p42/p44MAPK和cyclin D1蛋白在霍奇金病中的表达及其相互关系
作者：黎岳南 郑晖 蒋海鹰 冯德云
单位：黎岳南(病理学教研室 长沙 410078)；郑晖(病理学教研室 长沙 410078)；蒋海鹰(病理学教研室 长沙 410078)；冯德云(病理学教研室 长沙 410078)
关键词：淋巴瘤；霍奇金病；信号转导*；癌基因蛋白；免疫组织化学
湖南医科大学学报000102 摘 要：利用SP免疫组织化学方法检测了40例不同类型霍奇金病(HD)RS/H细胞及13例反应性增生淋巴结(RH)的p42/p44MAPK和cyclin D1蛋白的表达。结果显示p42/p44MAPK及cyclin D1蛋白在HD之RS/H细胞中均呈过度表达(阳性率分别为72.5%和70%)，且两者阳性率呈明显的正相关(P<0.01)，提示MAPK级联信号转导在HD发生中起重要作用，并通过诱导cyclin D1蛋白高表达使RS/H细胞持续增殖及演进。
, 百拇医药
分类号：R733.1 文献标识码：A
文章编号：1000-5625(2000)01-0006-03
The expression of p42/p44MAPK and cyclin D1 protein and
their relationship in Hodgkin's disease
LI Yue-nan, ZHENG Hui, JIANG Hai-ying, FENG De-yun
(Department of Pathology, Hunan Medical University Changsha 410078)
Abstract：The expressions of p42/44 mitogen-activated protein kinase(p42/p44MAPK) and cyclin D1 protein were detected by SP immunohist ochemical technique in 40 cases of Hodgkkin's disease(HD) and 13 cases of reacti ve hyperplasia(RH). The results showed that p42/p44MAPK and cyclin D1 protein were both overexpressed in RS/H cells of HD(positive rates were 72.5% and 70% respectively), and their positive rates were positively correlated(P<0.01). The data suggest that MAPK cascades signal transduction may play an important role in genesis of HD. MAPK may induce overexpression of cyclin D1 protein and result in persistent proliferation and progression of RS/H cells.
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Key words：lymphoma;Hodgkin's disease;signal transduction*;oncogene protein;immunohistochemistry▲
丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase, MAPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，系细胞信号的重要转递者[1]。p 42/p44是MAPK的重要成员之一，其活化后转入细胞核，并通过转录调节引起多种癌基因及cy clin D1基因的相继激活导致细胞恶性转化[1]。近年p42/p44MAPK活化及过 度表达与肿瘤发生的关系已有报道[2～4]，但其在霍奇金病(Hodgkin's disease , HD)中的研究国内外尚未见文献报道。本研究利用免疫组织化学技术检测了不同亚型HD中R S/ H细胞p42/p44MAPK和cyclin D1蛋白的表达，以探讨其在HD发生发展中的作用及其与 预后的关系。
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1 材料与方法
1.1 材料 (1)标本：40例HD均系本校附属湘雅医院1992～1999年活检切除 标 本，男30例，女10例，平均年龄33.6(3～74)岁，平均病程10.3(1～48)月；病变部位均为 淋巴结，其中左颈部15例，右颈部13例，锁骨上4例，腋窝3例，腹股沟3例，颌下2例；所有 组织均经10% Formalin固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片；经病理确诊并按Rye分型标 准进行组织学分型，其中淋巴细胞为主型(LP)9例，结节硬化型(NS)6例，混合细胞型(MC)20 例，淋巴细胞消减型(LD)5例。所有患者术前均未做过放疗或化疗。另取13例滤泡型淋巴结 反应性增生病(RH)作对照。(2)试剂：抗p42/p44MAPK多克隆抗体由美国Biolab生物试 剂公司提供，SP试剂盒为美国New Mark公司产品；抗cyclin D1蛋白抗体购自福州迈新生物 技术开发公司。
1.2 方法
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1.2.1 免疫组织化学染色 切片常规脱蜡至水→3% H2O2阻断内源性过氧化物 酶10min→0.1M TBS洗2次，每次5min→高火档微波(0.1M TBS，pH8.0)修复抗原5mi n→阻断缓冲液处理1h，然后按SP法进行，DAB显色，苏木素衬染。
1.2.2 对照 用PBS替代一抗作阴性对照；分别用乳腺癌和肝癌组 织作MAPK和cyclind D1的阳性对照。
1.2.3 结果判断 p42/p44MAPK和cyclind D1蛋白染色结果采用Fro mowitz等[5]的综合计分法并稍加改进，将其分为4个等级(-，+，++，+++)。
1.3 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
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2.1 p42/p44MAPK和cyclind D1蛋白在HD各组织学亚型及RH中的表达 p42/p44MAPK在13例RH中淋巴细胞及发生发中心各阶段转化细胞均阴性，部分成纤 维细胞和血管内皮细胞核呈不同程度的阳性表达(图1)；cyclind D1蛋白在RH部分生发中心 仅见极少数散在阳性细胞，阳性信号为核型。p42/p44MAPK在40例HD中RS/H阳性表达 率为72.5%(29/40)，阳性信号主要为核型，少数为核浆型(图2)；H细胞的阳性强度明显于R S细胞。在HD不同亚型中其阳性表达强度从LP，NS，MC至LD依次增强(P<0.01，表1)。
图1 RH中血管内皮细胞及纤维母细胞p42/p 44MAPK呈阳性 SP法，×400
Fig. 1 Vessel endothelia and fibrobla st being positve for p42/p44MAPK in RH SP，×400
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图2 HD中RS/H细胞p42/p44MAPK呈阳性
SP法，×400Fig. 2 RS/H cells being positive for p42/ p44MAPK in HD SP，×400
40例HD中cyclind D1蛋白阳性表达率为70%(28/40)，阳性信号主要位于核内，少数细胞为核 浆型(图3)；H细胞的阳性强度明显高于RS细胞。且LP，NS，MC至LD不同HD亚型的阳性强度逐 渐增高(P<0.01，表1)。
图3 HD中RS/H细胞cyclind D1蛋白呈阳性 SP 法，×400
Fig. 3 RS/H cells being positive for cycl ind D1 protein in HD SP,×400
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表1 p42/p44MAPK和cyclind D1蛋 白在HD各组织学亚型及RH中的表达 组织学分型
例数
p42/p44MAPK
cyclind D1
-
+
++
+++
-
+
++
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RH
13
13
0
0
0
13
0
0
0
LP
9
5
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2
1
1
5
2
2
0
NS
6
2
2
2
0
2
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2
2
0
MC
20
4
5
7
4
5
7
7
1
LD
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5
0
0
3
2
0
3
1
1
χ2=32.4932，P<0.01；χ2=28.0444，P<0.01
2.2 HD中RS/H细胞p42/p44MAPK与cyclind D1蛋白阳性表达的相关性 29例p42/p44MAPK阳性的HD病例中，24例cyclind D1蛋白呈阳性表达，阳性符合 率 82.76%；11例p42/p44MAPK阴性病例中，7例cyclind D1蛋白阴性，阴性符合率63.6 4%，统计学分析表明p42/p44MAPK和cyclind D1蛋白的表达呈明显正相关(P<0.01 ，表2)。
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表2 HD中RS/H细胞p42/p44MAPK与 cyclind D1蛋白阳性表达的相关性 p42/p44MAPK
cyclind D1蛋白
-
+
-
7
4
+
5
24
χ2=8.1744，P<0.01
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3 讨 论
MAPK级联是细胞信号转导的重要途径，能将募集的多种细胞外信号(如生长因子、细胞因子 、肿瘤启动因子等)通过磷酸化活化逐级转递至细胞核，并激活多种核转录因子，如立早基 因C-fos,C-jun等，参与细胞生长、发育、分裂及分化等多种生理过程，并在细胞恶性转 化及演进中起重要作用[3，4]。RS/H细胞是霍奇金病中具有诊断意义的特征细胞 ，与HD组织学分型及预后密切相关，但目前对该细胞的性质及来源尚不清楚。本文结果显示 ：p42/p44MAPK在RS/H细胞核中定位明确，且在HD不同亚型LP，NS，MC和LD中的阳性 表达率及强度逐渐升高，提示MAPK活化及信号转导在HD之RS/H细胞发生及演进过程中起重要 作用。众所周知，HD的四种亚型中，LD和NS亚型RS/H细胞分化程度较MC和LD亚型者好，且前 两者的预后亦明显好于后两者[6]。本文结果与HD四种组织学亚型的临床病理特征 相符，故推断检测RS/H细胞活化的p42/p44MAPK可作为HD诊断及预后判断的辅助指标 之一。
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cyclind D1为细胞周期相关癌基因，它通过对Rb的灭活作用，促使细胞从G1期顺利进入S期 ，完成DNA复制。cyclind D1的过度表达可使细胞持续增殖并可能导致恶性转化[7] 。文献报道cyclind D1表达在多种恶性肿瘤中明显增高[8]，本文结果显示cycl ind D1在HD之RS/H细胞中的阳性表达率为70%，与文献报道基本一致。Lavoie[9] 及Ito[3]等发现MAPK磷酸化及转入细胞核是诱导cyclind D1癌基因表达的上游事 件。本资料显示p42/p44MAPK与cyclind D1蛋白在HD RS/H中的表达呈明显正相关( P<0.01)，表明活化的p42/p44MAPK可能通过诱导cyclind D1过度表达，从而促使RS /H细胞维持高增殖状态，并导致其恶性表型增高。
基金项目：卫生部资助项目(98-1-10)
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作者简介：黎岳南(1964-)，男，讲师
参考文献：
[1]Cowly S, Paterson H, Kemp P, et al. Activation of MA P kinase kinase is necessary and sufficient for PC12 differentiation and for tra nsformation of NIH 3T3 cells[J]. Cell, 1994,77:841-852.
[2]Salh B, Marotta A, Matthewson C, et al. Investigation of the Mek-MAP kinase-RSK pathway in human breast cancer[J]. Anticarncer Res, 1999,19:1B,73 1-740.
, 百拇医药
[3]Ito Y, Sasak Y, Horimoto M, et al. Activation of mitogen-activated p rotein kinase/extracellular signal-regulated kinase in human hepatocellular car cinoma[J]. Hepatol, 1998,27:951-958.
[4]Mandell JW, Hussaini IM, Zecevie M, et al. In situ visualization of i ntratumor growth factor signaling: immunohistochemical localization of activated ERK/MAP kinase in glial neoplasms[J]. Am J Pathol, 1998,153(5):1411-1423.
[5]Fromowitz FB, Violo MV, Chao S, et al. ras p21 expression in the prog ression of breast cancer[J]. Humnan Pathol, 1987,18(12):1268-1275.
, http://www.100md.com
[6]郝淼旺，黄致治，梁英锐，等.霍奇金病RS/H细胞凋亡及其与PCNA表达的关系[J ].临床与实验病理学杂志，1999，15(2)：132-134.
[7]Zhou P, Jiang W, Weghorst CM, et al. Overexpression of cyclin D1 enhe nces gene amplification[J]. Cancer Res, 1996,56:36-39.
[8]Dreyling MH, Bullinger L, Ott G, et al. Alterations of the cyclind D1 /p16-pRB pathway in mantle cell lymphoma[J]. Cancer Res, 1997,57:4608-14.
[9]Lavoie JN, Lallimin G, Brunet A, et al. Cyclind D1 expression is regu lated positively by the p42/p44MAPK and negatively by p38/HOGMAPK pa thway[J]. J Bio Chem, 1996,20608-20616.
收稿日期：1999-09-08, http://www.100md.com
单位：黎岳南(病理学教研室 长沙 410078)；郑晖(病理学教研室 长沙 410078)；蒋海鹰(病理学教研室 长沙 410078)；冯德云(病理学教研室 长沙 410078)
关键词：淋巴瘤；霍奇金病；信号转导*；癌基因蛋白；免疫组织化学
湖南医科大学学报000102 摘 要：利用SP免疫组织化学方法检测了40例不同类型霍奇金病(HD)RS/H细胞及13例反应性增生淋巴结(RH)的p42/p44MAPK和cyclin D1蛋白的表达。结果显示p42/p44MAPK及cyclin D1蛋白在HD之RS/H细胞中均呈过度表达(阳性率分别为72.5%和70%)，且两者阳性率呈明显的正相关(P<0.01)，提示MAPK级联信号转导在HD发生中起重要作用，并通过诱导cyclin D1蛋白高表达使RS/H细胞持续增殖及演进。
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分类号：R733.1 文献标识码：A
文章编号：1000-5625(2000)01-0006-03
The expression of p42/p44MAPK and cyclin D1 protein and
their relationship in Hodgkin's disease
LI Yue-nan, ZHENG Hui, JIANG Hai-ying, FENG De-yun
(Department of Pathology, Hunan Medical University Changsha 410078)
Abstract：The expressions of p42/44 mitogen-activated protein kinase(p42/p44MAPK) and cyclin D1 protein were detected by SP immunohist ochemical technique in 40 cases of Hodgkkin's disease(HD) and 13 cases of reacti ve hyperplasia(RH). The results showed that p42/p44MAPK and cyclin D1 protein were both overexpressed in RS/H cells of HD(positive rates were 72.5% and 70% respectively), and their positive rates were positively correlated(P<0.01). The data suggest that MAPK cascades signal transduction may play an important role in genesis of HD. MAPK may induce overexpression of cyclin D1 protein and result in persistent proliferation and progression of RS/H cells.
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Key words：lymphoma;Hodgkin's disease;signal transduction*;oncogene protein;immunohistochemistry▲
丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase, MAPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，系细胞信号的重要转递者[1]。p 42/p44是MAPK的重要成员之一，其活化后转入细胞核，并通过转录调节引起多种癌基因及cy clin D1基因的相继激活导致细胞恶性转化[1]。近年p42/p44MAPK活化及过 度表达与肿瘤发生的关系已有报道[2～4]，但其在霍奇金病(Hodgkin's disease , HD)中的研究国内外尚未见文献报道。本研究利用免疫组织化学技术检测了不同亚型HD中R S/ H细胞p42/p44MAPK和cyclin D1蛋白的表达，以探讨其在HD发生发展中的作用及其与 预后的关系。
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1 材料与方法
1.1 材料 (1)标本：40例HD均系本校附属湘雅医院1992～1999年活检切除 标 本，男30例，女10例，平均年龄33.6(3～74)岁，平均病程10.3(1～48)月；病变部位均为 淋巴结，其中左颈部15例，右颈部13例，锁骨上4例，腋窝3例，腹股沟3例，颌下2例；所有 组织均经10% Formalin固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片；经病理确诊并按Rye分型标 准进行组织学分型，其中淋巴细胞为主型(LP)9例，结节硬化型(NS)6例，混合细胞型(MC)20 例，淋巴细胞消减型(LD)5例。所有患者术前均未做过放疗或化疗。另取13例滤泡型淋巴结 反应性增生病(RH)作对照。(2)试剂：抗p42/p44MAPK多克隆抗体由美国Biolab生物试 剂公司提供，SP试剂盒为美国New Mark公司产品；抗cyclin D1蛋白抗体购自福州迈新生物 技术开发公司。
1.2 方法
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1.2.1 免疫组织化学染色 切片常规脱蜡至水→3% H2O2阻断内源性过氧化物 酶10min→0.1M TBS洗2次，每次5min→高火档微波(0.1M TBS，pH8.0)修复抗原5mi n→阻断缓冲液处理1h，然后按SP法进行，DAB显色，苏木素衬染。
1.2.2 对照 用PBS替代一抗作阴性对照；分别用乳腺癌和肝癌组 织作MAPK和cyclind D1的阳性对照。
1.2.3 结果判断 p42/p44MAPK和cyclind D1蛋白染色结果采用Fro mowitz等[5]的综合计分法并稍加改进，将其分为4个等级(-，+，++，+++)。
1.3 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
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2.1 p42/p44MAPK和cyclind D1蛋白在HD各组织学亚型及RH中的表达 p42/p44MAPK在13例RH中淋巴细胞及发生发中心各阶段转化细胞均阴性，部分成纤 维细胞和血管内皮细胞核呈不同程度的阳性表达(图1)；cyclind D1蛋白在RH部分生发中心 仅见极少数散在阳性细胞，阳性信号为核型。p42/p44MAPK在40例HD中RS/H阳性表达 率为72.5%(29/40)，阳性信号主要为核型，少数为核浆型(图2)；H细胞的阳性强度明显于R S细胞。在HD不同亚型中其阳性表达强度从LP，NS，MC至LD依次增强(P<0.01，表1)。
图1 RH中血管内皮细胞及纤维母细胞p42/p 44MAPK呈阳性 SP法，×400
Fig. 1 Vessel endothelia and fibrobla st being positve for p42/p44MAPK in RH SP，×400
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图2 HD中RS/H细胞p42/p44MAPK呈阳性
SP法，×400Fig. 2 RS/H cells being positive for p42/ p44MAPK in HD SP，×400
40例HD中cyclind D1蛋白阳性表达率为70%(28/40)，阳性信号主要位于核内，少数细胞为核 浆型(图3)；H细胞的阳性强度明显高于RS细胞。且LP，NS，MC至LD不同HD亚型的阳性强度逐 渐增高(P<0.01，表1)。
图3 HD中RS/H细胞cyclind D1蛋白呈阳性 SP 法，×400
Fig. 3 RS/H cells being positive for cycl ind D1 protein in HD SP,×400
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表1 p42/p44MAPK和cyclind D1蛋 白在HD各组织学亚型及RH中的表达 组织学分型
例数
p42/p44MAPK
cyclind D1
-
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+++
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RH
13
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0
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LP
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2
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LD
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3
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1
χ2=32.4932，P<0.01；χ2=28.0444，P<0.01
2.2 HD中RS/H细胞p42/p44MAPK与cyclind D1蛋白阳性表达的相关性 29例p42/p44MAPK阳性的HD病例中，24例cyclind D1蛋白呈阳性表达，阳性符合 率 82.76%；11例p42/p44MAPK阴性病例中，7例cyclind D1蛋白阴性，阴性符合率63.6 4%，统计学分析表明p42/p44MAPK和cyclind D1蛋白的表达呈明显正相关(P<0.01 ，表2)。
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表2 HD中RS/H细胞p42/p44MAPK与 cyclind D1蛋白阳性表达的相关性 p42/p44MAPK
cyclind D1蛋白
-
+
-
7
4
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5
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χ2=8.1744，P<0.01
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3 讨 论
MAPK级联是细胞信号转导的重要途径，能将募集的多种细胞外信号(如生长因子、细胞因子 、肿瘤启动因子等)通过磷酸化活化逐级转递至细胞核，并激活多种核转录因子，如立早基 因C-fos,C-jun等，参与细胞生长、发育、分裂及分化等多种生理过程，并在细胞恶性转 化及演进中起重要作用[3，4]。RS/H细胞是霍奇金病中具有诊断意义的特征细胞 ，与HD组织学分型及预后密切相关，但目前对该细胞的性质及来源尚不清楚。本文结果显示 ：p42/p44MAPK在RS/H细胞核中定位明确，且在HD不同亚型LP，NS，MC和LD中的阳性 表达率及强度逐渐升高，提示MAPK活化及信号转导在HD之RS/H细胞发生及演进过程中起重要 作用。众所周知，HD的四种亚型中，LD和NS亚型RS/H细胞分化程度较MC和LD亚型者好，且前 两者的预后亦明显好于后两者[6]。本文结果与HD四种组织学亚型的临床病理特征 相符，故推断检测RS/H细胞活化的p42/p44MAPK可作为HD诊断及预后判断的辅助指标 之一。
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cyclind D1为细胞周期相关癌基因，它通过对Rb的灭活作用，促使细胞从G1期顺利进入S期 ，完成DNA复制。cyclind D1的过度表达可使细胞持续增殖并可能导致恶性转化[7] 。文献报道cyclind D1表达在多种恶性肿瘤中明显增高[8]，本文结果显示cycl ind D1在HD之RS/H细胞中的阳性表达率为70%，与文献报道基本一致。Lavoie[9] 及Ito[3]等发现MAPK磷酸化及转入细胞核是诱导cyclind D1癌基因表达的上游事 件。本资料显示p42/p44MAPK与cyclind D1蛋白在HD RS/H中的表达呈明显正相关( P<0.01)，表明活化的p42/p44MAPK可能通过诱导cyclind D1过度表达，从而促使RS /H细胞维持高增殖状态，并导致其恶性表型增高。
基金项目：卫生部资助项目(98-1-10)
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作者简介：黎岳南(1964-)，男，讲师
参考文献：
[1]Cowly S, Paterson H, Kemp P, et al. Activation of MA P kinase kinase is necessary and sufficient for PC12 differentiation and for tra nsformation of NIH 3T3 cells[J]. Cell, 1994,77:841-852.
[2]Salh B, Marotta A, Matthewson C, et al. Investigation of the Mek-MAP kinase-RSK pathway in human breast cancer[J]. Anticarncer Res, 1999,19:1B,73 1-740.
, 百拇医药
[3]Ito Y, Sasak Y, Horimoto M, et al. Activation of mitogen-activated p rotein kinase/extracellular signal-regulated kinase in human hepatocellular car cinoma[J]. Hepatol, 1998,27:951-958.
[4]Mandell JW, Hussaini IM, Zecevie M, et al. In situ visualization of i ntratumor growth factor signaling: immunohistochemical localization of activated ERK/MAP kinase in glial neoplasms[J]. Am J Pathol, 1998,153(5):1411-1423.
[5]Fromowitz FB, Violo MV, Chao S, et al. ras p21 expression in the prog ression of breast cancer[J]. Humnan Pathol, 1987,18(12):1268-1275.
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[6]郝淼旺，黄致治，梁英锐，等.霍奇金病RS/H细胞凋亡及其与PCNA表达的关系[J ].临床与实验病理学杂志，1999，15(2)：132-134.
[7]Zhou P, Jiang W, Weghorst CM, et al. Overexpression of cyclin D1 enhe nces gene amplification[J]. Cancer Res, 1996,56:36-39.
[8]Dreyling MH, Bullinger L, Ott G, et al. Alterations of the cyclind D1 /p16-pRB pathway in mantle cell lymphoma[J]. Cancer Res, 1997,57:4608-14.
[9]Lavoie JN, Lallimin G, Brunet A, et al. Cyclind D1 expression is regu lated positively by the p42/p44MAPK and negatively by p38/HOGMAPK pa thway[J]. J Bio Chem, 1996,20608-20616.
收稿日期：1999-09-08, http://www.100md.com