微机化光度法细胞粘附的定量检测
作者：王建民 施永德 郭德煌 吴展琪 梁子钧
单位：上海医科大学 生物物理教研室，上海 200032
关键词：细胞粘附；透光度；微机化检测
生物医学工程学杂志990223 摘要 为了建立一种新的有效的红细胞与血管内皮细胞粘附的检测方法，我们采用细胞力学参数分析仪，研究了粘附红细胞数与透光度之间的相关性。结果表明：红细胞与血管内皮细胞粘附的光度法检测方法简单、有效、可靠。
Autodetection of Cell Adhesion by Light Transmission
Wang Jianmin Shi Yongde Guo Dehuang WuZhanqi Liang Zijun
, 百拇医药 Department of Biophysics, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
Abstract To set up a new effective method for measuring the adhesion between red blood cells and vascular endothelial cells, we studied the relationship between adhesive red blood cells and light transmission by using Microscope-Photometric-Monolayer-Technique Elias-c Analyzer in our department. The results showed that the method of light transmission measurement on the adhesion between red blood cells and vascular endothelial cells is simple, effective and reliable.
, 百拇医药
Key words Cell adhesion Ligth transmission Computerized detection
1 前 言
血液的流变学特征，不仅包括红细胞的聚集性与变形性，而且涉及到红细胞与血管内皮细胞的相互作用、相互影响。因而近年来在血液流变学的研究领域中，有愈来愈多的研究者正致力于红细胞与血管内皮细胞粘附特征的研究[1]。红细胞与血管内皮细胞粘附性的异常变化，不仅反映了血液流变学特征的异常变化，而且是许多心血管病理生理变化的重要原因[2]。因此，简便、准确地检测红细胞与血管内皮细胞粘附也就十分重要。本室在德国亚琛大学赠送的细胞力学参数分析仪的基础上，建立了一种微机化光度法细胞粘附能力的检测方法。现介绍如下。
2 材料和方法
2.1 细胞力学参数分析仪的结构及细胞粘附的检测原理[3]
, http://www.100md.com
细胞力学参数分析仪由Zeiss显微镜、驱动泵、恒温水浴箱、平行平板流动腔及控制用单片机组成(图1)。将灌流缓冲液置于恒温水浴槽中，在蠕动泵的驱动下流过平行平板流动腔。调节蠕动泵的转速改变流量，可产生不同的切应力。透过滤光片的光源，经过平行平板流动腔中的细胞层及物镜后到达光感受器。因光感受器的敏感度在透光度值为30000～60000最大，故以透光度值60000为基值，调节稳压电源及显微镜光圈等部件。在其他条件稳定时，透光度随平行平板流动腔中细胞层的细胞量变化而变化。如以培养血管内皮细胞层的透光度为基值，则透光度随平行平板流动腔中红细胞数量的变化而变化。
图1 仪器结构图
Fig 1 The outline of the instrument structure
1.thermostat water bath; 2.pump; 3.reservior; 4.sampling valve; 5.light receptor; 6.objective; 7.parallel plate flow chamber; 8.light filter(293nm); 9.light source; 10.computer
, http://www.100md.com
2.2 实验试剂
2.2.1 缓冲液1(mM) NaCl, 137;KCl, 4;CaCl2,1.8; Na2HPO4, 0.8;HEPES,8.4; pH,7.4; 渗透压，300±10 mOs mol/kg。
2.2.2 缓冲液2 缓冲液1中加0.1%的无水葡萄糖，10 Pa、10 min高压灭菌。
2.2.3 缓冲液3 缓冲液2中加0.1%牛血清白蛋白，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。
2.2.4 细胞培养液 DMEM细胞培养液(GIBCO)中加10%的胎牛血清(GIBCO)，10%新生小牛血清(中科院细胞所)，L-谷氨酰胺0.9 g/L，Hapes 20 mmol/L，青霉素100 u/ml，链霉素100 mg/ml。0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存。
, http://www.100md.com
2.3 细胞制备
2.3.1 红细胞悬液的制备 取新鲜健康人全血2～3 ml，用缓冲液2洗涤3次(每次1000 g离心5 min)。取压紧红细胞，制成1%的红细胞悬液备用。
2.3.2 单层红细胞的制备 通过加样开关，加入红细胞悬液至流动腔灌满，静置15 min后，用1.17 Pa的切应力冲洗1 min去除未粘附的细胞，流动腔中剩余红细胞即为单层红细胞。
2.3.3 血管内皮细胞的培养 参照Bowman等的方法[4]并加以改进，分离、培养出Wistar大鼠的脑血管内皮细胞，经Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定阳性。将3～5代的内皮细胞培养至5 mm×10 mm的盖玻片上，待细胞基本融合时备用。
2.4 测量步骤
2.4.1 单层红细胞平均密度的计算方法 在25×10的放大倍数下，计数视野中每个方格(0.03 mm×0.03 mm)中的红细胞数，取10次平均数。换算成单位面积的细胞数即为单层红细胞的平均密度。
, 百拇医药
2.4.2 透光区面积与红细胞平均透光度的计算方法 用显微测量器测量光传感器通路上圆形亮区的直径，计算透光区面积；红细胞平均透光度=(60000-实测透光度值)/(透光区面积×红细胞平均密度)
2.4.3 粘附红细胞的光度法检测 用缓冲液2在1 Pa作用力下冲洗流动腔1 min，加入培养细胞的盖玻片，再在1 Pa作用力下冲洗流动腔1 min。将此时透过单层内皮细胞的透光度作为基数，调至60000。经加样开关加入红细胞悬液至流动腔灌满。37℃条件下孵育15 min。分别测定0.1、0.25、0.50、0.75、1.0 Pa不同切应力条件下，细胞区透光度变化，同时计算每个高倍(×400)视野下的粘附红细胞数。
2.5 数据处理
采用Excel 5.0中的Average、STDEV函数分别计算各组均数与标准差，并用SAS 6.04统计软件进行粘附红细胞数与透光度值的相关性检验。
, 百拇医药
3 结 果
3.1 单层红细胞平均密度与红细胞平均透光度
单层红细胞平均密度约为4.17×105 cells/cm2，透光区面积约为1.352 mm2。单层红细胞可使透光度从60000减少到30200±1240。据上述红细胞平均透光度的计算公式可得红细胞平均透光度值约为5.286/cell。
3.2 红细胞数量与透光度变化的相关性
根据红细胞平均透光度值，可得红细胞数量与透光度变化的相关性理论曲线为：
透光度值=60000-5.286×粘附红细胞数
分别采用光度法与计数法检测同一样本的粘附红细胞数，两者也有较好的相关性。相关曲线为：
, http://www.100md.com
透光度值=59840.97-7.17×粘附红细胞数
相关系数：r=0.982。
实测粘附红细胞数与透光度值的相关曲线与理论曲线相比，两者的吻合性也较好(图2)。
图2 红细胞数量与透光度之间的相关关系
Fig 2 The relationship between the number of erythrocyte and light transmission
3.3 透光度与粘附红细胞数随剪切应力的变化
在0.1～1.0 Pa不同切应力作用下，红细胞与血管内皮细胞的粘附量有较明显的变化，随切应力增加，红细胞粘附量逐渐减少，透光度逐渐增加(表1)。表明透光度及粘附红细胞数与切应力之间有很好的相关性。相关系数分别为：0.88、0.89。
, 百拇医药
表1 透光度与粘附红细胞数随剪切应力的变化(n=6,x±s)
Table 1 The changes of the light transmission and the number of adhesive erythrocytes by shear stress(n=6,x±s) Shear stress(Pa)
0.1
0.25
0.50
0.75
1.0
No.adhesive erythrocytes
492.67
, 百拇医药
±45.99
414.00
±61.16
53.67
±17.77
42.50
±9.59
37.83
±11.70
Light transmission
19266.67
±2035.35
, 百拇医药
26150.00
±1433.53
55916.67
±636.92
56750.00
±432.44
57266.67
±662.32
4 讨 论
红细胞与血管内皮细胞粘附的研究，对于探讨心脑血管性疾病的发生、发展机制具有重要的意义。已有实验证明，血管栓塞的发生率与栓塞的严重程度与红细胞、内皮细胞的粘附密切相关。在红细胞与内皮细胞粘附的研究中，方便有效的检测方法无疑是重要的前提。
, http://www.100md.com
目前，国内外对于内皮细胞、红细胞粘附的检测方法主要有以下三种：(1)放射免疫测定法。用51铬标记红细胞，通过粘附红细胞中51铬的放射活性来反映细胞粘附量；(2)人工计数方法；(3)基于人工计数方法的图像分析方法。上述三种方法虽然为红细胞与血管内皮细胞粘附的研究奠定了基础，但也各有其优缺点。如放免测定法虽然也能检测较大量细胞，从而反映总体情况较好，但该法易于污染，非特异性本底也较高；人工计数方法工作量大，且易受主观因素影响；而图像分析方法虽然精确性与自动化程度上均有其优越性，但硬件条件要求较高，因而成本高，费用大。
德国亚琛大学研制的细胞力学参数分析仪，是基于特定波长的光源下红细胞对光的吸收较为敏感的原理而建立起来的红细胞流变学参数的分析仪[3]。该仪器已充分应用于不同患者红细胞流变学参数的分析[5]；不同药物对红细胞变形能力影响的分析[6]。研究结果表示，该仪器性能稳定，敏感性与自动化程度高。我们在此基础上建立了细胞粘附的光度法检测方法。该方法每次测定检测的样本范围较大，能较好地反映总体情况；检测过程方便，自动化程度高。这无疑为红细胞与血管内皮细胞粘附的检测开辟了一条新的途径。但是，由于内皮细胞的密度、红细胞样本的浓度、个体加样误差等操作对透光度有较大的影响，因此，在提高系统的稳定性等方面仍有待进一步的探索。注释：国家卫生部资助课题(96-1-161)
, http://www.100md.com
参考文献
1 Nash GB, Cooke BM, Marsh K et al. Rheological analysis of the adhesive interactions of red blood cells by Plasmaodium falciparum. Blood, 1992; 79∶798
2 Kaul DK, Nagel RL. Sickle cell vaso-occulsion:many issues and some answers. Experientia, 1993; 49∶5
3 Artmann GM Microscope photometric quantification of stiffness and relexation time of red blood cells in a flow chamber. Biorheology, 1995; 32(5)∶553
, http://www.100md.com
4 Bowman PD, Beta AL, Diane AR， et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro, 1981; 17(4)∶353
5 Artmann GM, Li A, Ziemer J et al. A photometric method to analyze induced erythrocyte shape changes. Biorheology, 1996; 33(3)∶251
6 Li A, Ursel S, Artmann GM. Dihydroergocryptine maintains erythrocyte fluidity in acidotic hyperosmolar buffer solutions modelling hypoxic and ischemic microcirculation. Clinical Hemorheology, 1995; 15(2)∶133
收稿：1997-11-05 修回：1998-06-01, http://www.100md.com
单位：上海医科大学 生物物理教研室，上海 200032
关键词：细胞粘附；透光度；微机化检测
生物医学工程学杂志990223 摘要 为了建立一种新的有效的红细胞与血管内皮细胞粘附的检测方法，我们采用细胞力学参数分析仪，研究了粘附红细胞数与透光度之间的相关性。结果表明：红细胞与血管内皮细胞粘附的光度法检测方法简单、有效、可靠。
Autodetection of Cell Adhesion by Light Transmission
Wang Jianmin Shi Yongde Guo Dehuang WuZhanqi Liang Zijun
, 百拇医药 Department of Biophysics, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
Abstract To set up a new effective method for measuring the adhesion between red blood cells and vascular endothelial cells, we studied the relationship between adhesive red blood cells and light transmission by using Microscope-Photometric-Monolayer-Technique Elias-c Analyzer in our department. The results showed that the method of light transmission measurement on the adhesion between red blood cells and vascular endothelial cells is simple, effective and reliable.
, 百拇医药
Key words Cell adhesion Ligth transmission Computerized detection
1 前 言
血液的流变学特征，不仅包括红细胞的聚集性与变形性，而且涉及到红细胞与血管内皮细胞的相互作用、相互影响。因而近年来在血液流变学的研究领域中，有愈来愈多的研究者正致力于红细胞与血管内皮细胞粘附特征的研究[1]。红细胞与血管内皮细胞粘附性的异常变化，不仅反映了血液流变学特征的异常变化，而且是许多心血管病理生理变化的重要原因[2]。因此，简便、准确地检测红细胞与血管内皮细胞粘附也就十分重要。本室在德国亚琛大学赠送的细胞力学参数分析仪的基础上，建立了一种微机化光度法细胞粘附能力的检测方法。现介绍如下。
2 材料和方法
2.1 细胞力学参数分析仪的结构及细胞粘附的检测原理[3]
, http://www.100md.com
细胞力学参数分析仪由Zeiss显微镜、驱动泵、恒温水浴箱、平行平板流动腔及控制用单片机组成(图1)。将灌流缓冲液置于恒温水浴槽中，在蠕动泵的驱动下流过平行平板流动腔。调节蠕动泵的转速改变流量，可产生不同的切应力。透过滤光片的光源，经过平行平板流动腔中的细胞层及物镜后到达光感受器。因光感受器的敏感度在透光度值为30000～60000最大，故以透光度值60000为基值，调节稳压电源及显微镜光圈等部件。在其他条件稳定时，透光度随平行平板流动腔中细胞层的细胞量变化而变化。如以培养血管内皮细胞层的透光度为基值，则透光度随平行平板流动腔中红细胞数量的变化而变化。
图1 仪器结构图
Fig 1 The outline of the instrument structure
1.thermostat water bath; 2.pump; 3.reservior; 4.sampling valve; 5.light receptor; 6.objective; 7.parallel plate flow chamber; 8.light filter(293nm); 9.light source; 10.computer
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2.2 实验试剂
2.2.1 缓冲液1(mM) NaCl, 137;KCl, 4;CaCl2,1.8; Na2HPO4, 0.8;HEPES,8.4; pH,7.4; 渗透压，300±10 mOs mol/kg。
2.2.2 缓冲液2 缓冲液1中加0.1%的无水葡萄糖，10 Pa、10 min高压灭菌。
2.2.3 缓冲液3 缓冲液2中加0.1%牛血清白蛋白，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。
2.2.4 细胞培养液 DMEM细胞培养液(GIBCO)中加10%的胎牛血清(GIBCO)，10%新生小牛血清(中科院细胞所)，L-谷氨酰胺0.9 g/L，Hapes 20 mmol/L，青霉素100 u/ml，链霉素100 mg/ml。0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存。
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2.3 细胞制备
2.3.1 红细胞悬液的制备 取新鲜健康人全血2～3 ml，用缓冲液2洗涤3次(每次1000 g离心5 min)。取压紧红细胞，制成1%的红细胞悬液备用。
2.3.2 单层红细胞的制备 通过加样开关，加入红细胞悬液至流动腔灌满，静置15 min后，用1.17 Pa的切应力冲洗1 min去除未粘附的细胞，流动腔中剩余红细胞即为单层红细胞。
2.3.3 血管内皮细胞的培养 参照Bowman等的方法[4]并加以改进，分离、培养出Wistar大鼠的脑血管内皮细胞，经Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定阳性。将3～5代的内皮细胞培养至5 mm×10 mm的盖玻片上，待细胞基本融合时备用。
2.4 测量步骤
2.4.1 单层红细胞平均密度的计算方法 在25×10的放大倍数下，计数视野中每个方格(0.03 mm×0.03 mm)中的红细胞数，取10次平均数。换算成单位面积的细胞数即为单层红细胞的平均密度。
, 百拇医药
2.4.2 透光区面积与红细胞平均透光度的计算方法 用显微测量器测量光传感器通路上圆形亮区的直径，计算透光区面积；红细胞平均透光度=(60000-实测透光度值)/(透光区面积×红细胞平均密度)
2.4.3 粘附红细胞的光度法检测 用缓冲液2在1 Pa作用力下冲洗流动腔1 min，加入培养细胞的盖玻片，再在1 Pa作用力下冲洗流动腔1 min。将此时透过单层内皮细胞的透光度作为基数，调至60000。经加样开关加入红细胞悬液至流动腔灌满。37℃条件下孵育15 min。分别测定0.1、0.25、0.50、0.75、1.0 Pa不同切应力条件下，细胞区透光度变化，同时计算每个高倍(×400)视野下的粘附红细胞数。
2.5 数据处理
采用Excel 5.0中的Average、STDEV函数分别计算各组均数与标准差，并用SAS 6.04统计软件进行粘附红细胞数与透光度值的相关性检验。
, 百拇医药
3 结 果
3.1 单层红细胞平均密度与红细胞平均透光度
单层红细胞平均密度约为4.17×105 cells/cm2，透光区面积约为1.352 mm2。单层红细胞可使透光度从60000减少到30200±1240。据上述红细胞平均透光度的计算公式可得红细胞平均透光度值约为5.286/cell。
3.2 红细胞数量与透光度变化的相关性
根据红细胞平均透光度值，可得红细胞数量与透光度变化的相关性理论曲线为：
透光度值=60000-5.286×粘附红细胞数
分别采用光度法与计数法检测同一样本的粘附红细胞数，两者也有较好的相关性。相关曲线为：
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透光度值=59840.97-7.17×粘附红细胞数
相关系数：r=0.982。
实测粘附红细胞数与透光度值的相关曲线与理论曲线相比，两者的吻合性也较好(图2)。
图2 红细胞数量与透光度之间的相关关系
Fig 2 The relationship between the number of erythrocyte and light transmission
3.3 透光度与粘附红细胞数随剪切应力的变化
在0.1～1.0 Pa不同切应力作用下，红细胞与血管内皮细胞的粘附量有较明显的变化，随切应力增加，红细胞粘附量逐渐减少，透光度逐渐增加(表1)。表明透光度及粘附红细胞数与切应力之间有很好的相关性。相关系数分别为：0.88、0.89。
, 百拇医药
表1 透光度与粘附红细胞数随剪切应力的变化(n=6,x±s)
Table 1 The changes of the light transmission and the number of adhesive erythrocytes by shear stress(n=6,x±s) Shear stress(Pa)
0.1
0.25
0.50
0.75
1.0
No.adhesive erythrocytes
492.67
, 百拇医药
±45.99
414.00
±61.16
53.67
±17.77
42.50
±9.59
37.83
±11.70
Light transmission
19266.67
±2035.35
, 百拇医药
26150.00
±1433.53
55916.67
±636.92
56750.00
±432.44
57266.67
±662.32
4 讨 论
红细胞与血管内皮细胞粘附的研究，对于探讨心脑血管性疾病的发生、发展机制具有重要的意义。已有实验证明，血管栓塞的发生率与栓塞的严重程度与红细胞、内皮细胞的粘附密切相关。在红细胞与内皮细胞粘附的研究中，方便有效的检测方法无疑是重要的前提。
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目前，国内外对于内皮细胞、红细胞粘附的检测方法主要有以下三种：(1)放射免疫测定法。用51铬标记红细胞，通过粘附红细胞中51铬的放射活性来反映细胞粘附量；(2)人工计数方法；(3)基于人工计数方法的图像分析方法。上述三种方法虽然为红细胞与血管内皮细胞粘附的研究奠定了基础，但也各有其优缺点。如放免测定法虽然也能检测较大量细胞，从而反映总体情况较好，但该法易于污染，非特异性本底也较高；人工计数方法工作量大，且易受主观因素影响；而图像分析方法虽然精确性与自动化程度上均有其优越性，但硬件条件要求较高，因而成本高，费用大。
德国亚琛大学研制的细胞力学参数分析仪，是基于特定波长的光源下红细胞对光的吸收较为敏感的原理而建立起来的红细胞流变学参数的分析仪[3]。该仪器已充分应用于不同患者红细胞流变学参数的分析[5]；不同药物对红细胞变形能力影响的分析[6]。研究结果表示，该仪器性能稳定，敏感性与自动化程度高。我们在此基础上建立了细胞粘附的光度法检测方法。该方法每次测定检测的样本范围较大，能较好地反映总体情况；检测过程方便，自动化程度高。这无疑为红细胞与血管内皮细胞粘附的检测开辟了一条新的途径。但是，由于内皮细胞的密度、红细胞样本的浓度、个体加样误差等操作对透光度有较大的影响，因此，在提高系统的稳定性等方面仍有待进一步的探索。注释：国家卫生部资助课题(96-1-161)
, http://www.100md.com
参考文献
1 Nash GB, Cooke BM, Marsh K et al. Rheological analysis of the adhesive interactions of red blood cells by Plasmaodium falciparum. Blood, 1992; 79∶798
2 Kaul DK, Nagel RL. Sickle cell vaso-occulsion:many issues and some answers. Experientia, 1993; 49∶5
3 Artmann GM Microscope photometric quantification of stiffness and relexation time of red blood cells in a flow chamber. Biorheology, 1995; 32(5)∶553
, http://www.100md.com
4 Bowman PD, Beta AL, Diane AR， et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro, 1981; 17(4)∶353
5 Artmann GM, Li A, Ziemer J et al. A photometric method to analyze induced erythrocyte shape changes. Biorheology, 1996; 33(3)∶251
6 Li A, Ursel S, Artmann GM. Dihydroergocryptine maintains erythrocyte fluidity in acidotic hyperosmolar buffer solutions modelling hypoxic and ischemic microcirculation. Clinical Hemorheology, 1995; 15(2)∶133
收稿：1997-11-05 修回：1998-06-01, http://www.100md.com