI质粒MBP表达基因的下游，转化入大肠杆菌JM109，经IPTG/Xgal平皿选择菌落和酶切分析后，确定HCV E1，E2/NS1，NS5的表达克隆，分别命名为：PMAL-E1/JM109(PE1/JM109)，PMAL-E2/NS1/JM109(PE2/NS1/JM109)PMAL-NS5/JM109(PNS5/JM109)，以大肠杆菌JM109及转化了PMAL-CRI空载质粒的大肠杆菌(PMAL/JM109)作为表达的对照菌株。
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二、融合蛋白的表达、纯化及Western Blot分析
HCV E1、E2/NS1及NS5基因克隆片段与表达质粒PMAL-CRI重组后进行表达，可分别产生MBP与E1(MBP-E1)，MBP与E2/NS1(MBP-E2/NS1)，MBP与NS5(MBP-NS5)蛋白的融合蛋白，PMAL/JM109只表达MBP。经SDS-PAGE证实(图1)，MBP分子量为46000，MBP-E1为57000，MBP-E2/NS1为65000，MBP-NS5为62000。Western Blot分析表明这三种融合蛋白均可与抗-HCV阳性血清起反应，形成明显的显色带，而与抗-HCV阴性血清无反应(图2)，单纯MBP与抗HCV阳性血清无反应。PNS5/JM109克隆除表达了62000蛋白外，还有一条可与抗-HCV阳性血清起反应的44000蛋白。经Amyrose resin亲和层析后，可去掉其它杂蛋白，得到纯化的融合蛋白(图1)。
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1：JM109，2：PMAL/JM109，3：蛋白质标准分子量(自上至下为94 000,67 000,40 000,30 000,18 000),4、6、8：纯化前的表达产物(4：PE1/JM109，6：PE2/NS1/JM109，8：PNS5/JM109)，5、7、9：纯化后的表达产物(5：PE1/JM109，7：PE2/NS1/JM109，9：PNS5/JM109)。图1 表达产物纯化前与纯化后的SDS-PAGE分析
1：标准蛋白分子量(同图1)，2、3、4、5：表达产物与抗-HCV阳性血清反应(2：PNS5/JM109，3：PE1/JM109，4：PE2/NS1/JM109，5：PMAL/JM109)，6、7、8：表达产物与抗-HCV阴性血清反应(6：PNS5/JM109，7：PE1/JM109，8：PE2/NS1/JM109)。图2 表达产物的Western Blot分析
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三、融合蛋白对血清标本ELISA检验
1.检测80份抗-HCV阴性的正常献血员血清，确定阳性临界值为+2s，其中抗-HCV E1的阳性临界值为0.364，抗-HCV E2/NS1为0.336，抗-HCV NS5为0.342。分别检测抗-HAV，抗-HBc，抗-HEV及类风湿因子阳性血清各5份，其A值均在阳性临界值以下，提示本方法特异性强。
2.检测95份已确诊为丙型肝炎患者的血清，其阳性率如下：抗-HCV E1为10.5%(10/95)，抗-HCV E2/NS1为63.2%(60/95)，抗-HCV NS5为53.7%(51/95)。
讨论
本实验利用基因重组技术在大肠杆菌内表达了HCV E1，E2/NS1及NS5与MBP的融合蛋白。经Western Blot证实，这三种融合蛋白可与抗-HCV阳性血清起反应，而与抗-HCV阴性血清无反应，单纯的MBP与抗-HCV阳性血清无反应，这些结果表明这三种融合蛋白具有HCV的抗原活性。利用Amyrose resin亲和层析技术，可使这三种融合蛋白得到纯化。因此，这三种既有HCV的抗原活性，又能得到纯化的融合蛋白，在HCV感染的血清学诊断中可能有一定的价值。
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表达MBP-NS5蛋白的克隆除表达了预期大小的62000蛋白带外，还有一条也可与抗-HCV阳性血清起反应的44000蛋白带，这条蛋白可能是62000蛋白的降解产物。影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的原因有很多，如无效翻译，过早终止和蛋白质不稳定等[2]。本实验出现的情况具体是那一种原因有待进一步研究。 本实验利用纯化后的三种融合蛋白建立了间接ELISA检测抗-HCV的方法，具有良好的特异性及敏感性，检测已确诊为丙型肝炎患者的血清95份，其检出率如下：抗-HCV E1为10.5%(10/95)，抗-HCV NS5为53.7%(51/95)，这两种结果与文献报道的一致[3，4]。其中抗-HCV NS5检出率较高，在HCV血清学诊断中可能有重要的价值。汪兴太等[5]发现有单独NS5区抗体阳性的丙肝患者，说明在抗-HCV诊断试剂盒中有必要加入NS5抗原以提高抗-HCV检出率。而抗-HCV E2/NS1达63.2%(60/95)，在HCV的诊断中也可能有一定作用，但本实验结果高于国外的文献报道[6]，其原因可能有(1)本实验所用的E2/NS1克隆基因片段未包括E2/NS1区5′端的高变区，所表达的蛋白质中可能包含有较稳定的共同抗原决定簇；(2)E2/NS1基因虽然变异性大，但在同一地区的个体间可能具有相对的稳定性，用同一地区克隆的E2/NS1基因表达的蛋白作为抗原检测同一地区的患者，其检出率可能偏高。本实验所克隆的E2/NS1基因来自湖南地区的HCV感染者[1]，检测的患者也全部是湖南地区的，这可能是本实验抗-HCV E2/NS1检出率相对较高的原因之一。
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本课题受湖南省科委研基金资助
参考文献
1 谭德明，胡国龄，有马晖胜，等.丙型肝炎病毒分子克隆和DNA序列分析.中华医学杂志，1993，73：332-334.
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Lab,1989.
3 Kohara M, Tsukiyama K, Maki N, et al. Expression and characterization of glycoprotein gp35 of hepatitis C virus using recombinant vaccinia virus. J Gen Virol,1992,73：2313-2318.
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4 Saracco G, Abate ML, Baldi M, et al. Hepatitis C virus markers in patients with long-term biochemical and histological remission of chronic hepatitis. Liver,1994,14：65-70.
5 汪兴太，王佑春，孙德贵，等.初次及再次感染HCV后不同功能区抗体的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1994，14：69-72.
6 Spete RR, Alexander D, Rugroded MB, et al. Characterization of the hepatitis C virus E2/NS1 gene product expressed in mammalian cells. Virology,1992,188：819-830., 百拇医药