IL-12的真核表达载体对乙肝基因疫苗的免疫佐剂效应
作者：杜德伟 周永兴 吴学勤 冯志华 姚志强
单位：第四军医大学唐都医院感染病防治中心西安 710038
关键词：IL-12；真核表达载体；基因疫苗；乙型肝炎表面抗原；佐；剂
中国现代医学杂志000701 目的：观察编码鼠IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导Balb/c小鼠 免疫应答的影响。方法：肌肉注射DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h51Cr释 放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性。结果：免疫8周后，注射pCR3.1组、注射pCR3.1-S组及共 注射IL-12真核表达载体的血清OD值分别为0.04±0.01、0.87±0.1及1.67±0.15。CTL细胞 杀 伤活性分别为(10.1±6.4)%、(50.5±6.4)%及(73.3±8.8)%，后两组与pCR3.1组比较均有显 著差异(P<0.001)，后两组比较亦有显著差异(P<0.05)。脾细胞悬液经抗CD4+ 单克隆抗体处理后分别为(48.3±5.9)%、(75.6±9.1)%，抗CD8+单克隆抗体处理后分别 为(10.6±1.4)%、(16.9±2.3)%。结论：IL-12的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免 疫应答，CTL细胞杀伤活性主要由CD8+执行。
, 百拇医药
分类号 R512.6
THE IMMUNUNE ADJUVANT EFFECT OF INTERLEUKIN 12 ENKARYOTIC
EXPRESSION PLASMID ON HEPATITIS B GENE VACCINE
Du Dewei, Zhou Yongxing, Wu Xueqin, et al.
(Center of Prevent and Treatment of Infectious Disease,Tang Du Hospit al, Fourth Military Medical University, Xi’an 710038)
[Abstract] Objective: To observe the immune responses to ge ne vaccines coding HB V surface antigen and interleukin 12 in Balb/c (H-2d ) mice. Methods: The immuni zation was performed by intramuscular injection in this experiment. Anti-HBs in serum was detected by ELISA. HBsAg specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) activ ity was measured by 51 Chromiun release assay. Results: 8wks aft er immunization, the serum OD value of mice who codeliviried IL-12 vaccine (1.67±0.15) is signi ficant higher (P<0.05) than that of mice who intramuscular injected HBV-S DNA va ccine (0.87±0.1) and these two values are significant higher than that of mice who injected pCR3.1 (P<0.001). CTLs activity of mice who codeliviried IL-12 vacc ine and injected HBV-S DNA vaccine only were (73.3±8.8)% and (50.5±6.4)% respe ctively (P<0.05). There are all significant different compared with that of inje cted pCR3.1 (P<0.001). CTLs activity were (75.6±9.1)% and (48.3±5.9)% respecti vely after adding anti-CD4+ monoclonal antibody in spleen cells. CTLs activity were (16.3±2.3)% and (10.6±1.4)% respectively after adding anti-CD8+ monoclon al antibody in spleen cells. Conclusions: The results showed tha t the DNA vaccin e of pCR3.1-S had strong antigenecity in cellular and humoral immunity which can be promoted by vector coding murine IL-12. CTLs activity were performed by CD8+ cells. DNA vaccine against HBV may be useful for both prophylactic and therape utic purposes.
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Key words: Interleukin 12; Eularyotic Expression; Vecter DNA Vac cine; Hepatitis B Surface; Antigen; Adjuvant
我们将HBV DNA疫苗(pCR3.1-S)与编码鼠IL-12的真核表达载体(pWRG3169,下简称IL-12)共同 免疫小鼠后，观察其对小鼠免疫应答的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
5～8周龄雌性Balb/c小鼠购自本校实验动物中心，体重15～20g。P815小鼠肥大细胞瘤细胞 系，含有HBV S抗原的真核表达质粒pCR3.1-S及编码鼠IL-12 p35、p40的真核表达载体pWRG3 169均由本室保存。脂质体(美国Gibco公司)、G418、RPMI-1640细胞培养基(美国Sigma公司) 、小牛血清(杭州四季青公司)、抗HBs ELISA检测试剂盒、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊 抗鼠IgG均购于华美西安公司，小鼠抗HBS、抗小鼠CD4+、CD8+单克隆抗体购于武汉 博士德公司。
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1.2 方法
1.2.1 质粒转染P815细胞及表达产物的检测
用碱裂解法大量提取质粒 ， 聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化后用于转染P815细胞及免疫小鼠。用脂质体转染技术将纯化后的p CR3.1-S质粒转染P815细胞，用含G418(350mg/L)细胞培养基筛选培养，当对照细胞大部分死 亡后换含G418(150mg/L)的细胞培养基筛选培养，大约2周后，间接免疫荧光检测转染细胞内 HBsAg的表达，全部阳性后，作为杀伤实验的靶细胞。
1.2.2 质粒免疫 24只小鼠随机分为4组，每组6只，0.5%布比卡因+1%对羟 基苯甲酸甲酯处理小鼠股四头肌，24h后同一部位注射质粒，1组注射100μg pCR3.1空载体 ，1组注射pCR3.1、pCR3.1-S各50μg,1组注射pCR3.1-S+IL-12各50μg，1次/2周，连续8周 。1组注射pCR3.1、pCR3.1-S各50μg1次。
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1.2.3 血清抗HBs检测 注射前剪尾采血40μl加入100μl生理盐水稍离心 取上清，-20℃保存，ELISA检测试剂盒测抗HBs，操作按说明书进行。
1.2.4 小鼠特异性CTLs杀伤功能测定 小鼠免疫8周后，引颈处死，无菌状 态下取小鼠脾脏，制成单细胞悬液，分别取脾细胞1×106，直接用4h51Cr释 放法测定CTLs杀伤效应；分别加入抗CD4+、抗CD8+单克隆抗体后测定CTLs杀伤效应。 效应细胞：靶细胞(E∶T)为100∶1、50∶1、25∶1。特异性CTLs杀伤(%)=[(实验组cpm值- 自然释放cpm值)/(最大释放cpm值-自然释放cpm值)]。
2 结果
2.1 IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导小鼠抗HBs的影响
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小鼠血清抗HBs随免疫次数增加而增加。IL-12的真核表达载体可以提高基因疫苗诱导小鼠 抗 HBs的产生，在任何时间点联合免疫与单纯HBV基因疫苗相比都具有显著差异，见附图。
附图 IL-12的真核表达载体对HBV基因疫苗诱导小鼠抗HBs的影响
2.2 小鼠脾细胞HBsAg特异性CTLs杀伤活性
pCR3.1-S免疫小鼠产生了很强的CTLs杀伤活性，IL-12的真核表达载体可以明显提高小鼠脾 细胞HBsAg特异性CTLs杀伤率(附表)。在E∶T为100∶1时，脾细胞经抗CD4+单克隆抗体处 理后CTLs杀伤率无明显变化：pCR3.1-S及共同免疫IL-12组分别为(48.3±5.9)%、(75.6±9 .1)%；经抗CD8+单克隆抗体处理后，分别为(10.6±1.4)%、(16.9±2.3)%，与对照 组相比具有显著性差异。
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附表 IL-12真核表达载体提高HBV基因疫苗诱导的小鼠CTLs率 (n=6,
±s) 组别
CTLs杀伤率(效应细胞：靶细胞E∶T)
100∶1
50∶1
25∶1
pCR3.1
20.5±3.0
11.1±2.1
8.2±1.5
pCR3.1-S1)
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50.5±6.4
40.2±4.8
32.6±3.4
pCR3.1-S+IL-121)2)
73.3±8.8
53.7±7.2
43.0±4.9
注：1)与pCR3.1比较P<0.001
2)与pCR3.1-S比较P<0.013 讨论
Davis等[1]用编码HBV S区基因的DNA疫苗免疫HBsAg转基因小鼠，发 现DNA疫苗可以使对HBsAg无应答的转基因小鼠产生免疫应答。Chow等[2]发现编码 不同的细胞因子的真核表达载体可以提高和调整机体对DNA疫苗的免疫应答。IL-12是一种重 要的抗病毒细胞因子，它独特的、最重要的生物学活性是具有调节Th1与Th2细胞之间的平衡 。 可以诱导内源性IFN-r的产生，而IFN-r可促进IL-12的产生，形成二者的正反馈途径，共同 调节细胞亚群分化，使CD4+向Th1分化，刺激细胞分化增殖，从而促进细胞免疫应答，证 明DNA疫苗具有预防作用及治疗作用。另外，IL-12能使小鼠体内的IgG2a、IgG2b及IgG3抗体 的产生增加10～100倍，此免疫球蛋白亚类与Th1活化有关[3]。
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本实验以含有HBV基因S区的DNA疫苗与编码IL-12的真核载体共同免疫小鼠，结果显示联合免 疫小鼠血清抗HBs在任何时间点均较单纯HBV基因疫苗免疫组明显增高，体外杀伤实验亦证实 DNA疫苗明显提高小鼠脾细胞的CTL杀伤率，IL-12的真核表达载体可以明显提高DNA疫苗诱导 的CTLs反应，与对照组相比具有显著性差异。表明IL-12真核表达载体具有明显的免疫佐剂 效应，可提高DNA疫苗诱导的免疫应答，IL-12的真核表达载体的免疫佐剂作用依赖于两种质 粒的共注射，分别注射两种质粒对免疫应答无影响，说明细胞因子与抗原注射同一部位对细 胞因子的佐剂作用至关重要[2]。用抗CD8+单克隆抗体处理效应细胞后CTLs的 杀伤效应明显降低，而抗CD4+单克隆抗体对CTLs的杀伤效应无明显影响。证明CTLs杀伤 作用主要由CD8+T淋巴细胞完成，与国外文献报道一致[4]。
HBV感染目前尚无理想的治疗措施，本研究证实了DNA疫苗的细胞及体液免疫原性以及细胞因 子对免疫应答的促进作用，为临床预防及治疗HBV感染提供了新思维。
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本研究受国家自然 科学基金资助(编号 39770665)
参 考 文 献
1，Davis HL,Brazolot Millan CL,Mancini M,et al.DNA-basd immunization agai nst hepatitis B surface antigen(HBsAg) in normal and HBsAg-transgentic mice.Vacc ine,1997;16(8):849～852
2，Chow YH,Chiang BL,LEE YL,et al.Development of Th1 and Th2 populations and th nature of Immune responses to hepatitis B virus vaccin can he modulated by codelivery of various cytokine genes.J immunol,1998;160:1320～1322
, http://www.100md.com
3，Germann-T,Bongartz-M,Dlugonska-H,et al.Interleukin-12 profoundly up-re gulates the synthesis of antigen-specific complement-fixing IgG2a,Ig2b and IgG3 antibody subclasses in vivo.Eur J Immunol,1995;25(3):823～829
4，Satio T,Sherman GJ,Kurohchi K,et al.Plasmid DNA-based immunization fo r hepatitis C virus structural proteins:immune responses in mice.Gastroenterolog y,1997;112:1321～1330, http://www.100md.com
单位：第四军医大学唐都医院感染病防治中心西安 710038
关键词：IL-12；真核表达载体；基因疫苗；乙型肝炎表面抗原；佐；剂
中国现代医学杂志000701 目的：观察编码鼠IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导Balb/c小鼠 免疫应答的影响。方法：肌肉注射DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h51Cr释 放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性。结果：免疫8周后，注射pCR3.1组、注射pCR3.1-S组及共 注射IL-12真核表达载体的血清OD值分别为0.04±0.01、0.87±0.1及1.67±0.15。CTL细胞 杀 伤活性分别为(10.1±6.4)%、(50.5±6.4)%及(73.3±8.8)%，后两组与pCR3.1组比较均有显 著差异(P<0.001)，后两组比较亦有显著差异(P<0.05)。脾细胞悬液经抗CD4+ 单克隆抗体处理后分别为(48.3±5.9)%、(75.6±9.1)%，抗CD8+单克隆抗体处理后分别 为(10.6±1.4)%、(16.9±2.3)%。结论：IL-12的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免 疫应答，CTL细胞杀伤活性主要由CD8+执行。
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分类号 R512.6
THE IMMUNUNE ADJUVANT EFFECT OF INTERLEUKIN 12 ENKARYOTIC
EXPRESSION PLASMID ON HEPATITIS B GENE VACCINE
Du Dewei, Zhou Yongxing, Wu Xueqin, et al.
(Center of Prevent and Treatment of Infectious Disease,Tang Du Hospit al, Fourth Military Medical University, Xi’an 710038)
[Abstract] Objective: To observe the immune responses to ge ne vaccines coding HB V surface antigen and interleukin 12 in Balb/c (H-2d ) mice. Methods: The immuni zation was performed by intramuscular injection in this experiment. Anti-HBs in serum was detected by ELISA. HBsAg specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) activ ity was measured by 51 Chromiun release assay. Results: 8wks aft er immunization, the serum OD value of mice who codeliviried IL-12 vaccine (1.67±0.15) is signi ficant higher (P<0.05) than that of mice who intramuscular injected HBV-S DNA va ccine (0.87±0.1) and these two values are significant higher than that of mice who injected pCR3.1 (P<0.001). CTLs activity of mice who codeliviried IL-12 vacc ine and injected HBV-S DNA vaccine only were (73.3±8.8)% and (50.5±6.4)% respe ctively (P<0.05). There are all significant different compared with that of inje cted pCR3.1 (P<0.001). CTLs activity were (75.6±9.1)% and (48.3±5.9)% respecti vely after adding anti-CD4+ monoclonal antibody in spleen cells. CTLs activity were (16.3±2.3)% and (10.6±1.4)% respectively after adding anti-CD8+ monoclon al antibody in spleen cells. Conclusions: The results showed tha t the DNA vaccin e of pCR3.1-S had strong antigenecity in cellular and humoral immunity which can be promoted by vector coding murine IL-12. CTLs activity were performed by CD8+ cells. DNA vaccine against HBV may be useful for both prophylactic and therape utic purposes.
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Key words: Interleukin 12; Eularyotic Expression; Vecter DNA Vac cine; Hepatitis B Surface; Antigen; Adjuvant
我们将HBV DNA疫苗(pCR3.1-S)与编码鼠IL-12的真核表达载体(pWRG3169,下简称IL-12)共同 免疫小鼠后，观察其对小鼠免疫应答的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
5～8周龄雌性Balb/c小鼠购自本校实验动物中心，体重15～20g。P815小鼠肥大细胞瘤细胞 系，含有HBV S抗原的真核表达质粒pCR3.1-S及编码鼠IL-12 p35、p40的真核表达载体pWRG3 169均由本室保存。脂质体(美国Gibco公司)、G418、RPMI-1640细胞培养基(美国Sigma公司) 、小牛血清(杭州四季青公司)、抗HBs ELISA检测试剂盒、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊 抗鼠IgG均购于华美西安公司，小鼠抗HBS、抗小鼠CD4+、CD8+单克隆抗体购于武汉 博士德公司。
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1.2 方法
1.2.1 质粒转染P815细胞及表达产物的检测
用碱裂解法大量提取质粒 ， 聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化后用于转染P815细胞及免疫小鼠。用脂质体转染技术将纯化后的p CR3.1-S质粒转染P815细胞，用含G418(350mg/L)细胞培养基筛选培养，当对照细胞大部分死 亡后换含G418(150mg/L)的细胞培养基筛选培养，大约2周后，间接免疫荧光检测转染细胞内 HBsAg的表达，全部阳性后，作为杀伤实验的靶细胞。
1.2.2 质粒免疫 24只小鼠随机分为4组，每组6只，0.5%布比卡因+1%对羟 基苯甲酸甲酯处理小鼠股四头肌，24h后同一部位注射质粒，1组注射100μg pCR3.1空载体 ，1组注射pCR3.1、pCR3.1-S各50μg,1组注射pCR3.1-S+IL-12各50μg，1次/2周，连续8周 。1组注射pCR3.1、pCR3.1-S各50μg1次。
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1.2.3 血清抗HBs检测 注射前剪尾采血40μl加入100μl生理盐水稍离心 取上清，-20℃保存，ELISA检测试剂盒测抗HBs，操作按说明书进行。
1.2.4 小鼠特异性CTLs杀伤功能测定 小鼠免疫8周后，引颈处死，无菌状 态下取小鼠脾脏，制成单细胞悬液，分别取脾细胞1×106，直接用4h51Cr释 放法测定CTLs杀伤效应；分别加入抗CD4+、抗CD8+单克隆抗体后测定CTLs杀伤效应。 效应细胞：靶细胞(E∶T)为100∶1、50∶1、25∶1。特异性CTLs杀伤(%)=[(实验组cpm值- 自然释放cpm值)/(最大释放cpm值-自然释放cpm值)]。
2 结果
2.1 IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导小鼠抗HBs的影响
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小鼠血清抗HBs随免疫次数增加而增加。IL-12的真核表达载体可以提高基因疫苗诱导小鼠 抗 HBs的产生，在任何时间点联合免疫与单纯HBV基因疫苗相比都具有显著差异，见附图。
附图 IL-12的真核表达载体对HBV基因疫苗诱导小鼠抗HBs的影响
2.2 小鼠脾细胞HBsAg特异性CTLs杀伤活性
pCR3.1-S免疫小鼠产生了很强的CTLs杀伤活性，IL-12的真核表达载体可以明显提高小鼠脾 细胞HBsAg特异性CTLs杀伤率(附表)。在E∶T为100∶1时，脾细胞经抗CD4+单克隆抗体处 理后CTLs杀伤率无明显变化：pCR3.1-S及共同免疫IL-12组分别为(48.3±5.9)%、(75.6±9 .1)%；经抗CD8+单克隆抗体处理后，分别为(10.6±1.4)%、(16.9±2.3)%，与对照 组相比具有显著性差异。
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附表 IL-12真核表达载体提高HBV基因疫苗诱导的小鼠CTLs率 (n=6,
±s) 组别CTLs杀伤率(效应细胞：靶细胞E∶T)
100∶1
50∶1
25∶1
pCR3.1
20.5±3.0
11.1±2.1
8.2±1.5
pCR3.1-S1)
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50.5±6.4
40.2±4.8
32.6±3.4
pCR3.1-S+IL-121)2)
73.3±8.8
53.7±7.2
43.0±4.9
注：1)与pCR3.1比较P<0.001
2)与pCR3.1-S比较P<0.013 讨论
Davis等[1]用编码HBV S区基因的DNA疫苗免疫HBsAg转基因小鼠，发 现DNA疫苗可以使对HBsAg无应答的转基因小鼠产生免疫应答。Chow等[2]发现编码 不同的细胞因子的真核表达载体可以提高和调整机体对DNA疫苗的免疫应答。IL-12是一种重 要的抗病毒细胞因子，它独特的、最重要的生物学活性是具有调节Th1与Th2细胞之间的平衡 。 可以诱导内源性IFN-r的产生，而IFN-r可促进IL-12的产生，形成二者的正反馈途径，共同 调节细胞亚群分化，使CD4+向Th1分化，刺激细胞分化增殖，从而促进细胞免疫应答，证 明DNA疫苗具有预防作用及治疗作用。另外，IL-12能使小鼠体内的IgG2a、IgG2b及IgG3抗体 的产生增加10～100倍，此免疫球蛋白亚类与Th1活化有关[3]。
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本实验以含有HBV基因S区的DNA疫苗与编码IL-12的真核载体共同免疫小鼠，结果显示联合免 疫小鼠血清抗HBs在任何时间点均较单纯HBV基因疫苗免疫组明显增高，体外杀伤实验亦证实 DNA疫苗明显提高小鼠脾细胞的CTL杀伤率，IL-12的真核表达载体可以明显提高DNA疫苗诱导 的CTLs反应，与对照组相比具有显著性差异。表明IL-12真核表达载体具有明显的免疫佐剂 效应，可提高DNA疫苗诱导的免疫应答，IL-12的真核表达载体的免疫佐剂作用依赖于两种质 粒的共注射，分别注射两种质粒对免疫应答无影响，说明细胞因子与抗原注射同一部位对细 胞因子的佐剂作用至关重要[2]。用抗CD8+单克隆抗体处理效应细胞后CTLs的 杀伤效应明显降低，而抗CD4+单克隆抗体对CTLs的杀伤效应无明显影响。证明CTLs杀伤 作用主要由CD8+T淋巴细胞完成，与国外文献报道一致[4]。
HBV感染目前尚无理想的治疗措施，本研究证实了DNA疫苗的细胞及体液免疫原性以及细胞因 子对免疫应答的促进作用，为临床预防及治疗HBV感染提供了新思维。
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本研究受国家自然 科学基金资助(编号 39770665)
参 考 文 献
1，Davis HL,Brazolot Millan CL,Mancini M,et al.DNA-basd immunization agai nst hepatitis B surface antigen(HBsAg) in normal and HBsAg-transgentic mice.Vacc ine,1997;16(8):849～852
2，Chow YH,Chiang BL,LEE YL,et al.Development of Th1 and Th2 populations and th nature of Immune responses to hepatitis B virus vaccin can he modulated by codelivery of various cytokine genes.J immunol,1998;160:1320～1322
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3，Germann-T,Bongartz-M,Dlugonska-H,et al.Interleukin-12 profoundly up-re gulates the synthesis of antigen-specific complement-fixing IgG2a,Ig2b and IgG3 antibody subclasses in vivo.Eur J Immunol,1995;25(3):823～829
4，Satio T,Sherman GJ,Kurohchi K,et al.Plasmid DNA-based immunization fo r hepatitis C virus structural proteins:immune responses in mice.Gastroenterolog y,1997;112:1321～1330, http://www.100md.com