胶原止血海绵的结构与理化性能分析
作者：关 静 叶 萍 武继民
单位：关 静 叶 萍 武继民(军事医学科学院 卫生装备研究所，天津 300161)
关键词：胶原止血海绵；结构分析；理化性能
生物医学工程学杂志990103 内容摘要 对从牛腱中制备的胶原止血海绵进行了结构分析，结果表明所制备的止血海绵具有胶原蛋白的特征结构与组成，是纯度较高的胶原蛋白；理化性能测试表明胶原止血海绵质量稳定，从而证明了胶原止血海绵的制备工艺合理可靠。
Analyses on Structural and Physicochemical Properties
of Collagen Hemostatic Sponge
Guan Jing Ye Ping Wu Jimin
, 百拇医药
(Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161)
Abstract The ultraviolet spectrum and aminoacid content of collagen hemostatic sponge prepared from bovine tendon were analyzed, and the struture and composition of collagen spoge were confirmed. Physicochemical properties measurements showed that collagen hemostatic sponge had excellently stable quality. It was concluded that the techonology for preparing collagen hemostatic sponge was reasonable and reliable.
, 百拇医药
Key words Collagen hemostatic collagen Structrue analysis Physicochemical properties
胶原不仅能诱导血小板附着，产生释放反应，而且能激活血液凝固因子，粘着在渗血的伤口上，对损伤的血管起填塞作用。与藻酸钙、藻酸海绵、凝血增强纤维泡沫、增凝明胶海绵、氧化纤维素等常用止血剂相比，胶原止血率高，副作用小，是一种理想的止血材料[1]。
国外对胶原止血材料的研究十分活跃，已有粉状及片状的微晶胶原止血剂[2]、纤维织物止血剂[3]和海绵止血剂[4]。欧洲科研大药厂生产的Gelfix(解尔费思)是一种取自牛跟腱的无过敏性、无菌异种冻干胶原，自1994年起进入中国市场，在止血与创面修复治疗中效果显著，但价格昂贵，规格单一。国内对胶原止血材料的研究还处于起步阶段，目前尚无有关胶原止血材料的资料报道。我所近年来开展了胶原止血海绵的研制工作，生物相容性试验表明，胶原止血海绵是一种安全可靠的生物材料，动物止血效果初步试验表明，胶原止血海绵止血时间短，粘附创面能力优异，止血效果不低于Gelfix和明胶海绵。本文对胶原止血海绵的结构及理化性能作了初步研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂
醋酸洗必泰：锦州制造一厂；胃蛋白酶：苏州东吴生物制品厂；乙酸：天津化学试剂一厂；氯化钠：天津市塘沽化学试剂厂。
1.2 胶原止血海绵的制备
采取酶解法制备胶原止血海绵：将牛腱切碎，用醋酸洗必泰消毒，经蒸水清洗除净醋酸洗必泰后，粉碎，加入适量的胃蛋白酶和乙酸溶液，室温放置数天，间歇搅拌，离心除去不溶物，加入氯化钠溶液，沉淀物在蒸馏水中透析至除净氯化钠为止，加入适量乙酸溶解，再将此溶液冷冻干燥制成胶原止血海绵。
1.3 胶原止血海绵的结构分析
1.3.1 胶原止血海绵的紫外光谱分析 配制1%胶原止血海绵的乙酸溶液，用岛津UV-160A紫外可见分光光度计检测溶液的紫外光谱。
, http://www.100md.com
1.3.2 胶原止血海绵的氨基酸分析 用酸碱水解法处理胶原海绵样品，在日立835-50氨基酸自动分析仪上测定其氨基酸组成。
1.3.3 胶原止血海绵的电泳分析 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对胶原止血海绵、明胶标准品同时进行电泳，用CS-900型扫描仪自动检测电泳胶片，确定胶原止血海绵各组份的分子量及其含量。
1.4 胶原止血海绵的物理性能测试
1.4.1 胶原止血海绵的体密度 取1cm×1cm×0.5cm的长方体胶原止血海绵样品，精密测量样品的长度、宽度、高度，计算出样品体积，准确称量，计算出样品的体密度。
1.4.2 胶原止血海绵的含水量 于105℃烘坩埚至恒重(w1)，取0.1～0.3 g胶原止血海绵样品置于坩埚内，称重(w2)，再于105℃烘坩埚至恒重(w3)。样品的含水量为：[(w2-w3)/(w2-w1)]×100%。
, 百拇医药
1.5 胶原止血海绵的化学性能
1.5.1 胶原止血海绵的消化性能 参照一九九五年版美国药典《USP23 NF18》有关“可吸收性明胶海绵”项下的“消化性”试验方法，测定胶原止血海绵在胃蛋白酶作用下的消化时间，并对消化液进行紫外光谱分析。
1.5.2 胶原止血海绵的炽灼残渣含量 参照一九九五年版《中华人民共和国药典》二部附录Ⅷ N进行。
2 结果与讨论
2.1 胶原止血海绵的结构组成
对连续三批胶原止血海绵样品进行紫外光谱分析(图略)，其吸收峰均在225 nm处(图略)，这与资料报道的胶原蛋白的特征吸收峰位置相符[5]，可见酶解法制备的止血海绵是胶原蛋白。
, 百拇医药 表1列出了连续三批胶原止血海绵样品的氨基酸组成。其中甘氨酸的含量分别为36.31%、36.43%、36.63%，脯氨酸的含量分别为14.52%、14.41%、14.25%，羟脯氨酸的含量分别为3.76%、3.89%、3.86%，可见甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸的含量均很稳定，而且符合胶原蛋白氨基酸组成的特征，即约有1/3为甘氨酸，15%～30%为脯氨酸和羟脯氨酸。这不仅说明胶原止血海绵制备工艺较稳定，而且也说明酶解法制备的胶原止血海绵的纯度较高。
表1 胶原止血海绵的氨基酸含量*
Table 1 The aminoacid content of collagen hemostatic sponge* Aminoacid
Sample
1
, 百拇医药
2
3
ASP
4.68
4.61
4.60
THR
1.82
1.78
1.78
SER
3.70
3.71
, 百拇医药
3.63
GLU
8.53
8.65
8.42
GLY
36.31
36.43
36.63
ALA
9.74
10.22
10.19
, http://www.100md.com
ALA
0.11
0.11
0.11
VAL
2.12
1.98
2.12
MET
0.56
0.57
0.65
ILE
, http://www.100md.com
1.30
1.17
1.25
IEU
2.98
2.93
2.91
TYR
0.22
0.20
0.25
PHE
1.33
, 百拇医药
1.35
1.33
LYS
2.36
2.34
2.47
HIS
0.60
0.56
0.54
ARG
5.25
5.10
, http://www.100md.com
5.01
PRO
14.52
14.41
14.25
HYPRO
3.76
3.89
3.86
*The aminoacid content in Table 1 refers to the number of each assigned aminoacid residue in 100 aminoacid residues
, 百拇医药
以明胶标准品作对照，在同样条件下与胶原止血海绵同时进行SDS-PAGE的凝胶电泳，可见胶原止血海绵中不仅有α1、α2、β、γ组份，而且有分子量小于α、大于γ的组份。由各组份的位置可以计算出对应的相对迁移率Rf。明胶标准品各组份的Rf与[MW](分子量)的对应关系见表2。据此可绘制出标准曲线(图略)，回归出标准曲线方程：Rf=4.46-0.77lg[MW]
表2 明胶标准品的相对迁移率(Rf)与分子量[MW]的对应关系
Table 2 The relation between Rf and [MW]of gelatin standard sample Composition name
Rf
, 百拇医药
[MW]
>γ
0.03
γ
0.24
300,000
β
0.36
200,000
α2
0.59
97,000
α1
, 百拇医药
0.64
95,000
<α
0.68
根据明胶标准品SDS-PAGE标准曲线方程或标准曲线图，可以确定出胶原止血海绵电泳胶片上各组份的分子量。胶原止血海绵各组份的Rf及[MW]的对应关系见表3。表3 胶原止血海绵的相对迁移率(Rf)与分子量[MW]的对应关系
Table 3 The relation between Rf and [MW] of collagen hemostatic sponge Composition name
Rf
, 百拇医药
[MW]
>γ
0.04
549,870
γ
0.25
293,449
β
0.38
198,930
α2
0.62
97,053
, 百拇医药
α1
0.66
86,112
<α
0.70
76,404
由表3中的数据可知，胶原止血海绵中的γ组份是α组份的三聚体，而α组份是具有螺旋结构的单肽链，三条α螺旋链互相缠绕，互相以氢键形式结合起来，形成了一个超螺旋的γ组份，与胶原蛋白的特征结构相符。
同时对明胶标准品、胶原止血海绵样品的电泳胶片进行光密度扫描，测定出各组份的百分含量，得到不同分子量的各组份的分布状况。结果见表4。
表4 明胶标准品、胶原止血海绵的分子量分布
, http://www.100md.com
Table 4 The molecular weight distribution of gelatin standard sample and
collagen hemostatic sponge Composition
name
Percentage content (%)
Gelatin standard
sample
Collagen hemostatic
sponge
>γ
, http://www.100md.com
6.85
17.90
γ
10.50
14.61
β
25.96
25.14
α2
21.68
24.26
α1
19.89
, 百拇医药
13.14
<α
15.11
4.95
由表4中的数据可知，胶原止血海绵的γ组份及分子量高于γ的组份含量约是明胶标准品的两倍；分子量小于α的组份含量约是明胶标准品的四分之一。与胶原蛋白的结构组成特征相符。
2.2 胶原止血海绵的物理性能
对连续三批胶原止血海绵进行物理性能测试，其体密度，含水量见表5。
表5 胶原止血海绵的物理性能
Table 5 The physical properties of collagen hemostatic sponge Physical properties
, http://www.100md.com
Sample
1
2
3
Bull density(Kg/m3)
31.04
34.94
35.04
Moisture capacity(%)
13.58
10.89
10.23
, 百拇医药
胶原止血海绵的体密度是由进行冷冻干燥工艺前的胶原醋酸溶液的浓度决定的，可以通过调节胶原醋酸溶液的固含量来控制胶原止血海绵的体密度，同时，必须注意使胶原在醋酸溶液中分散均匀，以确保胶原止血海绵体密度均匀。胶原止血海绵的含水量是由冻干工艺决定的，在一定的冻干条件下，冷冻干燥的时间越长，胶原止血海绵的含水量越低。三批胶原止血海绵的体密度、含水量较稳定，说明胶原止血海绵的质量稳定，制备工艺可靠。
2.3 胶原止血海绵的化学性能
对连续三批胶原止血海绵进行消化性能测试，每批胶原止血海绵均取不同部位的三个样品，结果表明：胶原止血海绵均在2 h内完成消化。对连续三批胶原止血海绵进行炽灼残渣含量测定，结果胶原止血海绵炽灼残渣含量均<1%。
酶解法制备胶原止血海绵时，如果不用透析处理，则制得的胶原止血海绵的炽灼残渣高达20%。观察完全灰化的胶原海绵样品发现，坩埚内有少许白色晶体残留，由胶原止血海绵的制备工艺可知，炽灼残留的无机杂质主要是氯化钠。当炽灼残渣含量过高时，胶原止血海绵会对创面造成不良影响，因此制备胶原止血海绵时必须经过透析处理。
, 百拇医药
3 结论
(1)胶原止血海绵的结构分析表明，酶解法制备的胶原止血海绵具有胶原蛋白的特征结构与组成，是纯度较高的胶原蛋白。
(2)胶原止血海绵样品的理化性能较稳定，表明酶解法制备胶原止血海绵的质量较稳定。
(3)结构分析与理化性能测试表明：胶原止血海绵的制备工艺合理可靠。
参考文献
[1] 罗 磊.医用胶原蛋白的临床应用.国外医学口腔医学分册，1996；23(1)∶41
[2] Low RK, Moran ME, Goodnight JE Jr. Clinical correspondence microfibrillar collagen hemostat during laparoscopically directed liver biosy. Journal of Laparoendoscopic Surgery, 1993; 3(4)∶415
[3] Cruz MM Jr, Pennington NJ. USP 1979，4,148,664
[4] Cioca G. USP 1983, 4, 412, 947
[5] 王 韦，孙家玲，刘俊龙等.可溶酸性胶原的制作与临床应用.生物医学工程学杂志，1988；5(4)∶225
(收稿：1997-10-23 修回：1998-05-26), 百拇医药
单位：关 静 叶 萍 武继民(军事医学科学院 卫生装备研究所，天津 300161)
关键词：胶原止血海绵；结构分析；理化性能
生物医学工程学杂志990103 内容摘要 对从牛腱中制备的胶原止血海绵进行了结构分析，结果表明所制备的止血海绵具有胶原蛋白的特征结构与组成，是纯度较高的胶原蛋白；理化性能测试表明胶原止血海绵质量稳定，从而证明了胶原止血海绵的制备工艺合理可靠。
Analyses on Structural and Physicochemical Properties
of Collagen Hemostatic Sponge
Guan Jing Ye Ping Wu Jimin
, 百拇医药
(Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161)
Abstract The ultraviolet spectrum and aminoacid content of collagen hemostatic sponge prepared from bovine tendon were analyzed, and the struture and composition of collagen spoge were confirmed. Physicochemical properties measurements showed that collagen hemostatic sponge had excellently stable quality. It was concluded that the techonology for preparing collagen hemostatic sponge was reasonable and reliable.
, 百拇医药
Key words Collagen hemostatic collagen Structrue analysis Physicochemical properties
胶原不仅能诱导血小板附着，产生释放反应，而且能激活血液凝固因子，粘着在渗血的伤口上，对损伤的血管起填塞作用。与藻酸钙、藻酸海绵、凝血增强纤维泡沫、增凝明胶海绵、氧化纤维素等常用止血剂相比，胶原止血率高，副作用小，是一种理想的止血材料[1]。
国外对胶原止血材料的研究十分活跃，已有粉状及片状的微晶胶原止血剂[2]、纤维织物止血剂[3]和海绵止血剂[4]。欧洲科研大药厂生产的Gelfix(解尔费思)是一种取自牛跟腱的无过敏性、无菌异种冻干胶原，自1994年起进入中国市场，在止血与创面修复治疗中效果显著，但价格昂贵，规格单一。国内对胶原止血材料的研究还处于起步阶段，目前尚无有关胶原止血材料的资料报道。我所近年来开展了胶原止血海绵的研制工作，生物相容性试验表明，胶原止血海绵是一种安全可靠的生物材料，动物止血效果初步试验表明，胶原止血海绵止血时间短，粘附创面能力优异，止血效果不低于Gelfix和明胶海绵。本文对胶原止血海绵的结构及理化性能作了初步研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂
醋酸洗必泰：锦州制造一厂；胃蛋白酶：苏州东吴生物制品厂；乙酸：天津化学试剂一厂；氯化钠：天津市塘沽化学试剂厂。
1.2 胶原止血海绵的制备
采取酶解法制备胶原止血海绵：将牛腱切碎，用醋酸洗必泰消毒，经蒸水清洗除净醋酸洗必泰后，粉碎，加入适量的胃蛋白酶和乙酸溶液，室温放置数天，间歇搅拌，离心除去不溶物，加入氯化钠溶液，沉淀物在蒸馏水中透析至除净氯化钠为止，加入适量乙酸溶解，再将此溶液冷冻干燥制成胶原止血海绵。
1.3 胶原止血海绵的结构分析
1.3.1 胶原止血海绵的紫外光谱分析 配制1%胶原止血海绵的乙酸溶液，用岛津UV-160A紫外可见分光光度计检测溶液的紫外光谱。
, http://www.100md.com
1.3.2 胶原止血海绵的氨基酸分析 用酸碱水解法处理胶原海绵样品，在日立835-50氨基酸自动分析仪上测定其氨基酸组成。
1.3.3 胶原止血海绵的电泳分析 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对胶原止血海绵、明胶标准品同时进行电泳，用CS-900型扫描仪自动检测电泳胶片，确定胶原止血海绵各组份的分子量及其含量。
1.4 胶原止血海绵的物理性能测试
1.4.1 胶原止血海绵的体密度 取1cm×1cm×0.5cm的长方体胶原止血海绵样品，精密测量样品的长度、宽度、高度，计算出样品体积，准确称量，计算出样品的体密度。
1.4.2 胶原止血海绵的含水量 于105℃烘坩埚至恒重(w1)，取0.1～0.3 g胶原止血海绵样品置于坩埚内，称重(w2)，再于105℃烘坩埚至恒重(w3)。样品的含水量为：[(w2-w3)/(w2-w1)]×100%。
, 百拇医药
1.5 胶原止血海绵的化学性能
1.5.1 胶原止血海绵的消化性能 参照一九九五年版美国药典《USP23 NF18》有关“可吸收性明胶海绵”项下的“消化性”试验方法，测定胶原止血海绵在胃蛋白酶作用下的消化时间，并对消化液进行紫外光谱分析。
1.5.2 胶原止血海绵的炽灼残渣含量 参照一九九五年版《中华人民共和国药典》二部附录Ⅷ N进行。
2 结果与讨论
2.1 胶原止血海绵的结构组成
对连续三批胶原止血海绵样品进行紫外光谱分析(图略)，其吸收峰均在225 nm处(图略)，这与资料报道的胶原蛋白的特征吸收峰位置相符[5]，可见酶解法制备的止血海绵是胶原蛋白。
, 百拇医药 表1列出了连续三批胶原止血海绵样品的氨基酸组成。其中甘氨酸的含量分别为36.31%、36.43%、36.63%，脯氨酸的含量分别为14.52%、14.41%、14.25%，羟脯氨酸的含量分别为3.76%、3.89%、3.86%，可见甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸的含量均很稳定，而且符合胶原蛋白氨基酸组成的特征，即约有1/3为甘氨酸，15%～30%为脯氨酸和羟脯氨酸。这不仅说明胶原止血海绵制备工艺较稳定，而且也说明酶解法制备的胶原止血海绵的纯度较高。
表1 胶原止血海绵的氨基酸含量*
Table 1 The aminoacid content of collagen hemostatic sponge* Aminoacid
Sample
1
, 百拇医药
2
3
ASP
4.68
4.61
4.60
THR
1.82
1.78
1.78
SER
3.70
3.71
, 百拇医药
3.63
GLU
8.53
8.65
8.42
GLY
36.31
36.43
36.63
ALA
9.74
10.22
10.19
, http://www.100md.com
ALA
0.11
0.11
0.11
VAL
2.12
1.98
2.12
MET
0.56
0.57
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ILE
, http://www.100md.com
1.30
1.17
1.25
IEU
2.98
2.93
2.91
TYR
0.22
0.20
0.25
PHE
1.33
, 百拇医药
1.35
1.33
LYS
2.36
2.34
2.47
HIS
0.60
0.56
0.54
ARG
5.25
5.10
, http://www.100md.com
5.01
PRO
14.52
14.41
14.25
HYPRO
3.76
3.89
3.86
*The aminoacid content in Table 1 refers to the number of each assigned aminoacid residue in 100 aminoacid residues
, 百拇医药
以明胶标准品作对照，在同样条件下与胶原止血海绵同时进行SDS-PAGE的凝胶电泳，可见胶原止血海绵中不仅有α1、α2、β、γ组份，而且有分子量小于α、大于γ的组份。由各组份的位置可以计算出对应的相对迁移率Rf。明胶标准品各组份的Rf与[MW](分子量)的对应关系见表2。据此可绘制出标准曲线(图略)，回归出标准曲线方程：Rf=4.46-0.77lg[MW]
表2 明胶标准品的相对迁移率(Rf)与分子量[MW]的对应关系
Table 2 The relation between Rf and [MW]of gelatin standard sample Composition name
Rf
, 百拇医药
[MW]
>γ
0.03
γ
0.24
300,000
β
0.36
200,000
α2
0.59
97,000
α1
, 百拇医药
0.64
95,000
<α
0.68
根据明胶标准品SDS-PAGE标准曲线方程或标准曲线图，可以确定出胶原止血海绵电泳胶片上各组份的分子量。胶原止血海绵各组份的Rf及[MW]的对应关系见表3。表3 胶原止血海绵的相对迁移率(Rf)与分子量[MW]的对应关系
Table 3 The relation between Rf and [MW] of collagen hemostatic sponge Composition name
Rf
, 百拇医药
[MW]
>γ
0.04
549,870
γ
0.25
293,449
β
0.38
198,930
α2
0.62
97,053
, 百拇医药
α1
0.66
86,112
<α
0.70
76,404
由表3中的数据可知，胶原止血海绵中的γ组份是α组份的三聚体，而α组份是具有螺旋结构的单肽链，三条α螺旋链互相缠绕，互相以氢键形式结合起来，形成了一个超螺旋的γ组份，与胶原蛋白的特征结构相符。
同时对明胶标准品、胶原止血海绵样品的电泳胶片进行光密度扫描，测定出各组份的百分含量，得到不同分子量的各组份的分布状况。结果见表4。
表4 明胶标准品、胶原止血海绵的分子量分布
, http://www.100md.com
Table 4 The molecular weight distribution of gelatin standard sample and
collagen hemostatic sponge Composition
name
Percentage content (%)
Gelatin standard
sample
Collagen hemostatic
sponge
>γ
, http://www.100md.com
6.85
17.90
γ
10.50
14.61
β
25.96
25.14
α2
21.68
24.26
α1
19.89
, 百拇医药
13.14
<α
15.11
4.95
由表4中的数据可知，胶原止血海绵的γ组份及分子量高于γ的组份含量约是明胶标准品的两倍；分子量小于α的组份含量约是明胶标准品的四分之一。与胶原蛋白的结构组成特征相符。
2.2 胶原止血海绵的物理性能
对连续三批胶原止血海绵进行物理性能测试，其体密度，含水量见表5。
表5 胶原止血海绵的物理性能
Table 5 The physical properties of collagen hemostatic sponge Physical properties
, http://www.100md.com
Sample
1
2
3
Bull density(Kg/m3)
31.04
34.94
35.04
Moisture capacity(%)
13.58
10.89
10.23
, 百拇医药
胶原止血海绵的体密度是由进行冷冻干燥工艺前的胶原醋酸溶液的浓度决定的，可以通过调节胶原醋酸溶液的固含量来控制胶原止血海绵的体密度，同时，必须注意使胶原在醋酸溶液中分散均匀，以确保胶原止血海绵体密度均匀。胶原止血海绵的含水量是由冻干工艺决定的，在一定的冻干条件下，冷冻干燥的时间越长，胶原止血海绵的含水量越低。三批胶原止血海绵的体密度、含水量较稳定，说明胶原止血海绵的质量稳定，制备工艺可靠。
2.3 胶原止血海绵的化学性能
对连续三批胶原止血海绵进行消化性能测试，每批胶原止血海绵均取不同部位的三个样品，结果表明：胶原止血海绵均在2 h内完成消化。对连续三批胶原止血海绵进行炽灼残渣含量测定，结果胶原止血海绵炽灼残渣含量均<1%。
酶解法制备胶原止血海绵时，如果不用透析处理，则制得的胶原止血海绵的炽灼残渣高达20%。观察完全灰化的胶原海绵样品发现，坩埚内有少许白色晶体残留，由胶原止血海绵的制备工艺可知，炽灼残留的无机杂质主要是氯化钠。当炽灼残渣含量过高时，胶原止血海绵会对创面造成不良影响，因此制备胶原止血海绵时必须经过透析处理。
, 百拇医药
3 结论
(1)胶原止血海绵的结构分析表明，酶解法制备的胶原止血海绵具有胶原蛋白的特征结构与组成，是纯度较高的胶原蛋白。
(2)胶原止血海绵样品的理化性能较稳定，表明酶解法制备胶原止血海绵的质量较稳定。
(3)结构分析与理化性能测试表明：胶原止血海绵的制备工艺合理可靠。
参考文献
[1] 罗 磊.医用胶原蛋白的临床应用.国外医学口腔医学分册，1996；23(1)∶41
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(收稿：1997-10-23 修回：1998-05-26), 百拇医药