流体切应力对中性粒细胞表面粘附分子表达的影响*
作者：陈槐卿 田 卫 雷 松 魏于全 陈云爽
单位：陈槐卿 田 卫 陈云爽(华西医科大学 生物医学工程研究室，成都 610041)；雷 松 魏于全(华西医科大学 肿瘤生物治疗中心，成都 610041)
关键词：中性粒细胞；切应力；β2-整合素；L-选择素
生物医学工程学杂志990307 摘要 采用Low-shear 30对中性粒细胞施加不同强度、不同形式的剪切，在经过荧光单克隆抗体标记后，用流式细胞仪检测CD18和CD62L在细胞表面的表达情况。结果显示：剪切后CD18有显著升高，而CD62L阳性细胞比率显著下降，但对CD62L阳性细胞表面CD62L的含量没有明显影响。不同方式的剪切影响有细微差异。f-MLP或TNF单独作用可以使细胞表面的CD18表达轻微降低而使CD62L同样发生脱落，刺激因子与切应力同时作用下两种粘附分子的表现有加和性。本文提示，力学作用与生物化学因子的激活作用可能是通过不同的感受器，经过不同的信号转导途径，产生不了同的效应；在研究中性粒细胞激活与粘附的工作中应考虑力学环境的问题。
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Effects of Fluid Shear Stress on Neutrophil Surface Expression
of Adhesion Molecules
Chen Huaiqing1 Tian Wei1 Lei Song2 Wei Yuquan2 Chen Yunshuang1
1 (Institute of Biomedical Engineering, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
2 (Biotherapy Center of Cancer, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
, 百拇医药
Abstract Fluid shear is a physiological and functional environment for circulating neutrophils where various chemoattractants and cytokines have different effects on neutrophils, activating them or evoking inflammation. So far there have been abundant in vitro researches demonstrating that while neutrophils are activated,some adhesion molecules, which are expressed on the surface of neutrophils, are necessary to cell-to-cell adhesion, and the quantity or quality of these molecules will be changed. The above results were all obtained under static fluid which is quite different from physiological condition. Recently, we used Low-Shear 30 to provide steady or sinusoidal-oscillated fluid shear stress on separated neutrophils with or without f-MLP/TNF stimulation. FITC-anti CD18 monoclonal antibody and PE-anti CD62L monoclonal antibody were added to label CD18 and CD62L on neutrophils suface respectively. Flow cytometry was used to quantify surface expression and positive cell percentage of these two adhesion molecules. The results demonstrat that fluid shear stress increases the expression of CD18 significantly and decreases the CD62L positive cell percentage, but it does not influence the CD62L expression on the CD62L positive cells. The effects of the different patterns of fluid shear stress are not much different, f-MLP or TNF can slightly decrease the expression of CD18 and make CD62L shedding respectively. When one of the two activators and the fluid shear stress act together, the expression of the two adherent molecules can be added.This indicates that the mechanical and biochemical stiumlative action can produce different effects through different receptors and different signal transduction pathways. So the mechanical environment shold be considered in the research of activation and adhesion of neutrophils.
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Key words Neutrophils Shear stress β2-integrin L-selectin
1 引 言
中性粒细胞在骨髓中分化成熟后，其中大多数仍储存在骨髓内，根据机体的需要逐渐释放到循环血液中；有将近半数进入循环的中性粒细胞还会留在边缘池作为储备，与循环中的中性粒细胞保持数量上的动态平衡[1]。从这些生理状态中可以看出，中性粒细胞主要是处于相对静止状态下，只有一小部分时程承受血管中循环血流的动态剪切。但是，经受循环流动状态是中性粒细胞由储存池募集进入感染部位行使生理功能的必要中间环节，同时，也是中性粒细胞监测机体被入侵状况的重要途径，因此对细胞在流动状态下的生理变化进行研究至为重要。
粘附分子的研究近些年已成为热点。这是因为在肿瘤的发生与转移、心脑血管疾病的病理机理等研究中，均可以观察到各种参与细胞粘附的细胞表面分子会发生相应变化，进而为人们认识各种病理过程的实质提供了大量资料。中性粒细胞表面参与粘附的分子主要有选择素家族的L-selectin和整合素家族的β2-integrin(CD命名中分别为CD62L和CD11/CD18，其中β2-integrin由于三个α亚基的不同又分为CD11a/CD18、CD11b/CD18和CD11c/CD18)[2，3]，在以往的研究中已经发现，这些粘附分子参与了中性粒细胞由骨髓向循环血液的募集和在炎症等刺激后跨血管迁移，进入炎症部位。但是，从目前的研究结果中尚不能了解在由储池进入循环后由于所处生理力学环境的改变是否会影响到细胞表面分子特别是粘附分子的功能，因此，我们着重研究了切应力对中性粒细胞上粘附分子表达的影响，力图揭示力学环境因素在细胞生理与病理状态下的作用。
, 百拇医药
2 材料与方法
2.1 试剂与仪器
PE-抗CD62L单克隆抗体(Immunotech，美国)，FITC-抗CD18单克隆抗体(Immunotech，美国)，低分子羟乙基淀粉注射液(Fresenius，德国)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，0.1%台盼蓝，0.15M PBS，0.2% NaCl，f-MLP(Sigma，美国)，TNFα(GBICO BRL，美国)。
流变仪(Low-Shear 30,Contraves瑞士)，流式细胞仪(ELITE ESP, Coulter，美国)，普通离心机(北京医用离心机厂)。
2.2 中性粒细胞的分离和纯化
采用密度梯度离心后溶血的方法[4]，简要为：(1)在6名健康成年男性的肘前静脉分别采血10 ml，肝素抗凝(12.5 U/ml血)。低速离心去除富含血小板血浆；(2)等体积加入低分子羟乙基淀粉注射液，混匀后37 ℃静置20 min，取上层悬液小心加到淋巴细胞分离液上，2000 rpm离心20 min；(3)弃上清液及淋巴细胞层，沉淀以0.2% NaCl低渗液溶血30 s，加PBS终止溶血，离心后取沉淀，稀释至所需要的细胞浓度；(4)台盼蓝染色鉴定，活细胞数在98%以上。
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2.3 切应力对中性粒细胞悬液的作用
采用Low-Shear 30双圆筒流变仪，选择其20、27和29三个档位，对应的切变率分别为5.96、51.2、94.5 s-1，作单纯稳定旋转剪切；另外在20、27和29三个档位作正弦振荡剪切，对应的频率分别为0.0758、0.650、1.202 Hz，对应的最大切变率分别为3.11、26.7、49.3 s-1。剪切作用时间为1 min，剪切后立即用1%甲醛固定。10-7 M的f-MLP和10 ng/ml的TNF作用各组所选择的剪切条件、作用时间与以上相同，只有刺激剂的差异。
2.4 中性粒细胞表面粘附分子的检测
2.4.1 荧光染色 固定后的细胞悬液离心取沉淀，同时加入PE-抗CD62L和FITC-抗CD18单克隆抗体各8 μl，避光反应15～20 min。用PBS洗涤，然后制备成105～106 cell/ml悬液。
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2.4.2 流式细胞仪测定 由于分别采用PE和FITC标记单克隆抗体，可以在流式细胞仪上同时检测红色和绿色荧光，荧光强度值分别与CD62L和CD18的含量相关，因而用平均荧光强度表示细胞表面CD62L和CD18的表达量，同时，计数所检测细胞中阳性标记细胞的百分率。
2.5 结果处理
以未经受剪切作用的中性粒细胞的平均荧光强度值或阳性细胞率数值为100%，各剪切作用条件下的相应数值与之相比较，相对值用配对t检验进行统计学处理；各刺激剂作用组剪切作用后的相对值与未受剪切作用的相对值进行配对t检验。
3 结 果
3.1 稳定剪切对中性粒细胞表面粘附分子的影响
3.1.1 对CD18的影响 稳定剪切1 min后，发现CD18阳性细胞率不变仍为100%，CD18的表面表达有明显升高(P<0.05)，在51.2 s-1达到最高(P<0.01)，94.5 s-1时已有下降趋势。f-MLP或TNF作用后CD18表面表达下降，在切应力的同时作用下也有所回升。三条曲线有着大致相同的趋势(见图1)。
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图1 稳定剪切对中性粒细胞CD18表面表达的影响
Fig 1 Effects of steady shear on CD18 surface expression
of neutrophils
Compared with the value of that without shear
* P<0.05,** P<0.01
Compared with the value of that without biochemical
stimulus # P<0.05
—◆—shear —□—shear+fMLP —▲—shear+TNF
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3.1.2 对CD62L的影响 由图2和图3中可以看出，切应力作用下CD62L的阳性细胞率显著下降(P<0.01)，f-MLP和TNF也可以产生这一现象，但是，单纯力学作用对CD62L阳性细胞表面CD62L的含量没有显著影响，而刺激因子尤其是f-MLP则降低CD62L的表面表达。
图2 稳定剪切对中性粒细胞CD62L阳性细胞率的影响
Fig 2 Effects of steady shear on CD62L positive neutrophils percentage
Compared with the values of that without shear
* P<0.05, ** P<0.01
, 百拇医药
Compared with the values of that without biochemical stimulus # P<0.05，## P<0.01
—◆—shear —□—shear+fMLP —▲—shear+TNF
图3 稳定剪切对中性粒细胞CD62L阳性细胞上CD62L含量的影响
Fig 3 Effects of steady shear on CD62L positive neutrophils' CD62L surface expression
Compared with the values of that without biochemical stimulus # P<0.05
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—◆—shear —□—shear+f-MLP —▲—shear+TNF
3.2 正弦振荡剪切对中性粒细胞表面粘附分子的影响
3.2.1 对CD18的影响 正弦振荡剪切后，中性粒细胞CD18阳性细胞率不变，仍为100%；细胞表面CD18表达也呈现上升趋势(P<0.05)，但是不同的频率下此表达有些波动。f-MLP或TNF与正弦切应力同时作用时，切应力也能在刺激因子作用下降的基础上抬升CD18含量，这一点与稳定剪切相似(见图4)。
图4 正弦振荡剪切对中性粒细胞CD18表面表达的影响
Fig 4 Effects of sinusoidal-oscillatory shear on CD18 surface expression of neutrophils
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Compared with the value of that without shear
* P<0.05,** P<0.01
Compared with the value of that without biochemical stimulus # P<0.05
—◆—shear —□—shear+f-MLP —▲—shear+TNF
3.2.2 对CD62L的影响 如图5和6所示，正弦振荡剪切后，中性粒细胞CD62L的阳性细胞率显著下降，不同频率的作用差异不显著，而对阳性细胞表面CD62L的含量没有影响。f-MLP或TNF与正弦振荡同时作用时，CD62L的阳性细胞率进一步降低，且阳性细胞上CD62L的含量也有下降。
, 百拇医药
图5 正弦振荡剪切对中性粒细胞CD62L阳性率的影响
Fig 5 Effects of sinusoidal-oscillatory shear on CD62L positive neutrophils percentage
Compared with the values without shear
* P<0.05， ** P<0.01
Compared with the vallues without biochemical stimulus # P<0.05, ## P<0.01
—◆—shear —□—shear+f-MLP —▲—shear+TNF
, 百拇医药
图6 正弦振荡剪切对中性粒细胞CD62L阳性细胞CD62L含的影响
Fig 6 Effects of sinusoidal-oscillatory shear on CD62L positive neutrophils' CD62L surface expression
Compared with the values of that without biochemical stimulus # P<0.05
—◆—shear —□—shear+f-MLP —▲—shear+TNF
4 讨 论
中性粒细胞在其分化成熟到衰老死亡的生命历程中，经受了多种复杂的生存环境。这一复杂性表现在两个方面，其一是生物化学环境的复杂性，无论是在骨髓储池还是在外周血液循环中，各种生物化学因子以各自的形式存在、作用于中性粒细胞周围，调节着细胞的生存状态和生理功能；其二是生物力学环境的复杂性，中性粒细胞由骨髓募集入循环，并与边缘池保持动态平衡的同时，还要根据机体需要向血管外组织迁移，发挥其抗炎杀菌功能。这些过程均涉及到细胞在动与静之间转变的问题。同时，即便是在循环血流中，由于不同部位血管形状、血流速度的差异，细胞在通过不同血管血流时也存在所受力学作用的变化[5]。这就要求中性粒细胞能够在感受这一复杂环境变化的同时，迅速作出适当的响应，以适应各种环境的转变，顺利有效地完成其功能。
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CD62L主要参与了中性粒细胞在血管内皮细胞层上的滚动过程，这是粒细胞与内皮细胞粘附的前提[3]，并且CD62L介导的滚动对流体切应力的大小有一定要求[6]。在血流中，中性粒细胞由于其体积较大、有核、变形性差、数量较红细胞少得多等因素，使之趋向于血管边缘，与内皮细胞的接触频繁，为了减少血液在血管中的流动阻力，减少中性粒细胞与内皮细胞的接触时间是一个有效的手段，这就要求CD62L与配体的交联及解交联速度相对较快，或者CD62L的量有所改变。有研究发现，中性粒细胞在流体运动中，CD62L会在滚动发生的几秒钟后即被剥落，从而显著地影响了细胞的滚动速度，限制了中性粒细胞的聚集[7]。我们的研究结果表明，CD62L在流动状态下大幅度下降，并且对一个中性粒细胞而言CD62L的脱落(shedding)几乎是完全的，即主要表现为“全或无”的形式，这就使得这一类中性粒细胞在内皮细胞附近流过时不受CD62L粘附分子的作用而滞留，因此，流动剪切是从整体上降低了中性粒细胞中CD62L阳性细胞的百分率。f-MLP和TNF均可以使CD62L阳性的细胞比率下降，这一点与已有的大量实验研究报道一致[8，9]，认为在激活因子的作用下使中性粒细胞激活，进而发生CD62L的脱落。从本文结果可以看出，与激活因子同时作用的切应力可以进一步促使CD62L脱落，在各个切变率下，不同激活因子的作用程度有一定的平行性，即可以认为是在切应力作用的基础上附加了激活因子的作用。与切应力不同的是，f-MLP等激活因子在使CD62L阳性细胞比率下降的同时，降低了阳性细胞上CD62L的含量，后一作用基本不受切应力的影响。表明两种不同类型的作用是通过不同的调节途径作用到CD62L上，产生了不同的反应方式。目前尚不明确的是，力学作用与激活因子作用使用CD62L脱落是通过什么途径完成的。也有报道认为在循环血液中，存在着CD62L低表达的一部分中性粒细胞，他们对fMLP等刺激的反应性下降，这类细胞是老龄化的中性粒细胞[10]。是否可以认为这些细胞老龄化的同时也存在受流体剪切时间长的影响，因而CD62L低表达。流动剪切使一部分中性粒细胞失去CD62L，也意味着中性粒细胞与内皮细胞相互作用的能力下降。
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从以往的研究中可知，整合素类粘附分子在中性粒细胞与内皮细胞粘附过程中的作用是比较明确的，并且已知中性粒细胞上重要的是β2类整合素，即CD18为其共有的亚基。但是在中性粒细胞激活后CD18的变化，研究报道却大不一样，有上调[8]、内吞[11]、不变等[12]多种结果，并有研究对其活性变化和亲合力改变做了深入考察[13]，力图解释各种因素造成的差异。从本研究结果来看，在切应力作用下，CD18的含量也会有显著上调，但随着切变率上升到100 s-1左右以后，可能有一个下降过程，即切变率对CD18表面表达可能有双向调节作用，这一点有待进一步确证。值得一提的是f-MLP和TNF均使CD18表面含量下调，这一结果与以往的大部分研究相左，但是也确有研究报道激活的早期，中性粒细胞表面CD18有内吞的现象[11]。本研究所采用刺激时间较短，只有一分钟，因此主要观察到CD18下调是可能的。CD18内吞后可能有将外界信号内传，从而导致细胞在激活后的一系列反应。在f-MLP或TNF作用的同时，施加切应力，发现这时的CD18表面含量在下降基础上也呈上调趋势，这就引出了几个值得探讨的问题。其一，是否在流体切应力作用下，可以通过力学的上调作用而抵消激活初期的CD18下调，从而既可以使外部信号通过内吞的CD18传入细胞，又可以使细胞表面CD18的含量保持在一个基本水平，得以保证其功能的实现；其二，在较低的切变率条件下，CD18可以在CD62L不起作用前提下独立完成中性粒细胞粘附的前两个过程——滚动和粘附[14]。这样，本研究所发现的低切变率下CD18上调，特别是在刺激因子作用后的上调是否有助于其完成粘附作用?其三，循环中老龄化的中性粒细胞中可以发现其CD18表达是上调的，尤其是在f-MLP刺激后[10]，这是否与老龄细胞受到血流剪切时间长有关?这些问题的回答目前尚无直接依据。正如CD62L的变化一样，力学作用与激活因子作用之间似乎没有直接的联系，是相互平行的两条途径完成的对CD18的调节。
, 百拇医药
在稳定剪切和正弦振荡剪切两种不同切应力条件下，粘附分子的变化趋势是相似的。主要表现为切应力的有无与粘附分子的表面表达量和阳性细胞率有关，切应力的大小及作用方式对粘附分子的变化似乎影响不大，从而提示细胞对力学作用的感受可能只和切应力的加载与否相关，而对切应力的大小和形式不甚敏感。
通过本研究及其它实验工作的结果，可以推测力学感受器与生物化学感受器在中性粒细胞上是分立的，其下游信号传递与转导过程也可能是不同的，从而导致效应途径上的分离，使二者在细胞的整体水平上对同一个效应分子的表现进行整合。f-MLP和TNF的受体研究已有了相当程度的进展，但“力学受体”的确认尚无定论，但愿本文的工作能提供一个新的思路。
* 国家自然科学基金资助项目(39670202)
作者简介：田 卫(博士研究生，工作单位：河北省唐山市工人医院)
, http://www.100md.com 参考文献
1 Newberger E, Parmley T. Neutrophil structure and function. In Hoffman R, BenZ EBJr, Shatti SJ, et al eds. Hematology-Basic principles and practice. Churchill Livingstone New York, 1991∶522
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5 陈槐卿.血液流变学及其临床应用.成都：四川教育出版社，1989∶166
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8 Kuijper PHM, Torres HIG, van der Linden JAM et al. Neutrophil adhesion to fibrinogen and fibrin under flow conditions is diminished by activation L-selectin shedding. Blood, 1997; 89(6)∶2131
9 Jagels MA, Chambers JD, Artors KE et al. C5a-and tumor necrosis factor-α-induced leukocytosis occurs independently of β2 integrin and L-selectin:Differential effects on neutrophil adhesion molecule expression in vivo. Blood, 1995; 85(10)∶2900
, 百拇医药
10 Tanji-Matsuba K, van Eeden SF, Saito Y et al. Functional changes in aging polymorphonuclear leukocyte. Circulation, 1998; 97∶91
11 Chambers JD, Simon SI, Berger EM et al. Endocytosis of β2 integrin by stimulated human neutrophils analyzed by flow cytometry. J Leukocyte Biol, 1993; 53∶462
12 Vedder NB, Harlan JM. Increased surface expression of CD11b/CD18 (Mac-Ⅰ) is not required for stimulated neutrophil adherence to cultured endothelium. J Clin Invest, 1998; 81∶676
13 Cai T, Wirght SD. Energetics of leukocyte intergrin activation. J Bio Chem, 1995; 270(24)∶14358
14 Gaboury JP, Kubes P. Reductions in physiologic shear rates lead to CD11/CD18 dependent, selectin-independent leukocyte rolling in vivo. Blood, 1994; 83(2)∶345
(收稿日期：1998-04-06), 百拇医药
单位：陈槐卿 田 卫 陈云爽(华西医科大学 生物医学工程研究室，成都 610041)；雷 松 魏于全(华西医科大学 肿瘤生物治疗中心，成都 610041)
关键词：中性粒细胞；切应力；β2-整合素；L-选择素
生物医学工程学杂志990307 摘要 采用Low-shear 30对中性粒细胞施加不同强度、不同形式的剪切，在经过荧光单克隆抗体标记后，用流式细胞仪检测CD18和CD62L在细胞表面的表达情况。结果显示：剪切后CD18有显著升高，而CD62L阳性细胞比率显著下降，但对CD62L阳性细胞表面CD62L的含量没有明显影响。不同方式的剪切影响有细微差异。f-MLP或TNF单独作用可以使细胞表面的CD18表达轻微降低而使CD62L同样发生脱落，刺激因子与切应力同时作用下两种粘附分子的表现有加和性。本文提示，力学作用与生物化学因子的激活作用可能是通过不同的感受器，经过不同的信号转导途径，产生不了同的效应；在研究中性粒细胞激活与粘附的工作中应考虑力学环境的问题。
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Effects of Fluid Shear Stress on Neutrophil Surface Expression
of Adhesion Molecules
Chen Huaiqing1 Tian Wei1 Lei Song2 Wei Yuquan2 Chen Yunshuang1
1 (Institute of Biomedical Engineering, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
2 (Biotherapy Center of Cancer, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
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Abstract Fluid shear is a physiological and functional environment for circulating neutrophils where various chemoattractants and cytokines have different effects on neutrophils, activating them or evoking inflammation. So far there have been abundant in vitro researches demonstrating that while neutrophils are activated,some adhesion molecules, which are expressed on the surface of neutrophils, are necessary to cell-to-cell adhesion, and the quantity or quality of these molecules will be changed. The above results were all obtained under static fluid which is quite different from physiological condition. Recently, we used Low-Shear 30 to provide steady or sinusoidal-oscillated fluid shear stress on separated neutrophils with or without f-MLP/TNF stimulation. FITC-anti CD18 monoclonal antibody and PE-anti CD62L monoclonal antibody were added to label CD18 and CD62L on neutrophils suface respectively. Flow cytometry was used to quantify surface expression and positive cell percentage of these two adhesion molecules. The results demonstrat that fluid shear stress increases the expression of CD18 significantly and decreases the CD62L positive cell percentage, but it does not influence the CD62L expression on the CD62L positive cells. The effects of the different patterns of fluid shear stress are not much different, f-MLP or TNF can slightly decrease the expression of CD18 and make CD62L shedding respectively. When one of the two activators and the fluid shear stress act together, the expression of the two adherent molecules can be added.This indicates that the mechanical and biochemical stiumlative action can produce different effects through different receptors and different signal transduction pathways. So the mechanical environment shold be considered in the research of activation and adhesion of neutrophils.
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Key words Neutrophils Shear stress β2-integrin L-selectin
1 引 言
中性粒细胞在骨髓中分化成熟后，其中大多数仍储存在骨髓内，根据机体的需要逐渐释放到循环血液中；有将近半数进入循环的中性粒细胞还会留在边缘池作为储备，与循环中的中性粒细胞保持数量上的动态平衡[1]。从这些生理状态中可以看出，中性粒细胞主要是处于相对静止状态下，只有一小部分时程承受血管中循环血流的动态剪切。但是，经受循环流动状态是中性粒细胞由储存池募集进入感染部位行使生理功能的必要中间环节，同时，也是中性粒细胞监测机体被入侵状况的重要途径，因此对细胞在流动状态下的生理变化进行研究至为重要。
粘附分子的研究近些年已成为热点。这是因为在肿瘤的发生与转移、心脑血管疾病的病理机理等研究中，均可以观察到各种参与细胞粘附的细胞表面分子会发生相应变化，进而为人们认识各种病理过程的实质提供了大量资料。中性粒细胞表面参与粘附的分子主要有选择素家族的L-selectin和整合素家族的β2-integrin(CD命名中分别为CD62L和CD11/CD18，其中β2-integrin由于三个α亚基的不同又分为CD11a/CD18、CD11b/CD18和CD11c/CD18)[2，3]，在以往的研究中已经发现，这些粘附分子参与了中性粒细胞由骨髓向循环血液的募集和在炎症等刺激后跨血管迁移，进入炎症部位。但是，从目前的研究结果中尚不能了解在由储池进入循环后由于所处生理力学环境的改变是否会影响到细胞表面分子特别是粘附分子的功能，因此，我们着重研究了切应力对中性粒细胞上粘附分子表达的影响，力图揭示力学环境因素在细胞生理与病理状态下的作用。
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2 材料与方法
2.1 试剂与仪器
PE-抗CD62L单克隆抗体(Immunotech，美国)，FITC-抗CD18单克隆抗体(Immunotech，美国)，低分子羟乙基淀粉注射液(Fresenius，德国)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，0.1%台盼蓝，0.15M PBS，0.2% NaCl，f-MLP(Sigma，美国)，TNFα(GBICO BRL，美国)。
流变仪(Low-Shear 30,Contraves瑞士)，流式细胞仪(ELITE ESP, Coulter，美国)，普通离心机(北京医用离心机厂)。
2.2 中性粒细胞的分离和纯化
采用密度梯度离心后溶血的方法[4]，简要为：(1)在6名健康成年男性的肘前静脉分别采血10 ml，肝素抗凝(12.5 U/ml血)。低速离心去除富含血小板血浆；(2)等体积加入低分子羟乙基淀粉注射液，混匀后37 ℃静置20 min，取上层悬液小心加到淋巴细胞分离液上，2000 rpm离心20 min；(3)弃上清液及淋巴细胞层，沉淀以0.2% NaCl低渗液溶血30 s，加PBS终止溶血，离心后取沉淀，稀释至所需要的细胞浓度；(4)台盼蓝染色鉴定，活细胞数在98%以上。
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2.3 切应力对中性粒细胞悬液的作用
采用Low-Shear 30双圆筒流变仪，选择其20、27和29三个档位，对应的切变率分别为5.96、51.2、94.5 s-1，作单纯稳定旋转剪切；另外在20、27和29三个档位作正弦振荡剪切，对应的频率分别为0.0758、0.650、1.202 Hz，对应的最大切变率分别为3.11、26.7、49.3 s-1。剪切作用时间为1 min，剪切后立即用1%甲醛固定。10-7 M的f-MLP和10 ng/ml的TNF作用各组所选择的剪切条件、作用时间与以上相同，只有刺激剂的差异。
2.4 中性粒细胞表面粘附分子的检测
2.4.1 荧光染色 固定后的细胞悬液离心取沉淀，同时加入PE-抗CD62L和FITC-抗CD18单克隆抗体各8 μl，避光反应15～20 min。用PBS洗涤，然后制备成105～106 cell/ml悬液。
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2.4.2 流式细胞仪测定 由于分别采用PE和FITC标记单克隆抗体，可以在流式细胞仪上同时检测红色和绿色荧光，荧光强度值分别与CD62L和CD18的含量相关，因而用平均荧光强度表示细胞表面CD62L和CD18的表达量，同时，计数所检测细胞中阳性标记细胞的百分率。
2.5 结果处理
以未经受剪切作用的中性粒细胞的平均荧光强度值或阳性细胞率数值为100%，各剪切作用条件下的相应数值与之相比较，相对值用配对t检验进行统计学处理；各刺激剂作用组剪切作用后的相对值与未受剪切作用的相对值进行配对t检验。
3 结 果
3.1 稳定剪切对中性粒细胞表面粘附分子的影响
3.1.1 对CD18的影响 稳定剪切1 min后，发现CD18阳性细胞率不变仍为100%，CD18的表面表达有明显升高(P<0.05)，在51.2 s-1达到最高(P<0.01)，94.5 s-1时已有下降趋势。f-MLP或TNF作用后CD18表面表达下降，在切应力的同时作用下也有所回升。三条曲线有着大致相同的趋势(见图1)。
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图1 稳定剪切对中性粒细胞CD18表面表达的影响
Fig 1 Effects of steady shear on CD18 surface expression
of neutrophils
Compared with the value of that without shear
* P<0.05,** P<0.01
Compared with the value of that without biochemical
stimulus # P<0.05
—◆—shear —□—shear+fMLP —▲—shear+TNF
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3.1.2 对CD62L的影响 由图2和图3中可以看出，切应力作用下CD62L的阳性细胞率显著下降(P<0.01)，f-MLP和TNF也可以产生这一现象，但是，单纯力学作用对CD62L阳性细胞表面CD62L的含量没有显著影响，而刺激因子尤其是f-MLP则降低CD62L的表面表达。
图2 稳定剪切对中性粒细胞CD62L阳性细胞率的影响
Fig 2 Effects of steady shear on CD62L positive neutrophils percentage
Compared with the values of that without shear
* P<0.05, ** P<0.01
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Compared with the values of that without biochemical stimulus # P<0.05，## P<0.01
—◆—shear —□—shear+fMLP —▲—shear+TNF
图3 稳定剪切对中性粒细胞CD62L阳性细胞上CD62L含量的影响
Fig 3 Effects of steady shear on CD62L positive neutrophils' CD62L surface expression
Compared with the values of that without biochemical stimulus # P<0.05
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—◆—shear —□—shear+f-MLP —▲—shear+TNF
3.2 正弦振荡剪切对中性粒细胞表面粘附分子的影响
3.2.1 对CD18的影响 正弦振荡剪切后，中性粒细胞CD18阳性细胞率不变，仍为100%；细胞表面CD18表达也呈现上升趋势(P<0.05)，但是不同的频率下此表达有些波动。f-MLP或TNF与正弦切应力同时作用时，切应力也能在刺激因子作用下降的基础上抬升CD18含量，这一点与稳定剪切相似(见图4)。
图4 正弦振荡剪切对中性粒细胞CD18表面表达的影响
Fig 4 Effects of sinusoidal-oscillatory shear on CD18 surface expression of neutrophils
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Compared with the value of that without shear
* P<0.05,** P<0.01
Compared with the value of that without biochemical stimulus # P<0.05
—◆—shear —□—shear+f-MLP —▲—shear+TNF
3.2.2 对CD62L的影响 如图5和6所示，正弦振荡剪切后，中性粒细胞CD62L的阳性细胞率显著下降，不同频率的作用差异不显著，而对阳性细胞表面CD62L的含量没有影响。f-MLP或TNF与正弦振荡同时作用时，CD62L的阳性细胞率进一步降低，且阳性细胞上CD62L的含量也有下降。
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图5 正弦振荡剪切对中性粒细胞CD62L阳性率的影响
Fig 5 Effects of sinusoidal-oscillatory shear on CD62L positive neutrophils percentage
Compared with the values without shear
* P<0.05， ** P<0.01
Compared with the vallues without biochemical stimulus # P<0.05, ## P<0.01
—◆—shear —□—shear+f-MLP —▲—shear+TNF
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图6 正弦振荡剪切对中性粒细胞CD62L阳性细胞CD62L含的影响
Fig 6 Effects of sinusoidal-oscillatory shear on CD62L positive neutrophils' CD62L surface expression
Compared with the values of that without biochemical stimulus # P<0.05
—◆—shear —□—shear+f-MLP —▲—shear+TNF
4 讨 论
中性粒细胞在其分化成熟到衰老死亡的生命历程中，经受了多种复杂的生存环境。这一复杂性表现在两个方面，其一是生物化学环境的复杂性，无论是在骨髓储池还是在外周血液循环中，各种生物化学因子以各自的形式存在、作用于中性粒细胞周围，调节着细胞的生存状态和生理功能；其二是生物力学环境的复杂性，中性粒细胞由骨髓募集入循环，并与边缘池保持动态平衡的同时，还要根据机体需要向血管外组织迁移，发挥其抗炎杀菌功能。这些过程均涉及到细胞在动与静之间转变的问题。同时，即便是在循环血流中，由于不同部位血管形状、血流速度的差异，细胞在通过不同血管血流时也存在所受力学作用的变化[5]。这就要求中性粒细胞能够在感受这一复杂环境变化的同时，迅速作出适当的响应，以适应各种环境的转变，顺利有效地完成其功能。
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CD62L主要参与了中性粒细胞在血管内皮细胞层上的滚动过程，这是粒细胞与内皮细胞粘附的前提[3]，并且CD62L介导的滚动对流体切应力的大小有一定要求[6]。在血流中，中性粒细胞由于其体积较大、有核、变形性差、数量较红细胞少得多等因素，使之趋向于血管边缘，与内皮细胞的接触频繁，为了减少血液在血管中的流动阻力，减少中性粒细胞与内皮细胞的接触时间是一个有效的手段，这就要求CD62L与配体的交联及解交联速度相对较快，或者CD62L的量有所改变。有研究发现，中性粒细胞在流体运动中，CD62L会在滚动发生的几秒钟后即被剥落，从而显著地影响了细胞的滚动速度，限制了中性粒细胞的聚集[7]。我们的研究结果表明，CD62L在流动状态下大幅度下降，并且对一个中性粒细胞而言CD62L的脱落(shedding)几乎是完全的，即主要表现为“全或无”的形式，这就使得这一类中性粒细胞在内皮细胞附近流过时不受CD62L粘附分子的作用而滞留，因此，流动剪切是从整体上降低了中性粒细胞中CD62L阳性细胞的百分率。f-MLP和TNF均可以使CD62L阳性的细胞比率下降，这一点与已有的大量实验研究报道一致[8，9]，认为在激活因子的作用下使中性粒细胞激活，进而发生CD62L的脱落。从本文结果可以看出，与激活因子同时作用的切应力可以进一步促使CD62L脱落，在各个切变率下，不同激活因子的作用程度有一定的平行性，即可以认为是在切应力作用的基础上附加了激活因子的作用。与切应力不同的是，f-MLP等激活因子在使CD62L阳性细胞比率下降的同时，降低了阳性细胞上CD62L的含量，后一作用基本不受切应力的影响。表明两种不同类型的作用是通过不同的调节途径作用到CD62L上，产生了不同的反应方式。目前尚不明确的是，力学作用与激活因子作用使用CD62L脱落是通过什么途径完成的。也有报道认为在循环血液中，存在着CD62L低表达的一部分中性粒细胞，他们对fMLP等刺激的反应性下降，这类细胞是老龄化的中性粒细胞[10]。是否可以认为这些细胞老龄化的同时也存在受流体剪切时间长的影响，因而CD62L低表达。流动剪切使一部分中性粒细胞失去CD62L，也意味着中性粒细胞与内皮细胞相互作用的能力下降。
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从以往的研究中可知，整合素类粘附分子在中性粒细胞与内皮细胞粘附过程中的作用是比较明确的，并且已知中性粒细胞上重要的是β2类整合素，即CD18为其共有的亚基。但是在中性粒细胞激活后CD18的变化，研究报道却大不一样，有上调[8]、内吞[11]、不变等[12]多种结果，并有研究对其活性变化和亲合力改变做了深入考察[13]，力图解释各种因素造成的差异。从本研究结果来看，在切应力作用下，CD18的含量也会有显著上调，但随着切变率上升到100 s-1左右以后，可能有一个下降过程，即切变率对CD18表面表达可能有双向调节作用，这一点有待进一步确证。值得一提的是f-MLP和TNF均使CD18表面含量下调，这一结果与以往的大部分研究相左，但是也确有研究报道激活的早期，中性粒细胞表面CD18有内吞的现象[11]。本研究所采用刺激时间较短，只有一分钟，因此主要观察到CD18下调是可能的。CD18内吞后可能有将外界信号内传，从而导致细胞在激活后的一系列反应。在f-MLP或TNF作用的同时，施加切应力，发现这时的CD18表面含量在下降基础上也呈上调趋势，这就引出了几个值得探讨的问题。其一，是否在流体切应力作用下，可以通过力学的上调作用而抵消激活初期的CD18下调，从而既可以使外部信号通过内吞的CD18传入细胞，又可以使细胞表面CD18的含量保持在一个基本水平，得以保证其功能的实现；其二，在较低的切变率条件下，CD18可以在CD62L不起作用前提下独立完成中性粒细胞粘附的前两个过程——滚动和粘附[14]。这样，本研究所发现的低切变率下CD18上调，特别是在刺激因子作用后的上调是否有助于其完成粘附作用?其三，循环中老龄化的中性粒细胞中可以发现其CD18表达是上调的，尤其是在f-MLP刺激后[10]，这是否与老龄细胞受到血流剪切时间长有关?这些问题的回答目前尚无直接依据。正如CD62L的变化一样，力学作用与激活因子作用之间似乎没有直接的联系，是相互平行的两条途径完成的对CD18的调节。
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在稳定剪切和正弦振荡剪切两种不同切应力条件下，粘附分子的变化趋势是相似的。主要表现为切应力的有无与粘附分子的表面表达量和阳性细胞率有关，切应力的大小及作用方式对粘附分子的变化似乎影响不大，从而提示细胞对力学作用的感受可能只和切应力的加载与否相关，而对切应力的大小和形式不甚敏感。
通过本研究及其它实验工作的结果，可以推测力学感受器与生物化学感受器在中性粒细胞上是分立的，其下游信号传递与转导过程也可能是不同的，从而导致效应途径上的分离，使二者在细胞的整体水平上对同一个效应分子的表现进行整合。f-MLP和TNF的受体研究已有了相当程度的进展，但“力学受体”的确认尚无定论，但愿本文的工作能提供一个新的思路。
* 国家自然科学基金资助项目(39670202)
作者简介：田 卫(博士研究生，工作单位：河北省唐山市工人医院)
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(收稿日期：1998-04-06), 百拇医药