抗凝剂、温度和性别对体外中性粒细胞自发性激活的影响*
作者：吴立志 陈槐卿 邓 力
单位：吴立志 陈槐卿(华西医科大学 生物医学工程研究室，成都 610041)；邓 力(华西医科大学 药学院，成都 610041)
关键词：中性粒细胞；自发性激活；抗凝剂；温度；性别
生物医学工程学杂志990321 摘要 从细胞形态学和细胞酶组织化学的角度出发，用伪足法和NBT法检测体外中性粒细胞自发性激活，研究了抗凝剂、孵育温度和性别对检测结果的影响。发现：(1)EDTA可显著抑制中性粒细胞自发性激活，血标本以小剂量肝素抗凝为宜；(2)孵育温度对中性粒细胞自发性激活有影响，37℃比25℃的激活百分率高，最高激活百分率出现较25℃早1h；(3)女性中性粒细胞自发性激活百分率较男性高，最高激活百分率出现较男性早1h。研究结果为以后深入研究中性粒细胞激活与多种疾病的关系提供了参照系统。
Effects of Anticoagulants, Temperature and Sex on the
, http://www.100md.com
Spontaneo us Activation of Neutrophils in Vitro
Wu Lizhi1 Chen Huaiqing1 Deng Li2
1 (Research Unit of Biomedical Engineering, West China University of Me dical Sciences,Chengdu 610041)
2 (College of Pharmac, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract From the view of cellular morphology and enzymi c histochemistry, we used the pseudopod method and NBT test to measure spontaneo us activation of neutrophils in vitro.The effects of anticoagulant,temperature, and sex on the percentage of spontaneously activated neutrophils were studied. T he results suggest that heparin is a better anticoagulant than EDTA because EDTA inhibits neutrophil activation; that a higher percentage of activated neutrophi ls can be obtained when incubated at 37℃, compared with the percentage at 25℃, and at 37℃ the highest percentage appears an hour earlier; and that females s how a higher percentage of spontaneously activated neutrophils than males, and f emales' highest percentage appears an hour earlier than males'. These are of ref erential value for further studies.
, 百拇医药
Key words Neutrophil Spontaneous activation Anticoagulants Temperature Sex
1 前 言
中性粒细胞激活在心脑血管疾病的发生、发展、预后过程中所起的作用已引起了学者们的重视。大量的研究资料表明心脑血管疾病时有中性粒细胞激活的机制参与[1～3]。但尚未见对人体中性粒细胞的激活特征系统全面的报道。为此，我们从细胞形态学和细胞酶组织化学的角度出发，用伪足法和硝基蓝四唑(NBT)法研究正常人中性粒细胞体外自发性激活的时相特征，以及抗凝剂、温度和性别对中性粒细胞自发性激活的影响，为深入研究中性粒细胞激活与多种疾病之间的关系提供参照系统。
2 材料和方法
2.1 实验方法
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2.1.1 伪足观察法 采血抗凝后装入硅化试管中，以45°斜放于恒温水浴中静置45min，取上清液(此上清液中富含白细胞、血小板，还有少量散在的红细胞)与0.9%生理盐水1∶2混匀后装入另一试管中，加盖，于恒温水浴中孵育，轻微振荡，以防白细胞聚集和粘附。自采血时起每隔1h用巴氏吸管吸取孵育液100μl加至显微观察板的凹槽中，加盖玻片后在倒置相差显微镜×100油镜下观察100个中性粒细胞，计数伸出伪足的中性粒细胞的百分率。4min内记数完毕。
在放大倍数1000倍的油镜下可清楚地分辨出各种白细胞。中性粒细胞直径7.4～8.5μm，胞浆中含有大量强折光性的颗粒。淋巴细胞直径6.0～7.5μm，它和单核细胞的胞浆中均不含颗粒。嗜酸性和嗜碱性粒细胞较中性粒细胞略大，胞浆内颗粒亦比中性粒细胞的大，折光性更强。死亡中性粒细胞胞浆内的颗粒作快速布朗运动。按Chang[1]等的标准，无变形的球形细胞上伸出的突起，长度超过1μm者确认为伪足。
, 百拇医药 2.1.2 NBT酶组织化学法 采血抗凝后装入硅化试管中，于恒温水浴中振荡孵育。采血后每隔1h取100μl全血，与0.2%NBT生理盐水溶液和0.15M PBS各50 μl加入另一试管中，混匀加盖后于37 ℃水浴中孵育20 min，再置20 ℃孵育10 m in，取细胞层制成血片，Wrigt's染色后在×100油镜下观察100个中性粒细胞，计数NBT阳性细胞的百分率。标准为：胞浆中含有蓝黑色细小颗粒(比细胞本身的大)或较粗大的凝块[4]。
2.2 实验分组
实验中所用血标本由健康青年志愿者捐献，平均年龄(26±3)岁，共37例，男27例，女10例，于上午10时从肘前静脉采血10ml。按实验中所考虑的几个相关因素，分为三组：
(1)抗凝剂影响组 男，9例，采血后等分为二份，分别用EDTA(6mg)和肝素(100IU)抗凝后各分为二小份，在pH值为7.4，温度为37℃下孵育，分别用二种方法检测自发性激活的中性粒细胞的百分率。
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(2)温度影响组 男，8例。采血并肝素抗凝后分为二份，分别于25℃和37℃孵育，孵育时pH值为7.4。每份再各分为二小份，分别用两种方法检测自发性激活的中性粒细胞的百分率。
(3)性别差异组 男27例，女10例。采血后肝素抗凝，分为二份，在pH值7.4，温度37℃下孵育，分别用两种方法检测自发性激活的中性粒细胞的百分率。
各标本均常规做全血白细胞计数，分类计数，NBT试验，上清孵育液第1h和第8h白细胞计数，台盼蓝排除法计数活性白细胞的百分率。
2.3 统计学处理
所得数据以均数±标准差(
±s)表示，并作t检验。其中，抗凝剂、温度的影响作配对t检验。性别差异采用两样本均数比较的t检验。
, 百拇医药
3 结 果
3.1 测得白细胞的有关数据
血标本白细胞总数：男5208±820，女6380±630。分类计数：中性粒细胞，男63.1%±4.62%，女67%±2.31%；淋巴细胞，男31.5%±3.8%，女28.7%±2.29%。采血时NBT阳性的中性粒细胞百分率：男2.67%±2.135%，女3.5%±2.87%。男女活性中性粒细胞百分率第1h>97%，第8h>95%。
3.2 抗凝剂的影响
从图1中可见，各小时肝素抗凝血中激活的中性粒细胞百分率均显著高于EDTA抗凝血，EDTA抗凝血中激活的中性粒细胞百分率下降比肝素抗凝血快。
图1 抗凝剂对中性粒细胞自发性激活的影响
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Fig 1 Effects of anticoagulants on the percentage of spontaneousl y activated neutrophils
** P<0.01 EDTA Vs.Heparin
3.3 温度的影响
从图2中可见：(1)自发性激活的中性粒细胞的百分率，37 ℃时高于25 ℃时。其中伪足法第1、2、3 h，NBT法在各小时，差异具有显著性；(2)25 ℃时最大激活百分率出现在采血后第4 h，较37 ℃晚1 h；37 ℃时最大激活百分率显著高于25 ℃时的最大激活百分率(P<0.01)。
图2 温度对中性粒细胞自发性激活的影响
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Fig 2 Effects of temperature on the percentage of spontaneously a ctivated neutrophils
* P<0.05，** P<0.01 25℃ Vs. 37 ℃
3.4 性别的差异
从图3中可见：(1)伪足法各小时女性中性粒细胞的激活百分率高于男性，除第3 h外，差异具有显著性；女性最大激活百分率出现在采血后第2 h，较男性早1 h，女性最大激活百分率显著高于男性最大激活百分率(P<0.01)；(2)NBT法男性和女性最大激活百分率均出现在采血后第3 h，采血后第3、4 h，女性的激活百分率显著高于男性。
图3 中性粒细胞自发性激活的性别差异
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Fig 3 Different percentages of spontaneously activated neutrophils
* P<0.05 ** P<0.01 Female Vs. Male
4 讨 论
4.1 抗凝剂对中性粒细胞激活的影响
实验结果显示EDTA抗凝血中激活的中性粒细胞的百分率显著低于肝素抗凝血。EDTA 和肝素的抗凝机制不同。前者螯合Ca2+，使血浆中Ca2+浓度降低，阻止血液的 凝固；后者和血浆中的一些抗凝蛋白结合，增强它们与凝血酶的亲和力，使凝血酶立即失活 [5]。现在已知Ca2+为中性粒细胞代谢活动中一个至关重要的因子，激活时 信号的转导[6]、胞浆丝状骨架蛋白的装配和拆装[7]、NADPH氧化酶的组装[8]等活动均需有Ca2+参与。血浆中Ca2+浓度的降低，可能是EDTA 影响检测结果的原因之一。也有人注意到了肝素对血中白细胞的影响，它能增加白细胞的聚集[4]，浓度过大时还可造成NBT假阳性率增高[9]。实验中选用20IU肝素 抗凝1 ml血，既可有效抗凝，又可最大程度地降低假阳性率。
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4.2 温度的影响
实验中所选中性粒细胞孵育温度为一般实验所常用的25 ℃和37 ℃。结果表明各小 时自发性激活的中性粒细胞的百分率，37 ℃均高于25 ℃，其中某些时相二者相差显著，而且25 ℃时最高百分率出现在第4 h，较37 ℃晚1 h。这可能和37 ℃时细胞内酶的活性较25 ℃高有关，也可能血浆中某些生物活性物质的活性因温度的变化而发生了改变[10] 。
4.3 性别差异
实验结果显示用两种方法检测的结果，男女性别之间存在较为明显的差异。就我们目前所掌握的资料，对此尚不能做出合理的解释。但这是十分有意思的现象，值得进一步探讨。
5 结 论
本实验研究表明：(1)EDTA可显著降低自发性激活的中性粒细胞 的检出率，血标本以小剂量肝素抗凝为宜；(2)血标本孵育温度对体外中性粒细胞自发性激 活有影响。37 ℃孵育时可获得较高的激活百分率；(3)体外中性粒细胞自发性激活存在性别 差异，女性激活百分率高于男性，最大激活百分率出现较男性早1 h。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目(39670202)
参考文献
1 Chang RRK,Chien NTY, Chen CH et al. Spontaneous acti vati on of circulating granulocytes in patients with acute myocardial and cerebral di seases. Biorheology, 1992;29∶549
2 Shen K, Delano FA, Zweifach BW et al. Circulating leukocyte c ounts, activation and degranulation in Dahl hypertensive rats. Cir Res, 1995;76 ∶27 6
3 许贻自，诸金水，张国屏等.急性缺血性中风患者白细胞激活和自由基形成 .中华内科杂志，1994；33(2)∶799
, 百拇医药
4 魏明竟等.临床检验学(第三版).北京：科学技术出版社，1996∶86
5 张镜如等.生理学(第四版).北京：人民卫生出版社，1996∶70
6 Bokoch G. Chemoattrant signaling and leukocyte activation. Blood, 1995;86(5)∶1649
7 Hoffman R. Hematology, basic principles and practice(1st edition) .New York:Churchill Livingston Inc,1991∶529
8 Klin-Park WK, Moore MA, Hakki ZW et al. Activation of the ne utro phil respiratory burst requires both intracellular and extracellular calcium. Eu r J Haematol,1996;57(59)(suppl)∶12
9 Bjorksten B. The influence of technical factor on the NBT test. S cand J Haemat,1974;12∶46
10 Move MA, Hakki RL, Gregory LE et al. Influence of heat inact ivat ion of human serum on the opsonization of streptococcus mutants. Eur J Haematol, 1996;57(59)(suppl)∶28
(收稿：1998-06-17), 百拇医药
单位：吴立志 陈槐卿(华西医科大学 生物医学工程研究室，成都 610041)；邓 力(华西医科大学 药学院，成都 610041)
关键词：中性粒细胞；自发性激活；抗凝剂；温度；性别
生物医学工程学杂志990321 摘要 从细胞形态学和细胞酶组织化学的角度出发，用伪足法和NBT法检测体外中性粒细胞自发性激活，研究了抗凝剂、孵育温度和性别对检测结果的影响。发现：(1)EDTA可显著抑制中性粒细胞自发性激活，血标本以小剂量肝素抗凝为宜；(2)孵育温度对中性粒细胞自发性激活有影响，37℃比25℃的激活百分率高，最高激活百分率出现较25℃早1h；(3)女性中性粒细胞自发性激活百分率较男性高，最高激活百分率出现较男性早1h。研究结果为以后深入研究中性粒细胞激活与多种疾病的关系提供了参照系统。
Effects of Anticoagulants, Temperature and Sex on the
, http://www.100md.com
Spontaneo us Activation of Neutrophils in Vitro
Wu Lizhi1 Chen Huaiqing1 Deng Li2
1 (Research Unit of Biomedical Engineering, West China University of Me dical Sciences,Chengdu 610041)
2 (College of Pharmac, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract From the view of cellular morphology and enzymi c histochemistry, we used the pseudopod method and NBT test to measure spontaneo us activation of neutrophils in vitro.The effects of anticoagulant,temperature, and sex on the percentage of spontaneously activated neutrophils were studied. T he results suggest that heparin is a better anticoagulant than EDTA because EDTA inhibits neutrophil activation; that a higher percentage of activated neutrophi ls can be obtained when incubated at 37℃, compared with the percentage at 25℃, and at 37℃ the highest percentage appears an hour earlier; and that females s how a higher percentage of spontaneously activated neutrophils than males, and f emales' highest percentage appears an hour earlier than males'. These are of ref erential value for further studies.
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Key words Neutrophil Spontaneous activation Anticoagulants Temperature Sex
1 前 言
中性粒细胞激活在心脑血管疾病的发生、发展、预后过程中所起的作用已引起了学者们的重视。大量的研究资料表明心脑血管疾病时有中性粒细胞激活的机制参与[1～3]。但尚未见对人体中性粒细胞的激活特征系统全面的报道。为此，我们从细胞形态学和细胞酶组织化学的角度出发，用伪足法和硝基蓝四唑(NBT)法研究正常人中性粒细胞体外自发性激活的时相特征，以及抗凝剂、温度和性别对中性粒细胞自发性激活的影响，为深入研究中性粒细胞激活与多种疾病之间的关系提供参照系统。
2 材料和方法
2.1 实验方法
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2.1.1 伪足观察法 采血抗凝后装入硅化试管中，以45°斜放于恒温水浴中静置45min，取上清液(此上清液中富含白细胞、血小板，还有少量散在的红细胞)与0.9%生理盐水1∶2混匀后装入另一试管中，加盖，于恒温水浴中孵育，轻微振荡，以防白细胞聚集和粘附。自采血时起每隔1h用巴氏吸管吸取孵育液100μl加至显微观察板的凹槽中，加盖玻片后在倒置相差显微镜×100油镜下观察100个中性粒细胞，计数伸出伪足的中性粒细胞的百分率。4min内记数完毕。
在放大倍数1000倍的油镜下可清楚地分辨出各种白细胞。中性粒细胞直径7.4～8.5μm，胞浆中含有大量强折光性的颗粒。淋巴细胞直径6.0～7.5μm，它和单核细胞的胞浆中均不含颗粒。嗜酸性和嗜碱性粒细胞较中性粒细胞略大，胞浆内颗粒亦比中性粒细胞的大，折光性更强。死亡中性粒细胞胞浆内的颗粒作快速布朗运动。按Chang[1]等的标准，无变形的球形细胞上伸出的突起，长度超过1μm者确认为伪足。
, 百拇医药 2.1.2 NBT酶组织化学法 采血抗凝后装入硅化试管中，于恒温水浴中振荡孵育。采血后每隔1h取100μl全血，与0.2%NBT生理盐水溶液和0.15M PBS各50 μl加入另一试管中，混匀加盖后于37 ℃水浴中孵育20 min，再置20 ℃孵育10 m in，取细胞层制成血片，Wrigt's染色后在×100油镜下观察100个中性粒细胞，计数NBT阳性细胞的百分率。标准为：胞浆中含有蓝黑色细小颗粒(比细胞本身的大)或较粗大的凝块[4]。
2.2 实验分组
实验中所用血标本由健康青年志愿者捐献，平均年龄(26±3)岁，共37例，男27例，女10例，于上午10时从肘前静脉采血10ml。按实验中所考虑的几个相关因素，分为三组：
(1)抗凝剂影响组 男，9例，采血后等分为二份，分别用EDTA(6mg)和肝素(100IU)抗凝后各分为二小份，在pH值为7.4，温度为37℃下孵育，分别用二种方法检测自发性激活的中性粒细胞的百分率。
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(2)温度影响组 男，8例。采血并肝素抗凝后分为二份，分别于25℃和37℃孵育，孵育时pH值为7.4。每份再各分为二小份，分别用两种方法检测自发性激活的中性粒细胞的百分率。
(3)性别差异组 男27例，女10例。采血后肝素抗凝，分为二份，在pH值7.4，温度37℃下孵育，分别用两种方法检测自发性激活的中性粒细胞的百分率。
各标本均常规做全血白细胞计数，分类计数，NBT试验，上清孵育液第1h和第8h白细胞计数，台盼蓝排除法计数活性白细胞的百分率。
2.3 统计学处理
所得数据以均数±标准差(
±s)表示，并作t检验。其中，抗凝剂、温度的影响作配对t检验。性别差异采用两样本均数比较的t检验。, 百拇医药
3 结 果
3.1 测得白细胞的有关数据
血标本白细胞总数：男5208±820，女6380±630。分类计数：中性粒细胞，男63.1%±4.62%，女67%±2.31%；淋巴细胞，男31.5%±3.8%，女28.7%±2.29%。采血时NBT阳性的中性粒细胞百分率：男2.67%±2.135%，女3.5%±2.87%。男女活性中性粒细胞百分率第1h>97%，第8h>95%。
3.2 抗凝剂的影响
从图1中可见，各小时肝素抗凝血中激活的中性粒细胞百分率均显著高于EDTA抗凝血，EDTA抗凝血中激活的中性粒细胞百分率下降比肝素抗凝血快。
图1 抗凝剂对中性粒细胞自发性激活的影响
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Fig 1 Effects of anticoagulants on the percentage of spontaneousl y activated neutrophils
** P<0.01 EDTA Vs.Heparin
3.3 温度的影响
从图2中可见：(1)自发性激活的中性粒细胞的百分率，37 ℃时高于25 ℃时。其中伪足法第1、2、3 h，NBT法在各小时，差异具有显著性；(2)25 ℃时最大激活百分率出现在采血后第4 h，较37 ℃晚1 h；37 ℃时最大激活百分率显著高于25 ℃时的最大激活百分率(P<0.01)。
图2 温度对中性粒细胞自发性激活的影响
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Fig 2 Effects of temperature on the percentage of spontaneously a ctivated neutrophils
* P<0.05，** P<0.01 25℃ Vs. 37 ℃
3.4 性别的差异
从图3中可见：(1)伪足法各小时女性中性粒细胞的激活百分率高于男性，除第3 h外，差异具有显著性；女性最大激活百分率出现在采血后第2 h，较男性早1 h，女性最大激活百分率显著高于男性最大激活百分率(P<0.01)；(2)NBT法男性和女性最大激活百分率均出现在采血后第3 h，采血后第3、4 h，女性的激活百分率显著高于男性。
图3 中性粒细胞自发性激活的性别差异
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Fig 3 Different percentages of spontaneously activated neutrophils
* P<0.05 ** P<0.01 Female Vs. Male
4 讨 论
4.1 抗凝剂对中性粒细胞激活的影响
实验结果显示EDTA抗凝血中激活的中性粒细胞的百分率显著低于肝素抗凝血。EDTA 和肝素的抗凝机制不同。前者螯合Ca2+，使血浆中Ca2+浓度降低，阻止血液的 凝固；后者和血浆中的一些抗凝蛋白结合，增强它们与凝血酶的亲和力，使凝血酶立即失活 [5]。现在已知Ca2+为中性粒细胞代谢活动中一个至关重要的因子，激活时 信号的转导[6]、胞浆丝状骨架蛋白的装配和拆装[7]、NADPH氧化酶的组装[8]等活动均需有Ca2+参与。血浆中Ca2+浓度的降低，可能是EDTA 影响检测结果的原因之一。也有人注意到了肝素对血中白细胞的影响，它能增加白细胞的聚集[4]，浓度过大时还可造成NBT假阳性率增高[9]。实验中选用20IU肝素 抗凝1 ml血，既可有效抗凝，又可最大程度地降低假阳性率。
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4.2 温度的影响
实验中所选中性粒细胞孵育温度为一般实验所常用的25 ℃和37 ℃。结果表明各小 时自发性激活的中性粒细胞的百分率，37 ℃均高于25 ℃，其中某些时相二者相差显著，而且25 ℃时最高百分率出现在第4 h，较37 ℃晚1 h。这可能和37 ℃时细胞内酶的活性较25 ℃高有关，也可能血浆中某些生物活性物质的活性因温度的变化而发生了改变[10] 。
4.3 性别差异
实验结果显示用两种方法检测的结果，男女性别之间存在较为明显的差异。就我们目前所掌握的资料，对此尚不能做出合理的解释。但这是十分有意思的现象，值得进一步探讨。
5 结 论
本实验研究表明：(1)EDTA可显著降低自发性激活的中性粒细胞 的检出率，血标本以小剂量肝素抗凝为宜；(2)血标本孵育温度对体外中性粒细胞自发性激 活有影响。37 ℃孵育时可获得较高的激活百分率；(3)体外中性粒细胞自发性激活存在性别 差异，女性激活百分率高于男性，最大激活百分率出现较男性早1 h。
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*国家自然科学基金资助项目(39670202)
参考文献
1 Chang RRK,Chien NTY, Chen CH et al. Spontaneous acti vati on of circulating granulocytes in patients with acute myocardial and cerebral di seases. Biorheology, 1992;29∶549
2 Shen K, Delano FA, Zweifach BW et al. Circulating leukocyte c ounts, activation and degranulation in Dahl hypertensive rats. Cir Res, 1995;76 ∶27 6
3 许贻自，诸金水，张国屏等.急性缺血性中风患者白细胞激活和自由基形成 .中华内科杂志，1994；33(2)∶799
, 百拇医药
4 魏明竟等.临床检验学(第三版).北京：科学技术出版社，1996∶86
5 张镜如等.生理学(第四版).北京：人民卫生出版社，1996∶70
6 Bokoch G. Chemoattrant signaling and leukocyte activation. Blood, 1995;86(5)∶1649
7 Hoffman R. Hematology, basic principles and practice(1st edition) .New York:Churchill Livingston Inc,1991∶529
8 Klin-Park WK, Moore MA, Hakki ZW et al. Activation of the ne utro phil respiratory burst requires both intracellular and extracellular calcium. Eu r J Haematol,1996;57(59)(suppl)∶12
9 Bjorksten B. The influence of technical factor on the NBT test. S cand J Haemat,1974;12∶46
10 Move MA, Hakki RL, Gregory LE et al. Influence of heat inact ivat ion of human serum on the opsonization of streptococcus mutants. Eur J Haematol, 1996;57(59)(suppl)∶28
(收稿：1998-06-17), 百拇医药