新一代高效特异抗凝药物水蛭素
作者：李天全1 万昌秀2 李倚剑1
单位：1，2 (四川联大[西区] 应化系1、高材系2， 成都 610065)；3 (华西医科大学 生物医学工程研究室， 成都 610041)
关键词：水蛭素；抗凝剂；抗栓剂
生物医学工程学杂志980323
李天全1 万昌秀2 李倚剑1 综述 陈槐卿3 审校
内容摘要 概述了水蛭素的组成与结构，药理学及药代动力学特征，抗凝，抗血栓活性与作用，天然水蛭素提取和进行重组或人工合成水蛭素的方法，认为水蛭素是一种很有希望的防治血栓新药。
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A Novel High Quality Specific Antithrombotic
DrugHirudin
Li Tianquan1 Wan Changxiu2 Li Yijian1 Chen Huaiqing3
1,2 (Department of Chemistry and Department of Polymer Materials
Sichuan Union University, Chengdu 610065)
Abstract Hirudin is the most potent specific inhibitor of thrombin,which is currently undergoing clinical trials as a novel antithrombotic drug.In this paper,the composition and structure,the pharmacological and pharmacokinetic characteristics,the anticoagulant and antithrombotic activity and function,the methods of isolation,recombination and syntheses were reviewed.
, 百拇医药
Key words Hirudin Anticoagulant Antithrombotic agent
水蛭素是吸血医蛭唾液腺的一种分泌物质，是作用很强的凝血酶特性抑制剂，具有抗凝、抗血栓等药理作用。对多种高凝状态的疾病有良好的疗效，是国内外正在开发的新一代高效特异性抗凝、抗栓药物[1]。本文将对其组成与结构、药理学及药代学特征、抗凝抗栓活性以及制取方法等进行概述，为我国水蛭素的开发研究提供参考。
1 水蛭素的组成和结构[2～5]
从医蛭头部提取的水蛭素是一种单链环肽化合物。肽链由65个氨基酸残基组成，相对分子量为7000道尔顿。分子N端有三个二硫桥键(-S-S-)，分别在6位、14位、16位、28位和22位、39位的半胱氨酸残基(Cys6…Cys14，Cys16…Cys28，Cys32…Cys39)，使N端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。C端富含酸性氨基酸残基，63位的酪氨酸被硫酸化。水蛭素存在十种以上变异体，主要的三种简称为HV1、HV2和HV3。基氨基酸序列如下所示。HV1：
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VVYDTCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ
HV2：
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPNPESHNNGDFEEIPEEYLQ
HV3：
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPKPQSHNQGDFEEPIPEDAYDE
这些变异体肽链中都不含精氨酸、色氨酸和蛋氨酸。它们具有较高的同源性和基本相似的一级结构，其主要差别是N端氨基酸序列不同，但都具有相似的抗凝活性。核磁共振研究表明，水蛭素的变异体中不存在二级结构的α螺旋构型。N端的5个氨基酸残基为疏水基团，C端则为亲水基团，并游离在分子的表面。研究认为水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用，其N端的三个二硫桥键则是决定分子二级和三级结构及其稳定性的关键，将二硫键氧化，或分子发生蛋白降解，则失去抗凝活性。若C端羧基被酯化，或失去C端氨基酸，也会失去与凝血酶结合的能力。可见水蛭素的C端部分是抗凝活性所必需的，含二硫键N端疏水结构对水蛭素抗凝血酶作用亦有重要影响。
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2 水蛭素的抗凝活性及作用机制[6～9]
人类利用水蛭治病的历史可追溯到远古时代。最早的史料记载出现在公元前1500多年古埃及坟墓壁画上。到了18世纪末叶达到顶点，单法国巴黎医院1829～1836年间，大约就有500～600万人利用水蛭治病[10]。至今，在显微外科和整形外科中，仍在成功地应用。1884年Haycraft[11]发现医蛭提取物具有抗凝活性。1904年Jocoby首次分离出抗凝组分，并正式命名为水蛭素(hirudin)[12]，直到1955年Markwardt才从医蛭头部分离出水蛭素纯品，开始进行基础生化和药理学研究[13]。60年代完成了水蛭素的氨基酸序列分析，70年代确证了肽链的组成和一级结构。80年代完成了二级和三级结构的分析，并对药理学特性进行了广泛研究。1986年Harvey[14]分离出对水蛭素进行编码的纯系补体cDNA，从此可利用基因工程技术较大量制备重组水蛭素，使水蛭素的开发研究获得了迅速发展。
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现已知道，水蛭素是作用最强的凝血酶特异性抑制剂，它与凝血酶以等摩尔比形成非共价键紧密结合的稳定复合物，其解离常数K=2.3×10-14 mol/L，从而使凝血酶失去裂解纤维蛋白原为纤维蛋白的能力，并阻止纤维蛋白的凝固，阻止凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板反应，达到抗凝目的。
研究表明：水蛭素对凝血酶的作用是分两步进行的。最初的作用是凝血酶带正电荷的非催化位点部份，与水蛭素带相反电荷的极性C端部份产生静电作用，形成初始结合体， 是反应的决速步骤，其形成取决于离子强度。第二步，该结合体通过控制扩散，迅速重排形成同凝血酶活性位点紧密结合的复合物。在该复合物中，C端结合在凝血酶的纤维蛋白原识别位点，抑制凝血酶对纤维蛋白原的激活作用。被二硫桥键稳定的N端密集链段，则同凝血酶催化位点结合，抑制凝血酶的催化作用。靠近凝血酶催化位点附近的精氨酸侧链袋(Arg Side Chain Pocket)带负电荷的碱基，同水蛭素47位赖氨酸残基作用。由于Lys47被两侧的脯氨酸所包围，这一特殊三肽段Pro-Lys-Pro不被一般蛋白酶所降解，也很难在反应中断裂，其稳定性具有重要的生物学意义。
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3 药代动力学特征[15]
水蛭素的抗凝效力与其在血液中的浓度有关。经对鼠、家兔和狗的静脉注射发现，其消除速度很快，消除半减期为1 h左右。水蛭素迅速分布于细胞外的空间，经肾小球过滤，大约有相当于总剂70%～85%的水蛭素以活性组分形式排出。这表明水蛭素在体内不降解，在组织中无沉积。其动力学数据(表1)可用一级动力学方程的开放式二室模型进行拟合。人体实验结果与动物情况相似，静脉注射后血药浓度在二相模式中均迅速下降。(第一相为药物分布项即α相，第二相为消除相即β相)。r——水蛭素的半减期为1～2 h。皮下注射，8 h后浓度下降到最低水平。为了延长药代时间，可将水蛭素与生物大分子键合，例如，用不同双官能团交联剂可将水蛭素同葡聚糖或聚乙二醇等发生共价交联，形成活性共聚物，其半减期可延至7～9 h。
表1 水蛭素的药代动力学
Table 1 Pharmacokinetics of Hirudin Pharmacokinetics
, 百拇医药
Parameters
Dose(mg/kg)
Rat
Rabbit
Dog
Man
1.0
2.0
1.0
0.5
0.1
0.5
A(mg/ml)
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2.45
10.46
12.55
2.50
-
-
B(mg/ml)
0.82
1.50
1.43
0.30
-
-
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α(h-1)
4.75
8.25
0.52
2.77
-
-
β(h-1)
0.65
0.59
0.60
0.57
-
, 百拇医药
-
t(1/2)α(h)
0.15
0.08
0.11
0.25
0.15
0.2
t(1/2)β(h)
1.07
1.18
1.16
1.22
, 百拇医药
1.22
1.8
K12(h-1)
1.93
4.15
2.67
0.57
-
-
K21(h-1)
1.68
1.55
, 百拇医药 1.21
0.81
-
-
K10(h-1)
1.80
3.14
3.24
1.96
-
-
AUC(mg/ml.h)
1.64
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3.81
4.31
1.54
0.64
2.5
Vc(L/kg)
0.31
0.17
0.07
0.18
-
-
Vdss(L/kg)
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0.66
0.63
0.23
0.28
0.16
0.28
Cltot(ml/min)
3.05
2.09
12.38
183.0
58.2
130
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4 抗血栓作用[16～19]
诱导血管内血栓形成虽有多种因素，但凝血酶诱发的血液凝固是血栓形成的主要触发机理。凝血酶形成的主要作用是(1)使纤维蛋白凝固；(2)激活血小板产生血小板聚集；(3)产生更多的凝血酶。靶向凝血酶的药物，可防止血纤蛋白和血细胞结合形成血凝块。由于水蛭素能有效地抑制游离的和凝血块上的凝血酶，可防止各类血栓的形成及延伸。
目前，直接进行抗血栓形成的人体实验还有困难。一个变通的办法是模拟人体血栓形成机理，建立各种动物实验模型。对于不同的实验模型均证实了水蛭素具有良好的抗血栓形成作用。特别是对冠状血栓形成，弥漫性血管内凝血，冠状血管成形术(PTCA)后的再栓塞的防治效果显著。
冠状血栓是急性心梗的直接诱因，可造成大面积心肌透壁性坏死，通常采ICT或PTCA治疗。但手术或灌注后，由于形成血栓的粥样硬化斑尚存在，可再次发生血管狭窄和栓塞。Bucha等[20]用水蛭素预防冠状动脉血栓形成，Kaiser等[21]用水蛭素预防气囊导管扩张术后再栓塞，结果显示，水蛭素能有效溶解凝血酶所致的上述血栓，减小阻塞和心肌梗塞面积，促进再通。
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弥散性血管内凝血(DIC)为毛细血管内发生血小板聚集和纤维蛋白沉积，产生微循环障碍。水蛭素能抑制不同动物模型的DIC。临床上，以8 h为间隔，皮下注射0.1 mg/kg，患者血小板计数和纤维蛋白原的量可接近正常。
此外，水蛭素还能预防深层静脉血栓形成。经过随机抽样的1120名髋骨置换患者按0.3～1.0 mg/kg的剂量注射水蛭素，可有效降低血栓形成率。在体外循环中，水蛭素作为抗凝剂有特殊价值。Markwardt等用导管连接大鼠颈动脉和颈静脉，形成A-V分流模型。对照组旁路导管堵塞在3 min左右发生，而经水蛭素处理后，堵塞时间都得到延长，当剂量为40 μg/kg*min(相当于2.5±0.6 μg/ml血浆水平)没有观察到堵塞现象。
我们知道目前临床上主要用华法令(Warfarin、香豆素)、肝素、阿司匹林等抑制血小板聚集依赖性血栓。与上述药物相比，水蛭素抗栓效果最强，出血副作用最小，且无过敏反应和毒性反应，具有明显的优势。
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5 制备和纯化[22～25]
天然水蛭素产生于医蛭唾液腺，大多数制取方法是以水蛭头部为原料进行的，因为水蛭躯体中有较大量的结构与水蛭素类似，但无生物活性的“伪水蛭素”(pseudo-hirudin)组分存在，它们将增加水蛭素分离的困难。利用适当溶剂萃取水蛭头部碎片，即得水蛭素原始溶液。由于摘取水蛭头部费时、费力，有人又研究了从整体水蛭中制取粗水蛭素的方法。经比较，从头部得到的比活性最强，从整体得到的比活性只有从头部得到的1/3。由于受水蛭来源限制，这些方法均难以保证天然水蛭素的充分提供，长期以来其应用仅局限在某些实验性病例。1986年Harvey等从水蛭组织中分离出对水蛭素进行编码和复制的cDNA，并在大肠杆菌细胞中表达成功，在微升级助催化剂启动下，获得重组水蛭素r-HVZ，这一开创性工作引起了广泛的兴趣和重视，使水蛭素的制备获得突破性进展，成为基因工程和抗栓领域的一大热点。随后，重组水蛭素r-HV2-Lys47在α外激素(NFα1)助媒诱导下，在一种改良啤酒酵母中表达成功。变异体r-HV1在一种长为198个碱基对(base pair long)的GAPFL催化下，也在大肠杆菌和酵母中表达。其DNA是根据变异体HV1的结构人工合成的。经控制培养之后，r-HV1(CGP39393)可直接从大肠杆菌或酵母细胞培养基溶液中萃取获得。研究证明，从不同生物系统中获得的重组水蛭素与天然水蛭素的药理作用和生物活性基本相同。在结构上，除了缺乏Tyr-63位的硫酸基外，包括N端三个二硫桥键在内，重组水蛭素与天然水蛭素的组成和构型大致相同。仅有的差别是N端和Lys-47位氨基酸残基的顺序被交换。
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水蛭素的纯化，可按一般蛋白质的纯化方法进行。根据分子大小、溶解性、吸附性、所带电荷以及与配基特殊亲合力大小等特征，可用透析法、凝胶色谱法、离子交换色谱法、等电聚焦法和亲和层析法等。
随着水蛭素活性部位的构效分析进展，已确认水蛭素最小保持抗凝活性的片段为酸性C端的10～12个肽段。人们按照这一活性片段序列，合成小片段肽模拟水蛭素作用。这种人工合成肽段称为水蛭肽(Hirulog)。经对水蛭肽的测活实验证明，10肽开始具有抗凝活性，12肽是具有最大活性的最小肽段。Tyr-63的硫酸化可提高抗凝活性，The56、Glu57、Ile59是抗凝活性不可缺少的结构单元，它们在维持抗凝功能中起重要作用，若用其它氨基酸替代，其活性完全丧失。将合成的硫酸化的12肽(S-Hir 53～64)与未硫酸化的比较，发现部份凝血酶时间(αPTT)有较大增加，凝血酶时间(TT)增加4倍。将水蛭素N端催化位点8肽段同上述12肽结合形成的20肽相比较，其抗凝效力比12肽大100倍，比天然水蛭素大2倍。这一发现为合成出效能超过天然水蛭素的新一代抗凝剂开辟了可能的新途径。
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参 考 文 献
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3 Vindigni V,Filippis VD, Zanotti G et al.Probing the structure of hirudin from Hirudinaria Manillensis by limited proteolysis:isolation,characterization and thrombin-inhibitory properties of N-terminal fragments,Eur.J.Biochem 1994；226∶323
, 百拇医药
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18 Talley JD.Cardiology commentary and update:Hirudin,J.Arkansas Med.Society.1995;91∶445
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20 Bucha E,Nowak G,Markwardt F.Prevention of experimental coronary throbosis by hirudin.Folia Hacmatol,1988;115(1/2)∶52
21 Kaiser B,Simon A,Markwardt F.Antithrombotic effects of r-hirudin in experimental angioplasty and intravascular thrombolysis.Thromb.Haemost,1990;623(1)∶44
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(收稿：1997-03-27), http://www.100md.com(李天全1 万昌秀2 李倚剑1)
单位：1，2 (四川联大[西区] 应化系1、高材系2， 成都 610065)；3 (华西医科大学 生物医学工程研究室， 成都 610041)
关键词：水蛭素；抗凝剂；抗栓剂
生物医学工程学杂志980323
李天全1 万昌秀2 李倚剑1 综述 陈槐卿3 审校
内容摘要 概述了水蛭素的组成与结构，药理学及药代动力学特征，抗凝，抗血栓活性与作用，天然水蛭素提取和进行重组或人工合成水蛭素的方法，认为水蛭素是一种很有希望的防治血栓新药。
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DrugHirudin
Li Tianquan1 Wan Changxiu2 Li Yijian1 Chen Huaiqing3
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Sichuan Union University, Chengdu 610065)
Abstract Hirudin is the most potent specific inhibitor of thrombin,which is currently undergoing clinical trials as a novel antithrombotic drug.In this paper,the composition and structure,the pharmacological and pharmacokinetic characteristics,the anticoagulant and antithrombotic activity and function,the methods of isolation,recombination and syntheses were reviewed.
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Key words Hirudin Anticoagulant Antithrombotic agent
水蛭素是吸血医蛭唾液腺的一种分泌物质，是作用很强的凝血酶特性抑制剂，具有抗凝、抗血栓等药理作用。对多种高凝状态的疾病有良好的疗效，是国内外正在开发的新一代高效特异性抗凝、抗栓药物[1]。本文将对其组成与结构、药理学及药代学特征、抗凝抗栓活性以及制取方法等进行概述，为我国水蛭素的开发研究提供参考。
1 水蛭素的组成和结构[2～5]
从医蛭头部提取的水蛭素是一种单链环肽化合物。肽链由65个氨基酸残基组成，相对分子量为7000道尔顿。分子N端有三个二硫桥键(-S-S-)，分别在6位、14位、16位、28位和22位、39位的半胱氨酸残基(Cys6…Cys14，Cys16…Cys28，Cys32…Cys39)，使N端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。C端富含酸性氨基酸残基，63位的酪氨酸被硫酸化。水蛭素存在十种以上变异体，主要的三种简称为HV1、HV2和HV3。基氨基酸序列如下所示。HV1：
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VVYDTCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ
HV2：
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPNPESHNNGDFEEIPEEYLQ
HV3：
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPKPQSHNQGDFEEPIPEDAYDE
这些变异体肽链中都不含精氨酸、色氨酸和蛋氨酸。它们具有较高的同源性和基本相似的一级结构，其主要差别是N端氨基酸序列不同，但都具有相似的抗凝活性。核磁共振研究表明，水蛭素的变异体中不存在二级结构的α螺旋构型。N端的5个氨基酸残基为疏水基团，C端则为亲水基团，并游离在分子的表面。研究认为水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用，其N端的三个二硫桥键则是决定分子二级和三级结构及其稳定性的关键，将二硫键氧化，或分子发生蛋白降解，则失去抗凝活性。若C端羧基被酯化，或失去C端氨基酸，也会失去与凝血酶结合的能力。可见水蛭素的C端部分是抗凝活性所必需的，含二硫键N端疏水结构对水蛭素抗凝血酶作用亦有重要影响。
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2 水蛭素的抗凝活性及作用机制[6～9]
人类利用水蛭治病的历史可追溯到远古时代。最早的史料记载出现在公元前1500多年古埃及坟墓壁画上。到了18世纪末叶达到顶点，单法国巴黎医院1829～1836年间，大约就有500～600万人利用水蛭治病[10]。至今，在显微外科和整形外科中，仍在成功地应用。1884年Haycraft[11]发现医蛭提取物具有抗凝活性。1904年Jocoby首次分离出抗凝组分，并正式命名为水蛭素(hirudin)[12]，直到1955年Markwardt才从医蛭头部分离出水蛭素纯品，开始进行基础生化和药理学研究[13]。60年代完成了水蛭素的氨基酸序列分析，70年代确证了肽链的组成和一级结构。80年代完成了二级和三级结构的分析，并对药理学特性进行了广泛研究。1986年Harvey[14]分离出对水蛭素进行编码的纯系补体cDNA，从此可利用基因工程技术较大量制备重组水蛭素，使水蛭素的开发研究获得了迅速发展。
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现已知道，水蛭素是作用最强的凝血酶特异性抑制剂，它与凝血酶以等摩尔比形成非共价键紧密结合的稳定复合物，其解离常数K=2.3×10-14 mol/L，从而使凝血酶失去裂解纤维蛋白原为纤维蛋白的能力，并阻止纤维蛋白的凝固，阻止凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板反应，达到抗凝目的。
研究表明：水蛭素对凝血酶的作用是分两步进行的。最初的作用是凝血酶带正电荷的非催化位点部份，与水蛭素带相反电荷的极性C端部份产生静电作用，形成初始结合体， 是反应的决速步骤，其形成取决于离子强度。第二步，该结合体通过控制扩散，迅速重排形成同凝血酶活性位点紧密结合的复合物。在该复合物中，C端结合在凝血酶的纤维蛋白原识别位点，抑制凝血酶对纤维蛋白原的激活作用。被二硫桥键稳定的N端密集链段，则同凝血酶催化位点结合，抑制凝血酶的催化作用。靠近凝血酶催化位点附近的精氨酸侧链袋(Arg Side Chain Pocket)带负电荷的碱基，同水蛭素47位赖氨酸残基作用。由于Lys47被两侧的脯氨酸所包围，这一特殊三肽段Pro-Lys-Pro不被一般蛋白酶所降解，也很难在反应中断裂，其稳定性具有重要的生物学意义。
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3 药代动力学特征[15]
水蛭素的抗凝效力与其在血液中的浓度有关。经对鼠、家兔和狗的静脉注射发现，其消除速度很快，消除半减期为1 h左右。水蛭素迅速分布于细胞外的空间，经肾小球过滤，大约有相当于总剂70%～85%的水蛭素以活性组分形式排出。这表明水蛭素在体内不降解，在组织中无沉积。其动力学数据(表1)可用一级动力学方程的开放式二室模型进行拟合。人体实验结果与动物情况相似，静脉注射后血药浓度在二相模式中均迅速下降。(第一相为药物分布项即α相，第二相为消除相即β相)。r——水蛭素的半减期为1～2 h。皮下注射，8 h后浓度下降到最低水平。为了延长药代时间，可将水蛭素与生物大分子键合，例如，用不同双官能团交联剂可将水蛭素同葡聚糖或聚乙二醇等发生共价交联，形成活性共聚物，其半减期可延至7～9 h。
表1 水蛭素的药代动力学
Table 1 Pharmacokinetics of Hirudin Pharmacokinetics
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Parameters
Dose(mg/kg)
Rat
Rabbit
Dog
Man
1.0
2.0
1.0
0.5
0.1
0.5
A(mg/ml)
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2.45
10.46
12.55
2.50
-
-
B(mg/ml)
0.82
1.50
1.43
0.30
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α(h-1)
4.75
8.25
0.52
2.77
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β(h-1)
0.65
0.59
0.60
0.57
-
, 百拇医药
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t(1/2)α(h)
0.15
0.08
0.11
0.25
0.15
0.2
t(1/2)β(h)
1.07
1.18
1.16
1.22
, 百拇医药
1.22
1.8
K12(h-1)
1.93
4.15
2.67
0.57
-
-
K21(h-1)
1.68
1.55
, 百拇医药 1.21
0.81
-
-
K10(h-1)
1.80
3.14
3.24
1.96
-
-
AUC(mg/ml.h)
1.64
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3.81
4.31
1.54
0.64
2.5
Vc(L/kg)
0.31
0.17
0.07
0.18
-
-
Vdss(L/kg)
, 百拇医药
0.66
0.63
0.23
0.28
0.16
0.28
Cltot(ml/min)
3.05
2.09
12.38
183.0
58.2
130
, 百拇医药
4 抗血栓作用[16～19]
诱导血管内血栓形成虽有多种因素，但凝血酶诱发的血液凝固是血栓形成的主要触发机理。凝血酶形成的主要作用是(1)使纤维蛋白凝固；(2)激活血小板产生血小板聚集；(3)产生更多的凝血酶。靶向凝血酶的药物，可防止血纤蛋白和血细胞结合形成血凝块。由于水蛭素能有效地抑制游离的和凝血块上的凝血酶，可防止各类血栓的形成及延伸。
目前，直接进行抗血栓形成的人体实验还有困难。一个变通的办法是模拟人体血栓形成机理，建立各种动物实验模型。对于不同的实验模型均证实了水蛭素具有良好的抗血栓形成作用。特别是对冠状血栓形成，弥漫性血管内凝血，冠状血管成形术(PTCA)后的再栓塞的防治效果显著。
冠状血栓是急性心梗的直接诱因，可造成大面积心肌透壁性坏死，通常采ICT或PTCA治疗。但手术或灌注后，由于形成血栓的粥样硬化斑尚存在，可再次发生血管狭窄和栓塞。Bucha等[20]用水蛭素预防冠状动脉血栓形成，Kaiser等[21]用水蛭素预防气囊导管扩张术后再栓塞，结果显示，水蛭素能有效溶解凝血酶所致的上述血栓，减小阻塞和心肌梗塞面积，促进再通。
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弥散性血管内凝血(DIC)为毛细血管内发生血小板聚集和纤维蛋白沉积，产生微循环障碍。水蛭素能抑制不同动物模型的DIC。临床上，以8 h为间隔，皮下注射0.1 mg/kg，患者血小板计数和纤维蛋白原的量可接近正常。
此外，水蛭素还能预防深层静脉血栓形成。经过随机抽样的1120名髋骨置换患者按0.3～1.0 mg/kg的剂量注射水蛭素，可有效降低血栓形成率。在体外循环中，水蛭素作为抗凝剂有特殊价值。Markwardt等用导管连接大鼠颈动脉和颈静脉，形成A-V分流模型。对照组旁路导管堵塞在3 min左右发生，而经水蛭素处理后，堵塞时间都得到延长，当剂量为40 μg/kg*min(相当于2.5±0.6 μg/ml血浆水平)没有观察到堵塞现象。
我们知道目前临床上主要用华法令(Warfarin、香豆素)、肝素、阿司匹林等抑制血小板聚集依赖性血栓。与上述药物相比，水蛭素抗栓效果最强，出血副作用最小，且无过敏反应和毒性反应，具有明显的优势。
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5 制备和纯化[22～25]
天然水蛭素产生于医蛭唾液腺，大多数制取方法是以水蛭头部为原料进行的，因为水蛭躯体中有较大量的结构与水蛭素类似，但无生物活性的“伪水蛭素”(pseudo-hirudin)组分存在，它们将增加水蛭素分离的困难。利用适当溶剂萃取水蛭头部碎片，即得水蛭素原始溶液。由于摘取水蛭头部费时、费力，有人又研究了从整体水蛭中制取粗水蛭素的方法。经比较，从头部得到的比活性最强，从整体得到的比活性只有从头部得到的1/3。由于受水蛭来源限制，这些方法均难以保证天然水蛭素的充分提供，长期以来其应用仅局限在某些实验性病例。1986年Harvey等从水蛭组织中分离出对水蛭素进行编码和复制的cDNA，并在大肠杆菌细胞中表达成功，在微升级助催化剂启动下，获得重组水蛭素r-HVZ，这一开创性工作引起了广泛的兴趣和重视，使水蛭素的制备获得突破性进展，成为基因工程和抗栓领域的一大热点。随后，重组水蛭素r-HV2-Lys47在α外激素(NFα1)助媒诱导下，在一种改良啤酒酵母中表达成功。变异体r-HV1在一种长为198个碱基对(base pair long)的GAPFL催化下，也在大肠杆菌和酵母中表达。其DNA是根据变异体HV1的结构人工合成的。经控制培养之后，r-HV1(CGP39393)可直接从大肠杆菌或酵母细胞培养基溶液中萃取获得。研究证明，从不同生物系统中获得的重组水蛭素与天然水蛭素的药理作用和生物活性基本相同。在结构上，除了缺乏Tyr-63位的硫酸基外，包括N端三个二硫桥键在内，重组水蛭素与天然水蛭素的组成和构型大致相同。仅有的差别是N端和Lys-47位氨基酸残基的顺序被交换。
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水蛭素的纯化，可按一般蛋白质的纯化方法进行。根据分子大小、溶解性、吸附性、所带电荷以及与配基特殊亲合力大小等特征，可用透析法、凝胶色谱法、离子交换色谱法、等电聚焦法和亲和层析法等。
随着水蛭素活性部位的构效分析进展，已确认水蛭素最小保持抗凝活性的片段为酸性C端的10～12个肽段。人们按照这一活性片段序列，合成小片段肽模拟水蛭素作用。这种人工合成肽段称为水蛭肽(Hirulog)。经对水蛭肽的测活实验证明，10肽开始具有抗凝活性，12肽是具有最大活性的最小肽段。Tyr-63的硫酸化可提高抗凝活性，The56、Glu57、Ile59是抗凝活性不可缺少的结构单元，它们在维持抗凝功能中起重要作用，若用其它氨基酸替代，其活性完全丧失。将合成的硫酸化的12肽(S-Hir 53～64)与未硫酸化的比较，发现部份凝血酶时间(αPTT)有较大增加，凝血酶时间(TT)增加4倍。将水蛭素N端催化位点8肽段同上述12肽结合形成的20肽相比较，其抗凝效力比12肽大100倍，比天然水蛭素大2倍。这一发现为合成出效能超过天然水蛭素的新一代抗凝剂开辟了可能的新途径。
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(收稿：1997-03-27), http://www.100md.com(李天全1 万昌秀2 李倚剑1)