体外生物人工肝支持系统生物功能的体外研究
作者：王英杰 李梦东 王宇明 聂青和 王小红
单位：第三军医大学 西南医院，重庆 400038
关键词：人工肝；肝细胞；生物合成
生物医学工程学杂志990205 摘要 用2×108个混合聚集球形培养的人肝细胞、肝非实质细胞与中空纤维型生物反应器组成体外生物人工肝支持系统(EBLSS)，通过循环液(PRIM 1640)中肝细胞合成分泌产物的分析，评价其生物功能。结果表明，经过6 h的体外循环，循环液中总蛋白、白蛋白、甲胎蛋白和尿素含量均显著增加，该循环液使体外培养大鼠肝细胞DNA合成率显著增加(与对照组比较P<0.01)，实验后球形体肝细胞仍保持良好的活力。提示由培养人肝细胞和中空纤维型生物反应器组成的体外生物人工肝具备肝脏生物合成功能，并有刺激肝细胞增殖的能力。
Study on the Biologic Function of Extracorporeal
, http://www.100md.com
Bioartificial Liver Support System
Wang Yingjie Li Mengdong Wang Yuming
Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038
Abstract In this study, a total of 2×108 hepatoctyes and nonparenchymal liver cells cultrued as aggregate spheroids and a hollow fiber bioreactor were used to set up the extracorporeal bioartificial liver support system (EBLSS).Its function was determined throungh the analysis of some cells production.After 6 hours circulating of EBLSS, the total protein, albumin, alpha-fetoprotein and urea were markedly increased in the circulating media, and the DNA synthesis of rat hepatocytes cultured in the media was significantly increased (compared with control group,P<0.01).This suggests that the EBLSS which consists of cultured human liver cells and hollow fiber bioreactor has the biologic function of liver and has a stimulative action on the proliferation of hepatocytes.
, 百拇医药
Key words Artificial liver Liver cells Function
1 引 言
生物人工肝是近年来暴发性肝衰竭(FHF)治疗研究的热门课题之一，由于这种新型的人工肝系统以培养肝细胞为生物材料，性能明显优于早期非生物型人工肝，具有良好的应用前景，因而受到广泛关注[1，2]。我们在成功建立肝细胞球形聚集培养的基础上[3]，用中空纤维型生物反应器与混合培养的人肝细胞-肝非实质细胞共同构成体外生物人工肝支持系统(EBLSS)，对其生物合成功能进行了初步研究，现将有关结果报道如下。
2 材料与方法
2.1 肝细胞的分离与聚集培养
肝组织源于非肝病死亡的供肝者，以体外简易两步灌流法分离肝细胞，胶原酶(Sigma产品)消化后，采用差速离心法反复三次离心，获取肝细胞和肝非实质细胞，台盼兰染色示细胞存活率在95%以上。两种细胞按2∶1混合，综合应用旋转振荡、激素限定培养液和贴壁抑制剂被覆培养瓶等方法，进行肝细胞与肝非实质细胞混合多细胞球形聚集培养[3]。
, 百拇医药
2.2 EBLSS的构成
以中空纤维管为生物反应器(Neuzil博士惠赠)，该管由二百多根平行排列的多孔质中空纤维组成，纤维管壁滤过孔径0.2 μm。反应器内腔体积40 ml，外腔16 ml，纤维壁表面积约600 cm2。反应器外腔放置球形聚集培养的肝细胞，内腔经医用硅胶管与蠕动泵、循环液贮池(容积150 ml)相连通，整个装置为一闭合循环系统。实验取培养4 d的混合聚集球形体肝细胞、肝非实质细胞(量约2×108)，连同细胞培养液一起移入反应器，置37 ℃、5%的CO2条件下，反复旋转反应器使肝细均分布。
2.3 EBLSS生物合成产物的分析
将EBLSS置于37 ℃条件下，以30 ml/min的速度循环反应器内腔和贮池内RPMI 1640液，共6 h，定时吸取少量循环液，用Beckman自动生化分析仪检测其中白蛋白、总蛋白和尿素的含量，用火箭免疫电泳法测定甲胎蛋白的分泌量，同时以3H-TdR掺入法观察循环液对体外培养大鼠肝细胞DNA合成率的影响。
, 百拇医药
2.4 EBLSS肝细胞的活力观察
于EBLSS循环前后，用台盼兰拒染实验鉴定肝细胞的存活率，以自然沉降法观察球形聚集肝细胞在被覆I型胶原培养板上的贴壁能力，并用生化分析法检测循环液中肝细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)量。
3 结 果
3.1 EBLSS的蛋白合成
动态检测结果显示，循环液中白蛋白、总蛋白的含量随EBLSS运转时间延长而显著增加，而原始(未循环)RPMI 1640未检出白蛋白和总蛋白(图1)。
图1 EBLSS白蛋白、总蛋白变化
Fig 1 Changes of total protein and albumin of EBLSS
, http://www.100md.com
循环液中甲胎蛋白的含量变化与白蛋白、总蛋白相似。0、2、4、6 h的浓度分别为<31、125、125、250 μg/L。
3.2 EBLSS循环液中尿素的含量变化
EBLSS循环液中尿素的含量亦随运行时间而明显增加(见图2)。
图2 EBLSS循环液中尿素的变化
Fig 2 Changes of urea of EBLSS
3.3 EBLSS循环液对培养大鼠肝细胞DNA合成的影响
用EBLSS循环2、4、6 h及未循环的RPMI 1640液培养大鼠肝细胞(接种浓度1×105/ml)，检测48 h后的3H-TdR掺入量显示，循环液组培养肝细胞的3H-TdR掺入量显著高于未循环RPMI 1640对照组(P<0.01)，不同循环时间组培养肝细胞的3H-TdR掺入量也有差异，其中，6 h循环液培养组与2、4 h组差异具显著性意义(P<0.01)(见图3)。
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图3 循环液培养大鼠肝细胞的DNA合成
※与对照组比较P<0.01
Fig 3 DNA synthesis of rat hepatocytes cultured in this media
compared with control group,※ P<0.01
3.4 EBLSS循环前后肝细胞的活力
实验前后台盼兰拒染试验显示，球形聚集肝细胞的存活率分别为94%和88%。单个肝细胞的活力则分别为71%和67%。球形体肝细胞置被覆胶原培养板24 h后，贴壁率在91%以上。实验前循环中未检出LDH，6 h后循环液中LDH含量仅为18 IU/L。
4 讨 论
, 百拇医药
与早期非生物型及中间型人工肝相比，生物型人工肝既有解毒代谢作用，又具肝脏特殊的生物合成功能，因而使人工肝支持方法更趋完善[4]。由于目前生物型人工肝的生物材料大多以培养肝细胞为主，因此，能否发挥肝细胞的生物功能是构建这种新型人工肝支持系统的关键，也是评估其支持效果的重要标志。据此衡量本文用混合球形聚集培养肝细胞建立的EBLSS发现，该EBLSS中肝细胞不仅能提供较大量的白蛋白，产生较多的尿素，而且使循环液中总蛋白、甲胎蛋白成倍增加。上述结果显示，所建人肝细胞型EBLSS已具备生物人工肝参与三大物质代谢的基本要求。而该结果的获得，可能与所用肝细胞生命力旺盛、体外增殖能力较强和应用良好的肝细胞消化分离技术以及高活性、高密度球形聚集培养有密切关系。
随着人工肝研究的不断深入和满足支持治疗肝衰竭的需要，生物型人工肝被赋予更高的要求[5]，即在具备参与肝脏解毒代谢和物质转化的同时，不仅能给肝衰竭患者补充白蛋白、凝血因子等物质，而且要给患者肝再生提供必要的肝细胞再生因子(HGF)。为适应这一新的要求，国外学者曾指出[6]生物人工肝理想的肝细胞培养系统应该是肝细胞-肝非实质细胞混合培养系统，因为以kupffer细胞为主的肝非实质细胞是HGF产生的主要场所。基于这一观点，本文EBLSS首次应用了混合球形聚集培养的人肝细胞-肝非实质细胞，虽因技术条件所限，实验未得到该培养系统产生HGF的直接证据，但用3H-TdR掺入法检测发现，EBLSS循环液能明显增加体外培养大鼠肝细胞的DNA合成，间接证明混合培养系统产生分泌了具刺激肝细胞再生的物质，至于该类物质的产生在单独与混合培养时是否存在明显差异，有必要进行深入的探讨。
, http://www.100md.com
除生物材料肝细胞外，EBLSS的另一关键技术为生物反应器，它是肝细胞保持良好的生存状态，与支持FHF患者血液进行有效物质交换，发挥生物人工肝支持治疗作用的重要部位。我们选择目前国外常用的中空纤维型生物反应器，其无数个0.2 μm的滤过孔阻止大分子物质如免疫球蛋白通过，而让中小分子物质自由交流。由实验结果不难看出，该反应器能让肝细胞及其合成产物与循环液之间进行了有效的双向物质交流，且使放置6 h的肝细胞仍保持着较高的生物活性和活力。故它与高活性、高密度球形聚集培养的人肝细胞-肝非实质细胞的结合，将为EBLSS的进一步动物实验以及临床应用奠定基础。
注释：国家“九五”攻关项目(96-920-12-02)
参考文献
1 王英杰.生物人工肝支持系统及其治疗急性肝衰竭的研究进展.国外医学流行病学与传染病学分册，1995；22(6)∶241
, http://www.100md.com
2 Nyberg SL, Peshwa MV, Payne WD et al. Evolution of the bioartificial liver:the need for randomized clinical trials. Am Surg, 1993;166∶512
3 王英杰，李梦东，王宇明等.大鼠肝细胞的简易分离与聚集培养.中华肝脏病杂志，1996；4(3)∶167
4 Shatford RA, Nyberg CL, Meier SJ et al. Artificial liver:a forthcoming attraction. (elsewhere reviews).Hepatology, 1993；17∶1163
5 Uchin J, Matsushita M. Artificial liver:strategies for the rescue of patients with liver failure. J ASAIO,1994；40∶74
6 Nyberg SL, Shatford RA, Hu WS. Hepatocyte culture systems for artificial liver support:Implications for critical care medicine (bioartificial liver support).Crit Care Med,1992;20∶1157
收稿：1998-02-11, 百拇医药
单位：第三军医大学 西南医院，重庆 400038
关键词：人工肝；肝细胞；生物合成
生物医学工程学杂志990205 摘要 用2×108个混合聚集球形培养的人肝细胞、肝非实质细胞与中空纤维型生物反应器组成体外生物人工肝支持系统(EBLSS)，通过循环液(PRIM 1640)中肝细胞合成分泌产物的分析，评价其生物功能。结果表明，经过6 h的体外循环，循环液中总蛋白、白蛋白、甲胎蛋白和尿素含量均显著增加，该循环液使体外培养大鼠肝细胞DNA合成率显著增加(与对照组比较P<0.01)，实验后球形体肝细胞仍保持良好的活力。提示由培养人肝细胞和中空纤维型生物反应器组成的体外生物人工肝具备肝脏生物合成功能，并有刺激肝细胞增殖的能力。
Study on the Biologic Function of Extracorporeal
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Bioartificial Liver Support System
Wang Yingjie Li Mengdong Wang Yuming
Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038
Abstract In this study, a total of 2×108 hepatoctyes and nonparenchymal liver cells cultrued as aggregate spheroids and a hollow fiber bioreactor were used to set up the extracorporeal bioartificial liver support system (EBLSS).Its function was determined throungh the analysis of some cells production.After 6 hours circulating of EBLSS, the total protein, albumin, alpha-fetoprotein and urea were markedly increased in the circulating media, and the DNA synthesis of rat hepatocytes cultured in the media was significantly increased (compared with control group,P<0.01).This suggests that the EBLSS which consists of cultured human liver cells and hollow fiber bioreactor has the biologic function of liver and has a stimulative action on the proliferation of hepatocytes.
, 百拇医药
Key words Artificial liver Liver cells Function
1 引 言
生物人工肝是近年来暴发性肝衰竭(FHF)治疗研究的热门课题之一，由于这种新型的人工肝系统以培养肝细胞为生物材料，性能明显优于早期非生物型人工肝，具有良好的应用前景，因而受到广泛关注[1，2]。我们在成功建立肝细胞球形聚集培养的基础上[3]，用中空纤维型生物反应器与混合培养的人肝细胞-肝非实质细胞共同构成体外生物人工肝支持系统(EBLSS)，对其生物合成功能进行了初步研究，现将有关结果报道如下。
2 材料与方法
2.1 肝细胞的分离与聚集培养
肝组织源于非肝病死亡的供肝者，以体外简易两步灌流法分离肝细胞，胶原酶(Sigma产品)消化后，采用差速离心法反复三次离心，获取肝细胞和肝非实质细胞，台盼兰染色示细胞存活率在95%以上。两种细胞按2∶1混合，综合应用旋转振荡、激素限定培养液和贴壁抑制剂被覆培养瓶等方法，进行肝细胞与肝非实质细胞混合多细胞球形聚集培养[3]。
, 百拇医药
2.2 EBLSS的构成
以中空纤维管为生物反应器(Neuzil博士惠赠)，该管由二百多根平行排列的多孔质中空纤维组成，纤维管壁滤过孔径0.2 μm。反应器内腔体积40 ml，外腔16 ml，纤维壁表面积约600 cm2。反应器外腔放置球形聚集培养的肝细胞，内腔经医用硅胶管与蠕动泵、循环液贮池(容积150 ml)相连通，整个装置为一闭合循环系统。实验取培养4 d的混合聚集球形体肝细胞、肝非实质细胞(量约2×108)，连同细胞培养液一起移入反应器，置37 ℃、5%的CO2条件下，反复旋转反应器使肝细均分布。
2.3 EBLSS生物合成产物的分析
将EBLSS置于37 ℃条件下，以30 ml/min的速度循环反应器内腔和贮池内RPMI 1640液，共6 h，定时吸取少量循环液，用Beckman自动生化分析仪检测其中白蛋白、总蛋白和尿素的含量，用火箭免疫电泳法测定甲胎蛋白的分泌量，同时以3H-TdR掺入法观察循环液对体外培养大鼠肝细胞DNA合成率的影响。
, 百拇医药
2.4 EBLSS肝细胞的活力观察
于EBLSS循环前后，用台盼兰拒染实验鉴定肝细胞的存活率，以自然沉降法观察球形聚集肝细胞在被覆I型胶原培养板上的贴壁能力，并用生化分析法检测循环液中肝细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)量。
3 结 果
3.1 EBLSS的蛋白合成
动态检测结果显示，循环液中白蛋白、总蛋白的含量随EBLSS运转时间延长而显著增加，而原始(未循环)RPMI 1640未检出白蛋白和总蛋白(图1)。
图1 EBLSS白蛋白、总蛋白变化
Fig 1 Changes of total protein and albumin of EBLSS
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循环液中甲胎蛋白的含量变化与白蛋白、总蛋白相似。0、2、4、6 h的浓度分别为<31、125、125、250 μg/L。
3.2 EBLSS循环液中尿素的含量变化
EBLSS循环液中尿素的含量亦随运行时间而明显增加(见图2)。
图2 EBLSS循环液中尿素的变化
Fig 2 Changes of urea of EBLSS
3.3 EBLSS循环液对培养大鼠肝细胞DNA合成的影响
用EBLSS循环2、4、6 h及未循环的RPMI 1640液培养大鼠肝细胞(接种浓度1×105/ml)，检测48 h后的3H-TdR掺入量显示，循环液组培养肝细胞的3H-TdR掺入量显著高于未循环RPMI 1640对照组(P<0.01)，不同循环时间组培养肝细胞的3H-TdR掺入量也有差异，其中，6 h循环液培养组与2、4 h组差异具显著性意义(P<0.01)(见图3)。
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图3 循环液培养大鼠肝细胞的DNA合成
※与对照组比较P<0.01
Fig 3 DNA synthesis of rat hepatocytes cultured in this media
compared with control group,※ P<0.01
3.4 EBLSS循环前后肝细胞的活力
实验前后台盼兰拒染试验显示，球形聚集肝细胞的存活率分别为94%和88%。单个肝细胞的活力则分别为71%和67%。球形体肝细胞置被覆胶原培养板24 h后，贴壁率在91%以上。实验前循环中未检出LDH，6 h后循环液中LDH含量仅为18 IU/L。
4 讨 论
, 百拇医药
与早期非生物型及中间型人工肝相比，生物型人工肝既有解毒代谢作用，又具肝脏特殊的生物合成功能，因而使人工肝支持方法更趋完善[4]。由于目前生物型人工肝的生物材料大多以培养肝细胞为主，因此，能否发挥肝细胞的生物功能是构建这种新型人工肝支持系统的关键，也是评估其支持效果的重要标志。据此衡量本文用混合球形聚集培养肝细胞建立的EBLSS发现，该EBLSS中肝细胞不仅能提供较大量的白蛋白，产生较多的尿素，而且使循环液中总蛋白、甲胎蛋白成倍增加。上述结果显示，所建人肝细胞型EBLSS已具备生物人工肝参与三大物质代谢的基本要求。而该结果的获得，可能与所用肝细胞生命力旺盛、体外增殖能力较强和应用良好的肝细胞消化分离技术以及高活性、高密度球形聚集培养有密切关系。
随着人工肝研究的不断深入和满足支持治疗肝衰竭的需要，生物型人工肝被赋予更高的要求[5]，即在具备参与肝脏解毒代谢和物质转化的同时，不仅能给肝衰竭患者补充白蛋白、凝血因子等物质，而且要给患者肝再生提供必要的肝细胞再生因子(HGF)。为适应这一新的要求，国外学者曾指出[6]生物人工肝理想的肝细胞培养系统应该是肝细胞-肝非实质细胞混合培养系统，因为以kupffer细胞为主的肝非实质细胞是HGF产生的主要场所。基于这一观点，本文EBLSS首次应用了混合球形聚集培养的人肝细胞-肝非实质细胞，虽因技术条件所限，实验未得到该培养系统产生HGF的直接证据，但用3H-TdR掺入法检测发现，EBLSS循环液能明显增加体外培养大鼠肝细胞的DNA合成，间接证明混合培养系统产生分泌了具刺激肝细胞再生的物质，至于该类物质的产生在单独与混合培养时是否存在明显差异，有必要进行深入的探讨。
, http://www.100md.com
除生物材料肝细胞外，EBLSS的另一关键技术为生物反应器，它是肝细胞保持良好的生存状态，与支持FHF患者血液进行有效物质交换，发挥生物人工肝支持治疗作用的重要部位。我们选择目前国外常用的中空纤维型生物反应器，其无数个0.2 μm的滤过孔阻止大分子物质如免疫球蛋白通过，而让中小分子物质自由交流。由实验结果不难看出，该反应器能让肝细胞及其合成产物与循环液之间进行了有效的双向物质交流，且使放置6 h的肝细胞仍保持着较高的生物活性和活力。故它与高活性、高密度球形聚集培养的人肝细胞-肝非实质细胞的结合，将为EBLSS的进一步动物实验以及临床应用奠定基础。
注释：国家“九五”攻关项目(96-920-12-02)
参考文献
1 王英杰.生物人工肝支持系统及其治疗急性肝衰竭的研究进展.国外医学流行病学与传染病学分册，1995；22(6)∶241
, http://www.100md.com
2 Nyberg SL, Peshwa MV, Payne WD et al. Evolution of the bioartificial liver:the need for randomized clinical trials. Am Surg, 1993;166∶512
3 王英杰，李梦东，王宇明等.大鼠肝细胞的简易分离与聚集培养.中华肝脏病杂志，1996；4(3)∶167
4 Shatford RA, Nyberg CL, Meier SJ et al. Artificial liver:a forthcoming attraction. (elsewhere reviews).Hepatology, 1993；17∶1163
5 Uchin J, Matsushita M. Artificial liver:strategies for the rescue of patients with liver failure. J ASAIO,1994；40∶74
6 Nyberg SL, Shatford RA, Hu WS. Hepatocyte culture systems for artificial liver support:Implications for critical care medicine (bioartificial liver support).Crit Care Med,1992;20∶1157
收稿：1998-02-11, 百拇医药