血浆蛋白质在生物材料表面吸附时的Vroman效应
作者：黄 嘉 乐以伦 郑昌琼
单位：黄 嘉 乐以伦(四川大学 西区高分子材料系生物及生物技术研究所，成都 610065)；郑昌琼(四川大学 生物医学工程研究所，成都 610065)
关键词：血浆蛋白；吸附；Vroman效应
生物医学工程学杂志990326 摘要 以吸附时间，血浆稀释倍数，狭窄空间的高度为变量研究纤维蛋白原(Fg)从血浆吸附到生物材料表面时，会发现Fg的吸附出现一最大值，此即Vroman效应。研究证实Vroman效应并非纤维蛋白原所独有的现象，而是一普遍现象，它反映了血浆中的蛋白质对表面有限位点的竞争吸附。我们综述了影响血浆蛋白质在生物材料表面吸附时的Vroman效应的实验因素，Vroman效应的机理以及Vroman效应对于研究血液-材料相互作用的意义。
Vroman Effect of Plasma Protein Adsorption to
, 百拇医药
Biomaterials Surfaces
Huang Jia1 Yue Yilun1 Zheng Changqiong2
1(Biomaterials and Biotechnology Institute, Department of Polymer Materials and Sciences,Sichuan University,Chengdu 610065)
2(Biomedical Engineering Institute, Sichuan University,Chengdu 610065)
Abstract Fibrinogen adsorption from plasma to biomaterials surfaces passes through a maximum when studied as a function of adsorption time, plasma concerntration, or column height in narrow spaces and these are called Vroman effect. Studies have demonstrated that Vroman effect is a general phenomenon of plasma proteins and reflects the competitive adsorption of plasma proteins for a limited number of surface sites. In this paper,the factors affecting Vroman effect, the relationship between contact activation and fibrinogen displacement, and the significance of the Vroman effect with respect to blood-material interactions are reviewed.
, 百拇医药
Key words Plasma protein Adsorption Vroman effect
1 前 言
生物材料与血浆接触后，血浆蛋白质迅速吸附到材料表面，并且影响随后的血细胞粘附和活化[1]，特别是影响参与在材料表面形成血栓的血小板的粘附[2]。由于血液(血浆)中含有100种以上不同的蛋白质，所以只有最重要的种类(包括某些痕量蛋白)才得以深入研究。最引起研究者兴趣的是纤维蛋白原(Fg)的吸附。Fg是血浆中含量较大的一种蛋白质(2～4 mg/ml)，在血液凝固中起中心作用，通过它与血小板膜上的糖蛋白(Gp)Ⅱb-Ⅲa受体结合而使血小板粘附和聚集[3]。
1969年Leo Vroman和他的同事观察Fg从血浆中向玻璃、阳极化钽和氧化硅表面吸附时，发现Fg会经历一种变化，它在和表面接触后的几秒或几分钟内，难于用免疫学手段检测出来[4]。它与抗Fg血清的反应性的丧失，被冠以“conversion”(反转)一词，是“Vroman”效应的最早描述。Vroman和他的同事由于受检测手段的限制而不能对造成反转的可能原因加以区别。免疫反应性的丧失，可能是由于在固体表面固定、或吸附的Fg被其他血浆蛋白质置换、或吸附的Fg被如血纤维蛋白溶酶等酶分解、或被吸附的其他蛋白质掩蔽等原因而使Fg的结构与定向发生改变，从而使其抗原决定簇的反应性改变。后两种原因会引起吸附蛋白膜的厚度明显变化，但事实上并未发现明显的膜厚度变化，所以“反转”可能的原因是：(1)吸附的Fg结构改变而引起抗血清反应性降低；(2)Fg被一种或多种不同的血浆蛋白置换。以后，许多研究者用125I标记Fg和酶联免疫分析(ELISA)技术研究Fg吸附时，都观察到 开始吸附的Fg被血浆中与表面有较高亲合力的蛋白质置换的现象[5～9]。血浆与固体表现短时间接触后，Fg的吸附迅速增加，然后经历一最大值，最后到达稳态时的吸附量，远低于最大值。如果吸附时间不变，而将血浆稀释为不同浓度，最大Fg吸附发生在中等血浆浓度处。将一凸透镜放在一平玻片上，如果时间与血浆浓度均保持恒定，吸附发生在平面和凸透镜之间的狭窄空间，Fg的最大吸附为一环形，而这环形的位置，与血浆溶液的纵向高度和与中心的距离有关。Fg吸附的最大值是吸附时间、血浆稀释倍数以及狭窄空间的纵向高度的函数，“Vroman效应”一词可用来描述以上三种情况。虽然许多材料都发现有Vroman效应，但Fg被置换的程度(量)变化很大。并且有些基材，如磺化PU和含大量HEMA的共聚物不随血浆稀释倍数的变化而出现最大吸收峰。
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2 影响血浆纤维蛋白原向生物材料表面吸附的因素
影响血浆Fg吸附的因素有：(1)材料表面性能；(2)吸附时间；(3)血浆稀释倍数；(4)温度；(5)缓冲液。因为只有考虑了Fg从血浆中吸附到材料表面时这些影响因素的作用才能正确理解不同实验所得结果。
对于一些材料，Fg从血浆中吸附到材料表面的吸附量，随时间增加仅微有增加。吸附与置换有时发生得很快，特别是用未稀释的血浆时，吸附Fg的量似乎不随时间而改变。血浆稀释后与表面接触，Fg吸附速率与随后Fg的置换会有所降低。稀释倍数很高的血浆，观察不到Fg置换；且Fg吸附随时间变化的过程，与未稀释血浆的Fg吸附过程类似，但吸附量大大降低。不同吸附时间的吸附等温线和Fg的吸附峰值不同，时间越长，峰值越小，且血浆稀释倍数越高峰值出现越小。已研究过的生物材料包括玻璃、PU(如Biomer、Tecoflex)，HEMA和EMA共聚物，硅橡胶、PVC和PE等。疏水性材料如PS和PEMA上血浆稀释倍数较小处Fg吸附量较大，且最大吸附值通常发生在血浆稀释倍数较小处，而不是发生在血浆浓度较大处。不同研究者对相同材料吸附Fg的量有不相同的报道[6，21]，这是由于所用的实验条件如吸附时间、温度不同所致。将Fg吸附量与表面性能，如润湿性或接触角相联系的尝试并不成功[6]。Vroman与Adames[4]注意到氧化硅上Fg的“反转”在37 ℃时比在10 ℃或25 ℃时发生得快得多，并且程度也较明显。温度也强烈影响PE与玻璃从血浆和纯溶液中Fg的吸附[8]。从血浆中Fg吸附到玻璃上的量，在25 ℃时比在37 ℃时明显增大，可能是置换Fg的作用被低温所抑制。另一种解释是，酶如血浆蛋白酶对Fg的蛋白水解作用在25 ℃被抑制，所以导致吸附的Fg的量增加，但这一解释与以下研究有冲突，即Fg在正常血浆中和在无纤维蛋白溶酶原的血浆中，从玻璃上被置换下来的情况是类似的。血浆稀释剂对Fg吸附的影响，使Fg吸附与被置换过程进一步复杂化。例如，Tris缓冲液稀释血浆比柠檬酸-磷酸缓冲生理盐水稀释血浆所吸附到玻璃上的Fg量多一倍[8]。
, 百拇医药
基于以上总结，我们知道有许多因素影响Fg吸附到合成材料上。因此，对Fg吸附测定(从纯溶液和从血浆中)的报道进行对比时，必须考虑不同实验室所用的不同实验条件。
3 内源性凝血蛋白质在Vroman效应中的作用
带负电的材料，如玻璃和高岭土，可通过内源性途径(或接触相途径)引发血液凝固。机理是吸附的因子ⅩⅡ(Hageman因子)的自激活，然后ⅩⅡa蛋白水解，又激活另两个凝血因子：前激肽释放酶(PK)和因子Ⅺ，使其变为酶活性形式的激肽释放酶和因子Ⅺa。另一蛋白质，高分子量激肽原(HMWK)与PK和因子Ⅺ形成复合物而循环，并帮助这两种因子在材料表面定位，从而被因子ⅩⅡa激活。新形成的激肽释放酶对系统施以正反馈，能产生更多的因子ⅩⅡa。近来还发现通过激肽释放酶和/或因子ⅩⅡa蛋白水解，切断HMWK而产生的两条链的HMWK活化形式(HMWKa)，对带负电荷表面有较大亲合力，从而有更大的促凝血活性。
, 百拇医药 Vroman和他的同事报道，当用天然缺乏HMWK的血浆作吸附实验时，材料吸附Fg的“反转”大大延缓[10]。他们进一步报道用无因子ⅩⅡ的血浆时，“反转”作用稍有延缓；而用无因子Ⅺ或PK的血浆时，“反转”与往常一样。Slack等人也证明玻璃与PE的Vroman峰不受缺PK的影响。Schmaier等人证明缺HMWK血浆中观察到的“反转”现象，可通过加入纯化HMWK而扭转[11]。Scott等人发现蛋白水解活化的HMWK(HMWKa)比未断裂形式HMWK对高岭土有更高亲合力，Fg的吸附可抑制HMWK吸附而非HMWKa对高岭土的吸附。Vroman等人对HMWK在Fg置换中HMWK的作用提供了更多的证据[5]，他们测定Fg在载玻片和凸透镜体系中的沉积，所用的是正常和缺HMWK的血浆，血浆注入玻璃载玻片和凸透镜形成的狭窄空间里，停留一段时间，洗掉，最后用抗血清测Fg值。在最狭窄处，有Fg存在，距中心很远处，很少或无Fg。他们解释说在很狭窄的区域，有足够的Fg涂复于玻璃上，但由于HMWK在血浆中浓度很小不足以置换Fg。在空隙较大处，两种蛋白质都足够，HMWK置换先吸附上的Fg。与正常血浆相比，用无HMWK血浆时，从中心到观察不到Fg吸附的位点之间的距离增大。Poot等[12]用抗体和两步ELISA法检测吸附的Fg，也表明HMWK在置换从血浆中吸附到玻璃上的Fg时起作用。然而对PE，观察不到HMWK的作用，有研究表明低密度脂蛋白(LDL)与某些表面Fg低吸附量有关[12]，也有人认为高密度脂蛋白(HDL)的优先吸附是表面Fg吸附量低的原因[13]。
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总之，这些观察均表明HMWKa对Fg从负电荷表面上被置换起着主要作用。因此，Vroman效应和接触活化之间的关系，使生物材料领域的研究者面临一种矛盾。一方面，因为Vroman效应被引发，正常血浆中Fg对材料的吸附量逐渐减少，这暗示内源性凝血途径被引发。另一方面，吸附Fg的减少表明材料将粘附较少的血小板而使促凝血性降低[14]。因此，对材料血液相容性的评价，依据有所不同，这要看内源性凝血系统的引发和血小板粘附二者哪一个是最重要的决定因素。
尽管大量证据显示在置换吸附的Fg中，接触相凝血因子起了作用，但Brash等人[15]的研究却证明即使用天然缺HMWK的血浆，在某一浓度范围内也可以清楚地观察到玻璃上的Vroman效应，只是置换的Fg的量比正常血浆少。这一结果说明：“血浆中其他成分也可置换Fg”。事实上，有研究表明某些生物材料的Vroman效应中，接触相因子起着很小的作用。首先，Slack等人证明Fg在硅橡胶和PE上的吸附，对于正常和缺HMWK的血浆无区别。因为这些材料不会激活内源性途径至能引起血凝的程度，即HMWKa的产生很少，然而这两种血浆都有明显的Vroman效应，当血浆浓度约为1%时有一最大吸附峰。其次，由于许多被认为是不易引发内源性途径的疏水性材料也有Vroman峰，故似乎接触活化不是材料表现出Vroman效应的必要条件。例如，近来的研究表明一种广泛用于口腔的钛合金，与血浆接触时表现出Vroman效应，但与带负电荷的玻璃参照物相比，内源凝血途径的活化程度很小。Elwing和他的同事[16]表明在疏水性表面没有发现Fg被HMWK置换的过程。他们将硅片作特殊处理产生润湿性梯度，然后置于血浆中1 min或1 hr。用椭圆偏振光法和Fg抗血清免疫检测法，观察到1 hr与1 min相比，抗Fg结合在硅片的疏水性尾部减少了，但这一减少并非伴随抗HMWK结合的增加。反之，1 hr后硅片的亲水性尾部抗Fg结合的减少，伴随有相应的抗HMWK结合的增加。结论是HMWK对亲水表面Fg的置换起作用，而血浆中其他成分对疏水表面上Fg的置换也起作用。Vroman与其他人发现：HMWK活化产生的HMWKa置换Fg的过程，是在室温下发生的。由于考虑到酶活性受温度影响，Slack等人对比了正常和缺HMWK血浆中Fg对玻璃在25 ℃和37 ℃的吸附。25 ℃时，无HMWK血浆比正常血浆有更多的Fg吸附到玻璃上，这与以往研究一致，而37 ℃时却没有区别。由于在生理温度，HMWKa对Fg从血浆中吸附到玻璃上无影响，故37 ℃时接触活化与Vroman的关系尚待仔细研究。
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接触活化因子对Vroman效应并非必须条件的最明显证据来自二元和三元蛋白溶液。研究之一是将Fg和氧合血红蛋白或牛血清白蛋白混合，然后Fg从一系列不同稀释倍数的二元溶液中吸附到PE上。当竞争蛋白/Fg的比例增加，Fg的最大吸附峰向低稀释倍数移动。抑制Fg吸附所需的氧合血红蛋白量比白蛋白量少。在另一研究中[13]，PS和PVC置于白蛋白(Alb)，免疫球蛋白(IgG)和Fg不同稀释度的三元混合液中，用免疫技术测定。奇怪的是，Alb和IgG，而非Fg在血浆中等稀释倍数时，有最大吸附。还测量了不同稀释倍数的血浆中相同蛋白质在PC和PVC上的吸附，证明每种蛋白质都有Vroman效应。二、三元蛋白溶液竞争研究的结果反映了不同表面亲合力的各种蛋白质对有限吸附位点竞争是一致的。这并非意味着接触活化蛋白不会或不能置换吸附的Fg；事实上，由于它们在引发表面凝血中的作用，可以知道它们对表面有很高的亲合力，特别是对于带负电荷的表面。然而根据目前的研究结果，至少在生理温度下它们对置换是Fg的作用是较小的，而其他蛋白主要负责置换Fg，尤其在疏水材料表面。
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总之，Fg被置换是Fg与具有不同浓度和表面亲合力的各种血浆蛋白质共同作用的结果。因此，除Fg外的蛋白质也应会从复杂蛋白质混合液如血浆中表现最大吸附。这已被几种其他蛋白质，包括Alb，IgG[13]所证实。而且，Grinnell等人发现纤维连结蛋白(Fn)吸附到用于组织培养的PS[17]和玻璃[18]时，在中等血清稀释倍数处有最大吸附。所以，Vroman效应是一反映蛋白质对有限位点的竞争吸附的普遍现象，而非单独针对Fg或内源凝血途径引发的效应。
4 吸附的纤维蛋白原和其他蛋白质的转变
许多实验室已证明蛋白质分子在吸附到表面后发生重排(rearrangement)。这种转变对Vroman效应是很重要的，因为它们影响蛋白质结合的紧密程度。此外，重排会改变吸附的粘附蛋白的生物活性。结合紧密程度的增加和生物活性的调整受吸附后放置时间、表面化学和共吸附蛋白等因素的影响。
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酶活性的丧失[19]、用各种表面活性剂洗脱材料吸附Fg的量，随放置时间的延长而减少[20]、血浆成分置换Fg的能力随时间的延长而降低[21]、单克隆抗体识别新抗原决定簇的表达[22]等现象均显示吸附蛋白会重排。研究发现，吸附到PE上的Fg随放置时间的延长很快变得不易被血浆置换，而HEMA/EMA共聚物上这种现象发生速率很慢。这些区别可能反应Fg与不同疏水性表面相互作用的本质。从纯Fg溶液和血浆中吸附到某些表面的Fg，也会依时性地出现用SDS表面活性剂洗脱时洗脱率下降。此外，吸附的Fg和Alb酰胺键Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的频率随时间改变[23]。随放置时间的延长，血小板和抗体结合到吸附的Fg上的量减少，也表明吸附的Fg的生物活性改变[24]。溶液中加入Alb，可使Fg的生物活性不随放置时间的延长而丧失。
生物材料表面引起吸附的Fg转变与Vroman效应有关。原因是：(1)转变使Fg与表面的连结更紧密，从而不易被置换；(2)不同生物材料表面的Fg重排速率不同，表明具有不同表面化学的生物材料上Fg的Vroman效应的不同与Fg的重排有关。
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5 Vroman效应的数学模型
蛋白质对固体材料表面的吸附，传统上用Langmuir和Freundlich吸附等温公式来描述[25]。有时，Freundlich等温吸附更精确描写蛋白吸附数据，然而由于可逆吸附和吸附分子之间无相互作用的假设，在蛋白质体系中并不正确，故两种模型都不是真实的。
由于必须考虑Fg被置换和Fg对血浆稀释倍数和材料表面化学的依赖性，对Vroman效应所作的数字模型便面临一新问题。由于不同材料吸附Fg的量，以及最大吸收峰处血浆的稀释倍数变化很大，任何一种Vroman效应模型都应考虑Fg与材料的相互作用。因此，蛋白伸展过程，即Fg(还有其他蛋白质)使其自身与表面的接触最大化而引起的吸附蛋白质的转变，导致蛋白质与表面更紧密的结合，应是解释Fg被置换的出发点。以这种解释置换过程的理论为基础，得到了将吸附、转变和置换连结不牢的Fg这三个过程包括在内的经验公式[11]。许多可能置换Fg的血浆蛋白质均简单处理为一种“假设”蛋白质，它与表面的亲合力与血浆蛋白的累积亲合力相同。将实验数据代入相关公式得到不同生物材料的蛋白质转变速率常数值有很大的不同，这有助于解释不同材料上Vroman效应的不同。另一个解释Vroman效应的数学模型是假设吸附和解吸速率常数取决于表面总的蛋白浓度，并引入相互作用参数来描述吸附的蛋白质分子之间的排斥与/或吸引力。用计算机模拟可获得蛋白吸附的最大值，并且根据相互作用参数的值，可定性地解释血浆稀释倍数对吸附的Fg量的影响。由同一研究小组所作的Monte Carlo模拟表明：随着蛋白质占有的表面积增加，有吸附速率下降的现象，且不同的蛋白质的区别很大，通过将表面排斥效果和吸附蛋白的平行迁移考虑在内，能更好地解释Vroman效应。
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6 结束语
Fg与其他血浆蛋白质对生物材料表面的吸附，以及Vroman效应一直吸引着研究血液-材料相互作用情况的科学家。对Vroman效应的研究可以为开发新的血液相容性生物材料提供可靠的理论指导。虽然在过去二十多年中对Vroman效应的本质研究有了许多重要的发现，但仍有许多尚待弄清的问题。未来的研究方向应放在Fg构相变化与血小板粘附的关系、材料表面特征对吸附的Fg构相变化的影响等方面。从分子水平去研究Vroman效应，并辅以更严密的数学模型，将会有利于进一步理解血液-材料相互作用的本质。
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(收稿：1998-08-31), 百拇医药
单位：黄 嘉 乐以伦(四川大学 西区高分子材料系生物及生物技术研究所，成都 610065)；郑昌琼(四川大学 生物医学工程研究所，成都 610065)
关键词：血浆蛋白；吸附；Vroman效应
生物医学工程学杂志990326 摘要 以吸附时间，血浆稀释倍数，狭窄空间的高度为变量研究纤维蛋白原(Fg)从血浆吸附到生物材料表面时，会发现Fg的吸附出现一最大值，此即Vroman效应。研究证实Vroman效应并非纤维蛋白原所独有的现象，而是一普遍现象，它反映了血浆中的蛋白质对表面有限位点的竞争吸附。我们综述了影响血浆蛋白质在生物材料表面吸附时的Vroman效应的实验因素，Vroman效应的机理以及Vroman效应对于研究血液-材料相互作用的意义。
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Huang Jia1 Yue Yilun1 Zheng Changqiong2
1(Biomaterials and Biotechnology Institute, Department of Polymer Materials and Sciences,Sichuan University,Chengdu 610065)
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Abstract Fibrinogen adsorption from plasma to biomaterials surfaces passes through a maximum when studied as a function of adsorption time, plasma concerntration, or column height in narrow spaces and these are called Vroman effect. Studies have demonstrated that Vroman effect is a general phenomenon of plasma proteins and reflects the competitive adsorption of plasma proteins for a limited number of surface sites. In this paper,the factors affecting Vroman effect, the relationship between contact activation and fibrinogen displacement, and the significance of the Vroman effect with respect to blood-material interactions are reviewed.
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Key words Plasma protein Adsorption Vroman effect
1 前 言
生物材料与血浆接触后，血浆蛋白质迅速吸附到材料表面，并且影响随后的血细胞粘附和活化[1]，特别是影响参与在材料表面形成血栓的血小板的粘附[2]。由于血液(血浆)中含有100种以上不同的蛋白质，所以只有最重要的种类(包括某些痕量蛋白)才得以深入研究。最引起研究者兴趣的是纤维蛋白原(Fg)的吸附。Fg是血浆中含量较大的一种蛋白质(2～4 mg/ml)，在血液凝固中起中心作用，通过它与血小板膜上的糖蛋白(Gp)Ⅱb-Ⅲa受体结合而使血小板粘附和聚集[3]。
1969年Leo Vroman和他的同事观察Fg从血浆中向玻璃、阳极化钽和氧化硅表面吸附时，发现Fg会经历一种变化，它在和表面接触后的几秒或几分钟内，难于用免疫学手段检测出来[4]。它与抗Fg血清的反应性的丧失，被冠以“conversion”(反转)一词，是“Vroman”效应的最早描述。Vroman和他的同事由于受检测手段的限制而不能对造成反转的可能原因加以区别。免疫反应性的丧失，可能是由于在固体表面固定、或吸附的Fg被其他血浆蛋白质置换、或吸附的Fg被如血纤维蛋白溶酶等酶分解、或被吸附的其他蛋白质掩蔽等原因而使Fg的结构与定向发生改变，从而使其抗原决定簇的反应性改变。后两种原因会引起吸附蛋白膜的厚度明显变化，但事实上并未发现明显的膜厚度变化，所以“反转”可能的原因是：(1)吸附的Fg结构改变而引起抗血清反应性降低；(2)Fg被一种或多种不同的血浆蛋白置换。以后，许多研究者用125I标记Fg和酶联免疫分析(ELISA)技术研究Fg吸附时，都观察到 开始吸附的Fg被血浆中与表面有较高亲合力的蛋白质置换的现象[5～9]。血浆与固体表现短时间接触后，Fg的吸附迅速增加，然后经历一最大值，最后到达稳态时的吸附量，远低于最大值。如果吸附时间不变，而将血浆稀释为不同浓度，最大Fg吸附发生在中等血浆浓度处。将一凸透镜放在一平玻片上，如果时间与血浆浓度均保持恒定，吸附发生在平面和凸透镜之间的狭窄空间，Fg的最大吸附为一环形，而这环形的位置，与血浆溶液的纵向高度和与中心的距离有关。Fg吸附的最大值是吸附时间、血浆稀释倍数以及狭窄空间的纵向高度的函数，“Vroman效应”一词可用来描述以上三种情况。虽然许多材料都发现有Vroman效应，但Fg被置换的程度(量)变化很大。并且有些基材，如磺化PU和含大量HEMA的共聚物不随血浆稀释倍数的变化而出现最大吸收峰。
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2 影响血浆纤维蛋白原向生物材料表面吸附的因素
影响血浆Fg吸附的因素有：(1)材料表面性能；(2)吸附时间；(3)血浆稀释倍数；(4)温度；(5)缓冲液。因为只有考虑了Fg从血浆中吸附到材料表面时这些影响因素的作用才能正确理解不同实验所得结果。
对于一些材料，Fg从血浆中吸附到材料表面的吸附量，随时间增加仅微有增加。吸附与置换有时发生得很快，特别是用未稀释的血浆时，吸附Fg的量似乎不随时间而改变。血浆稀释后与表面接触，Fg吸附速率与随后Fg的置换会有所降低。稀释倍数很高的血浆，观察不到Fg置换；且Fg吸附随时间变化的过程，与未稀释血浆的Fg吸附过程类似，但吸附量大大降低。不同吸附时间的吸附等温线和Fg的吸附峰值不同，时间越长，峰值越小，且血浆稀释倍数越高峰值出现越小。已研究过的生物材料包括玻璃、PU(如Biomer、Tecoflex)，HEMA和EMA共聚物，硅橡胶、PVC和PE等。疏水性材料如PS和PEMA上血浆稀释倍数较小处Fg吸附量较大，且最大吸附值通常发生在血浆稀释倍数较小处，而不是发生在血浆浓度较大处。不同研究者对相同材料吸附Fg的量有不相同的报道[6，21]，这是由于所用的实验条件如吸附时间、温度不同所致。将Fg吸附量与表面性能，如润湿性或接触角相联系的尝试并不成功[6]。Vroman与Adames[4]注意到氧化硅上Fg的“反转”在37 ℃时比在10 ℃或25 ℃时发生得快得多，并且程度也较明显。温度也强烈影响PE与玻璃从血浆和纯溶液中Fg的吸附[8]。从血浆中Fg吸附到玻璃上的量，在25 ℃时比在37 ℃时明显增大，可能是置换Fg的作用被低温所抑制。另一种解释是，酶如血浆蛋白酶对Fg的蛋白水解作用在25 ℃被抑制，所以导致吸附的Fg的量增加，但这一解释与以下研究有冲突，即Fg在正常血浆中和在无纤维蛋白溶酶原的血浆中，从玻璃上被置换下来的情况是类似的。血浆稀释剂对Fg吸附的影响，使Fg吸附与被置换过程进一步复杂化。例如，Tris缓冲液稀释血浆比柠檬酸-磷酸缓冲生理盐水稀释血浆所吸附到玻璃上的Fg量多一倍[8]。
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基于以上总结，我们知道有许多因素影响Fg吸附到合成材料上。因此，对Fg吸附测定(从纯溶液和从血浆中)的报道进行对比时，必须考虑不同实验室所用的不同实验条件。
3 内源性凝血蛋白质在Vroman效应中的作用
带负电的材料，如玻璃和高岭土，可通过内源性途径(或接触相途径)引发血液凝固。机理是吸附的因子ⅩⅡ(Hageman因子)的自激活，然后ⅩⅡa蛋白水解，又激活另两个凝血因子：前激肽释放酶(PK)和因子Ⅺ，使其变为酶活性形式的激肽释放酶和因子Ⅺa。另一蛋白质，高分子量激肽原(HMWK)与PK和因子Ⅺ形成复合物而循环，并帮助这两种因子在材料表面定位，从而被因子ⅩⅡa激活。新形成的激肽释放酶对系统施以正反馈，能产生更多的因子ⅩⅡa。近来还发现通过激肽释放酶和/或因子ⅩⅡa蛋白水解，切断HMWK而产生的两条链的HMWK活化形式(HMWKa)，对带负电荷表面有较大亲合力，从而有更大的促凝血活性。
, 百拇医药 Vroman和他的同事报道，当用天然缺乏HMWK的血浆作吸附实验时，材料吸附Fg的“反转”大大延缓[10]。他们进一步报道用无因子ⅩⅡ的血浆时，“反转”作用稍有延缓；而用无因子Ⅺ或PK的血浆时，“反转”与往常一样。Slack等人也证明玻璃与PE的Vroman峰不受缺PK的影响。Schmaier等人证明缺HMWK血浆中观察到的“反转”现象，可通过加入纯化HMWK而扭转[11]。Scott等人发现蛋白水解活化的HMWK(HMWKa)比未断裂形式HMWK对高岭土有更高亲合力，Fg的吸附可抑制HMWK吸附而非HMWKa对高岭土的吸附。Vroman等人对HMWK在Fg置换中HMWK的作用提供了更多的证据[5]，他们测定Fg在载玻片和凸透镜体系中的沉积，所用的是正常和缺HMWK的血浆，血浆注入玻璃载玻片和凸透镜形成的狭窄空间里，停留一段时间，洗掉，最后用抗血清测Fg值。在最狭窄处，有Fg存在，距中心很远处，很少或无Fg。他们解释说在很狭窄的区域，有足够的Fg涂复于玻璃上，但由于HMWK在血浆中浓度很小不足以置换Fg。在空隙较大处，两种蛋白质都足够，HMWK置换先吸附上的Fg。与正常血浆相比，用无HMWK血浆时，从中心到观察不到Fg吸附的位点之间的距离增大。Poot等[12]用抗体和两步ELISA法检测吸附的Fg，也表明HMWK在置换从血浆中吸附到玻璃上的Fg时起作用。然而对PE，观察不到HMWK的作用，有研究表明低密度脂蛋白(LDL)与某些表面Fg低吸附量有关[12]，也有人认为高密度脂蛋白(HDL)的优先吸附是表面Fg吸附量低的原因[13]。
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总之，这些观察均表明HMWKa对Fg从负电荷表面上被置换起着主要作用。因此，Vroman效应和接触活化之间的关系，使生物材料领域的研究者面临一种矛盾。一方面，因为Vroman效应被引发，正常血浆中Fg对材料的吸附量逐渐减少，这暗示内源性凝血途径被引发。另一方面，吸附Fg的减少表明材料将粘附较少的血小板而使促凝血性降低[14]。因此，对材料血液相容性的评价，依据有所不同，这要看内源性凝血系统的引发和血小板粘附二者哪一个是最重要的决定因素。
尽管大量证据显示在置换吸附的Fg中，接触相凝血因子起了作用，但Brash等人[15]的研究却证明即使用天然缺HMWK的血浆，在某一浓度范围内也可以清楚地观察到玻璃上的Vroman效应，只是置换的Fg的量比正常血浆少。这一结果说明：“血浆中其他成分也可置换Fg”。事实上，有研究表明某些生物材料的Vroman效应中，接触相因子起着很小的作用。首先，Slack等人证明Fg在硅橡胶和PE上的吸附，对于正常和缺HMWK的血浆无区别。因为这些材料不会激活内源性途径至能引起血凝的程度，即HMWKa的产生很少，然而这两种血浆都有明显的Vroman效应，当血浆浓度约为1%时有一最大吸附峰。其次，由于许多被认为是不易引发内源性途径的疏水性材料也有Vroman峰，故似乎接触活化不是材料表现出Vroman效应的必要条件。例如，近来的研究表明一种广泛用于口腔的钛合金，与血浆接触时表现出Vroman效应，但与带负电荷的玻璃参照物相比，内源凝血途径的活化程度很小。Elwing和他的同事[16]表明在疏水性表面没有发现Fg被HMWK置换的过程。他们将硅片作特殊处理产生润湿性梯度，然后置于血浆中1 min或1 hr。用椭圆偏振光法和Fg抗血清免疫检测法，观察到1 hr与1 min相比，抗Fg结合在硅片的疏水性尾部减少了，但这一减少并非伴随抗HMWK结合的增加。反之，1 hr后硅片的亲水性尾部抗Fg结合的减少，伴随有相应的抗HMWK结合的增加。结论是HMWK对亲水表面Fg的置换起作用，而血浆中其他成分对疏水表面上Fg的置换也起作用。Vroman与其他人发现：HMWK活化产生的HMWKa置换Fg的过程，是在室温下发生的。由于考虑到酶活性受温度影响，Slack等人对比了正常和缺HMWK血浆中Fg对玻璃在25 ℃和37 ℃的吸附。25 ℃时，无HMWK血浆比正常血浆有更多的Fg吸附到玻璃上，这与以往研究一致，而37 ℃时却没有区别。由于在生理温度，HMWKa对Fg从血浆中吸附到玻璃上无影响，故37 ℃时接触活化与Vroman的关系尚待仔细研究。
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接触活化因子对Vroman效应并非必须条件的最明显证据来自二元和三元蛋白溶液。研究之一是将Fg和氧合血红蛋白或牛血清白蛋白混合，然后Fg从一系列不同稀释倍数的二元溶液中吸附到PE上。当竞争蛋白/Fg的比例增加，Fg的最大吸附峰向低稀释倍数移动。抑制Fg吸附所需的氧合血红蛋白量比白蛋白量少。在另一研究中[13]，PS和PVC置于白蛋白(Alb)，免疫球蛋白(IgG)和Fg不同稀释度的三元混合液中，用免疫技术测定。奇怪的是，Alb和IgG，而非Fg在血浆中等稀释倍数时，有最大吸附。还测量了不同稀释倍数的血浆中相同蛋白质在PC和PVC上的吸附，证明每种蛋白质都有Vroman效应。二、三元蛋白溶液竞争研究的结果反映了不同表面亲合力的各种蛋白质对有限吸附位点竞争是一致的。这并非意味着接触活化蛋白不会或不能置换吸附的Fg；事实上，由于它们在引发表面凝血中的作用，可以知道它们对表面有很高的亲合力，特别是对于带负电荷的表面。然而根据目前的研究结果，至少在生理温度下它们对置换是Fg的作用是较小的，而其他蛋白主要负责置换Fg，尤其在疏水材料表面。
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总之，Fg被置换是Fg与具有不同浓度和表面亲合力的各种血浆蛋白质共同作用的结果。因此，除Fg外的蛋白质也应会从复杂蛋白质混合液如血浆中表现最大吸附。这已被几种其他蛋白质，包括Alb，IgG[13]所证实。而且，Grinnell等人发现纤维连结蛋白(Fn)吸附到用于组织培养的PS[17]和玻璃[18]时，在中等血清稀释倍数处有最大吸附。所以，Vroman效应是一反映蛋白质对有限位点的竞争吸附的普遍现象，而非单独针对Fg或内源凝血途径引发的效应。
4 吸附的纤维蛋白原和其他蛋白质的转变
许多实验室已证明蛋白质分子在吸附到表面后发生重排(rearrangement)。这种转变对Vroman效应是很重要的，因为它们影响蛋白质结合的紧密程度。此外，重排会改变吸附的粘附蛋白的生物活性。结合紧密程度的增加和生物活性的调整受吸附后放置时间、表面化学和共吸附蛋白等因素的影响。
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酶活性的丧失[19]、用各种表面活性剂洗脱材料吸附Fg的量，随放置时间的延长而减少[20]、血浆成分置换Fg的能力随时间的延长而降低[21]、单克隆抗体识别新抗原决定簇的表达[22]等现象均显示吸附蛋白会重排。研究发现，吸附到PE上的Fg随放置时间的延长很快变得不易被血浆置换，而HEMA/EMA共聚物上这种现象发生速率很慢。这些区别可能反应Fg与不同疏水性表面相互作用的本质。从纯Fg溶液和血浆中吸附到某些表面的Fg，也会依时性地出现用SDS表面活性剂洗脱时洗脱率下降。此外，吸附的Fg和Alb酰胺键Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的频率随时间改变[23]。随放置时间的延长，血小板和抗体结合到吸附的Fg上的量减少，也表明吸附的Fg的生物活性改变[24]。溶液中加入Alb，可使Fg的生物活性不随放置时间的延长而丧失。
生物材料表面引起吸附的Fg转变与Vroman效应有关。原因是：(1)转变使Fg与表面的连结更紧密，从而不易被置换；(2)不同生物材料表面的Fg重排速率不同，表明具有不同表面化学的生物材料上Fg的Vroman效应的不同与Fg的重排有关。
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5 Vroman效应的数学模型
蛋白质对固体材料表面的吸附，传统上用Langmuir和Freundlich吸附等温公式来描述[25]。有时，Freundlich等温吸附更精确描写蛋白吸附数据，然而由于可逆吸附和吸附分子之间无相互作用的假设，在蛋白质体系中并不正确，故两种模型都不是真实的。
由于必须考虑Fg被置换和Fg对血浆稀释倍数和材料表面化学的依赖性，对Vroman效应所作的数字模型便面临一新问题。由于不同材料吸附Fg的量，以及最大吸收峰处血浆的稀释倍数变化很大，任何一种Vroman效应模型都应考虑Fg与材料的相互作用。因此，蛋白伸展过程，即Fg(还有其他蛋白质)使其自身与表面的接触最大化而引起的吸附蛋白质的转变，导致蛋白质与表面更紧密的结合，应是解释Fg被置换的出发点。以这种解释置换过程的理论为基础，得到了将吸附、转变和置换连结不牢的Fg这三个过程包括在内的经验公式[11]。许多可能置换Fg的血浆蛋白质均简单处理为一种“假设”蛋白质，它与表面的亲合力与血浆蛋白的累积亲合力相同。将实验数据代入相关公式得到不同生物材料的蛋白质转变速率常数值有很大的不同，这有助于解释不同材料上Vroman效应的不同。另一个解释Vroman效应的数学模型是假设吸附和解吸速率常数取决于表面总的蛋白浓度，并引入相互作用参数来描述吸附的蛋白质分子之间的排斥与/或吸引力。用计算机模拟可获得蛋白吸附的最大值，并且根据相互作用参数的值，可定性地解释血浆稀释倍数对吸附的Fg量的影响。由同一研究小组所作的Monte Carlo模拟表明：随着蛋白质占有的表面积增加，有吸附速率下降的现象，且不同的蛋白质的区别很大，通过将表面排斥效果和吸附蛋白的平行迁移考虑在内，能更好地解释Vroman效应。
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6 结束语
Fg与其他血浆蛋白质对生物材料表面的吸附，以及Vroman效应一直吸引着研究血液-材料相互作用情况的科学家。对Vroman效应的研究可以为开发新的血液相容性生物材料提供可靠的理论指导。虽然在过去二十多年中对Vroman效应的本质研究有了许多重要的发现，但仍有许多尚待弄清的问题。未来的研究方向应放在Fg构相变化与血小板粘附的关系、材料表面特征对吸附的Fg构相变化的影响等方面。从分子水平去研究Vroman效应，并辅以更严密的数学模型，将会有利于进一步理解血液-材料相互作用的本质。
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(收稿：1998-08-31), 百拇医药